Ultraljudsdisaggregering av celler i bakterieprover
Bakterieprover föreligger sällan som verkliga encellssuspensioner. Kulturer växer i kedjor och flockar, miljöisolat bildar aggregat som hålls samman av extracellulära polymera substanser, och centrifugerade pellets är ofta svåra att resuspendera trots grundlig vortexblandning. Bestämning av antalet viabla celler, optisk densitet, flödescytometri och mikrobiomprofilering bygger alla på antagandet att en partikel motsvarar en cell. Ultraljudsdisaggregering av celler löser denna motsättning: korta, kontrollerade ultraljudspulser separerar aggregat till enskilda celler utan att lysera dem.
Varför cellaggregering äventyrar dina resultat
Aggregering är en biologisk egenskap, inte ett fel i provberedningen. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces och många arter från miljön växer i kedjor, kluster eller biofilmsfragment, och extracellulärt DNA och polysackarider klistrar samman celler i pellets och eluater från provtagningspinnar. Konsekvenserna för analysen är systematiska:
- Antalet kolonier underskattas eftersom en klump ger upphov till en koloni oavsett hur många celler den innehåller.
- Optisk densitet och partikelräknare registrerar aggregat i stället för celler, vilket snedvrider tillväxtkurvorna.
- Vid flödescytometri och cellsortering felräknas händelser som utgörs av cellklumpar och utesluts från analysen.
- DNA- och proteinextraktioner representerar endast cellerna på aggregatets yta, vilket snedvrider mikrobiom- och omikdata.
Konventionella åtgärder är långsamma, ofullständiga eller medför kemiska förändringar. Kraftig pipettering och vortexblandning lämnar kvar mikroaggregat. Enzymatisk eller kelatorbaserad dispergering förändrar den cellyta som du kanske avser att analysera. Mekanisk disaggregering genom kontrollerad kavitation verkar inom några sekunder och kräver inga tillsatser.
Ett aggregat motsvarar en koloni – och ett felaktigt resultat. Se hur ultraljudsdisaggregering ger verkliga encellssuspensioner utan lys, aerosoler eller hantering av sonder. Begär mer information!
Ultraljudsbehandlaren VialTweeter för flera rör för beröringsfri provberedning: Disaggregera cellklumpar i förslutna rör
Hur ultraljudsbehandling disaggregerar celler utan att lysera dem
Ultraljudsdisaggregering av celler utnyttjar en skillnad i mekanisk hållfasthet. Bakterieaggregat hålls samman av relativt svaga intercellulära bindningar och en extracellulär matris, medan ett intakt cellhölje tål avsevärt högre skjuvbelastning. När kalibrerat ultraljud förs in i suspensionen genererar akustisk kavitation mikroströmning, tryckpulser och skjuvkrafter som först verkar vid aggregatens gränsytor. Klumpar, kedjor och biofilmsfragment skjuvas isär (deagglomerering) innan den energinivå där membran brister (lys) uppnås.
Ultraljudsdisaggregering av bakteriecellklumpar
Disaggregering eller lys – ultraljudsparametrarnas betydelse
Den praktiska konsekvensen är att disaggregering och lys utförs med samma instrument, men med olika parameterinställningar. Vid måttlig amplitud, korta pulsade cykler och kontrollerad temperatur får du en viabel encellssuspension. Om amplituden, exponeringstiden eller provtemperaturen höjs förskjuts processen mot fullständig cellsönderdelning för att komma åt intracellulära mål. Med Hielscher-generatorer kan du ställa in amplitud, effekt, puls och energitillförsel exakt och spara metoden, så att disaggregeringssteget är reproducerbart mellan prover, operatörer och körningar.
Effektiv beröringsfri ultraljudsbehandling
Ultraljudsbehandling i bad kan inte ge samma kontroll. Ultraljudsrengöringsbad och ultraljudstankar tillför endast låg ultraljudsenergi, vilket leder till ofullständig provberedning, och kavitationen uppstår ojämnt, så varje rör behandlas utifrån sin placering i badet. VialTweeter överför intensiva, fokuserade ultraljudskrafter direkt genom kärlväggen till upp till 10 förslutna prover samtidigt. Behandlingar som kräver lång, varierande exponering i ett bad slutförs med ett standardiserat pulsmönster.
Hielschers beröringsfria ultraljudsapparater tillför intensivt, fokuserat ultraljud genom väggarna på slutna provflaskor. VialTweeter behandlar upp till 10 provflaskor samtidigt med identisk intensitet, utan sond i provet, utan korskontaminering och utan aerosolutsläpp. När provgenomströmningen kräver det överför mikroplattultraljudsapparaterna UIP400MTP och UIP550MTP samma kontrollerade energiöverföring till flerbrunnsplattor.
VialTweeter ultraljudsbehandlar upp till 10 mindre provflaskor och upp till 5 större provrör samtidigt.
Fördelar med beröringsfri celldisaggregering med ultraljud
- Ingen korskontaminering: Eftersom provflaskorna förblir slutna hela tiden och ingen sond sänks ned i provet undviks korskontaminering och provförlust helt. Det finns inget som behöver steriliseras mellan proverna, och en körning kan inte påverka nästa.
- Skydd mot aerosoler: Ultraljudsbehandling med sond i öppna kärl genererar smittsamma aerosoler och kontaminerar instrumentytor. Vid ultraljudsbehandling i förslutna provflaskor hålls provet inneslutet i sitt eget rör, vilket har betydelse vid hantering av patogena bakterier som Mycobacterium tuberculosis och andra smittämnen i BSL-2 eller BSL-3.
- Ingen spetserosion: Titansonder kan avge en liten mängd mikropartiklar till provet under drift. Dessa partiklar förändrar den optiska densiteten och partikelantalet vid efterföljande mätningar. Indirekt ultraljudsbehandling genom kärlväggen eliminerar denna källa till fasta partiklar helt.
- Enhetlig provgenomströmning: VialTweeter tillför samma ultraljudsintensitet till var och en av upp till 10 provflaskor, så resultaten av ultraljudsbehandlingen blir jämna och reproducerbara. De positionseffekter som orsakar problem i bad och vid sondbehandling av enskilda prover försvinner, och baslinjerna förblir jämförbara mellan replikat.
- Provintegritet: Rören förblir slutna under hela behandlingen, så provet kan inte kontamineras, förstöras eller förflyktigas. Små volymer kan behandlas utan spädning, inklusive värdefulla kliniska pelletar som inte tål ett extra överföringssteg.
- Processkontroll: Amplituden kan ställas in från 20 till 100%, pulsläget från 0 till 100%, och systemen stöder temperaturövervakning så att värmekänsliga stammar och proteiner hålls under skadliga tröskelvärden.
Typiska tillämpningar
- Analys av mikrobiom och tarminnehåll: dispergering av Lactobacillus, Bifidobacterium och avföringsprover före utplattning eller sekvensering, så att klumpar inte ger för låga cellantal.
- Livsmedels- och vattenmikrobiologi: disaggregering av flockar i pinnprover, sköljvätskor och anrikningsbuljonger för noggrann bestämning av koloniantal och viabilitet.
- Biofilmsforskning: insamling av celler från bärare och ytor som encellssuspensioner, utan enzymatisk behandling som skulle avlägsna ytproteiner.
- Klinisk diagnostik: resuspendering av sputum, var och eluat från provtagningspinnar under inneslutningsförhållanden.
- Cellodling: separering av hopklumpade aggregat av däggdjursceller, insektsceller och CHO-celler före räkning och passagering.
- Provberedning genom hela arbetsflödet: samma instrument som disaggregerar vid låg amplitud utför fullständig cellupplösning vid högre inställningar, så att lys, proteinextraktion och DNA-fragmentering kan följa utan överföring mellan rör.
Ultraljudsapparat för flerbrunnsplattor UIP400MTP för deagglomerering av cellklumpar med hög provgenomströmning
Mikroplattultraljudsapparaterna UIP400MTP och UIP550MTP behandlar även rörställ, utöver flerbrunnsplattor.
Hitta rätt ultraljudsapparat för ditt arbetsflöde för disaggregering
VialTweeter ultraljudsapparat för flera rör
Förstahandsmetoden för steril disaggregering i förslutna provflaskor. VialTweeter drivs av ultraljudsprocessorn UP200St på 200 watt vid 26 kHz med automatisk avstämning och överför ultraljud indirekt genom väggarna i upp till 10 förslutna provflaskor samtidigt, med upp till 10 W per provrör, för jämna och reproducerbara resultat utan korskontaminering eller provförlust. VialTweeter-sonotroden av titan är autoklaverbar, och amplitud- och pulsinställningarna kan justeras och sparas, vilket ger det reglerområde som ett deagglomereringsprotokoll behöver. Standardsonotroden med 10 positioner kan användas med provflaskor för automatiska provtagare, mikrocentrifugrör och Eppendorf- eller Nunc-rör på 1 till 5 mL. Klämanordningen VialPress hanterar upp till 5 större kärl med en diameter på upp till 20 mm.
Särskilda VialTweeter-modeller för enstaka rör finns för Falcon-rör och för enstaka provflaskor med anpassning till kärlets storlek. Demontera blocksonotroden så fungerar UP200St-basenheten som en konventionell ultraljudsapparat med sond för direkt behandling av små till medelstora prover.
Ultraljudsapparater för mikroplattor
Skala upp till provberedning med hög provgenomströmning genom ultraljudsbehandling av flerbrunnsplattor: För plattbaserade arbetsflöden utökar ultraljudsapparaterna för mikroplattor UIP400MTP och UIP550MTP den kontaktfria, enhetliga ultraljudsbehandlingen från tio provrör till en hel platta.
UIP400MTP på 400 watt behandlar standardmikrotiterplattor och standardflerbrunnsplattor, inklusive format med 96 brunnar, med exakt styrning av amplitud, effekt och pulsering samt timer, temperatursond och vattenbadskylning. Lossning av biofilm och bearbetning av bakteriekulturer är etablerade tillämpningar för ultraljudsapparaten för mikroplattor UIP400MTP.
UIP550MTP på 550 watt är det kraftfullare alternativet – idealiskt för mer krävande tillämpningar.
Båda systemen för kontaktfri ultraljudsbehandling bearbetar tillförlitligt plattor med 6, 12, 24, 48, 96 och 384 brunnar samt provrörsställ och petriskålar. Hielschers ultraljudsapparater för mikroplattor fungerar med alla standardplattor, vilket gör att dyra tillverkarspecifika förbrukningsartiklar kan undvikas. Med programmerbara temperaturgränser pausas ultraljudsbehandlingen automatiskt vid den maximala provtemperaturen och återupptas efter kylning, vilket skyddar viabiliteten under upprepade cykler. Smart och tillförlitlig provberedning med hög provgenomströmning för repeterbara resultat.
Tabellen nedan ger dig en översikt över den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater för laboratorieprover som används inom livsvetenskaper, genomik, proteomik och diagnostik:
| Rekommenderade apparater | Satsvolym | Flödeshastighet |
|---|---|---|
| VialTweeter ultraljudsapparat för flera provrör | provflaskor på 0,5 till 1,5mL | n.a. |
| UIP400MTP ultraljudsapparat för flerbrunnsplattor (440 watt) | flerbrunnsplattor / mikrotiterplattor | n.a. |
| UIP550MTP ultraljudsapparat för flerbrunnsplattor (550 watt) | flerbrunnsplattor / mikrotiterplattor | n.a. |
| Ultraljudsapparaten CupHorn | CupHorn för provflaskor eller bägare | n.a. |
| UP100H ultraljudsapparat med sond på 100 watt | 1 till 500mL | 10 till 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St ultraljudsmodeller med sond på 200 watt | 10 till 1000mL | 20 till 200mL/min |
| UP400St ultraljudsapparat med sond på 400 watt | 10 till 2000mL | 20 till 400mL/min |
| GDmini2 | steril ultraljudsreaktor för mikroflöden | n.a. |
| Ultraljudssiktskakare | n.a. | n.a. |
Vanliga frågor om disaggregering av celler med ultraljud
Vad är skillnaden mellan celldisaggregering och cellys?
Disaggregering, även kallad deagglomerering, separerar hopklumpade celler till en encellssuspension samtidigt som cellerna förblir intakta och viabla. Lys bryter sönder cellhöljet och frigör intracellulärt innehåll. Båda drivs av skjuvkrafter från kavitation, och skillnaden ligger i energitillförseln. Med optimerade inställningar för amplitud, puls och temperatur åstadkommer ultraljudsbehandling disaggregering under lyströskeln.
Varför är ultraljudsbad inte lämpliga för standardiserad disaggregering?
Ultraljudsbad tillför endast låg ultraljudsenergi, vilket leder till ofullständig provberedning, och kavitationen utvecklas mycket ojämnt i badet, så varje prov får olika behandling beroende på sin placering. Mikrobiologiska räkningar och jämförande studier är beroende av jämförbarhet. Beröringsfria ultraljudsapparater som VialTweeter för flera rör samt ultraljudsapparaterna för mikroplattor UIP400MTP och UIP550MTP behandlar alla kärl under anpassade ultraljudsförhållanden, vilket förbättrar reproducerbarheten mellan replikat.
Kan ultraljudsbehandling skada cellerna?
Ja, om parametrarna inte kontrolleras. Alltför kraftig ultraljudsbehandling eller okontrollerad uppvärmning kan skada cellerna, och frisatt DNA gör proverna viskösa och främjar återaggregering. Därför bör processen utvecklas omsorgsfullt: måttlig amplitud, pulsade cykler, kylning och instrument med temperaturbegränsning håller behandlingen på den sida av kurvan där disaggregering sker.
Alla digitala ultraljudsapparater från Hielscher erbjuder exakt reglerbara parametrar, anslutningsbara temperatursensorer, programmerbara inställningar och automatisk dataloggning för tillförlitlig provberedning.
Behöver provet överföras till ett annat kärl?
Nej. Provrör och plattor behandlas i sina ursprungliga, slutna behållare. Indirekt ultraljudsbehandling undviker både överföringsförluster och den överföring av provrester som är förknippad med sondhantering.
Vilka provrörsformat kan VialTweeter behandla?
Standardsonotroden med 10 positioner rymmer provflaskor för automatiska provtagare, mikrocentrifugrör och Eppendorf- eller Nunc-rör på 1 till 5 mL. Tillbehöret VialPress rymmer upp till 5 större kärl med en diameter på upp till 20 mm. Särskilda VialTweeter-modeller för ett enda rör finns för Falcon-rör och för kundanpassade format för enstaka provrör eller större kärl.
Kan jag disaggregera och lysera med ett och samma instrument?
Ja. Samma utrustning som disaggregerar vid måttlig amplitud utför fullständig cellsönderdelning vid högre amplitud och längre exponering, så framställning av en encellssuspension och efterföljande extraktion kan utföras i följd utan byte av plattform.
Används ultraljudsbehandling i MBEC-analyser?
Ultraljudsbehandling är ett etablerat och i stor utsträckning standardmässigt moment. I MBEC-analysen med stiftlock odlas biofilmer på polystyrenstift och exponeras för antibiotika. Därefter överförs stiften till färskt medium och utsätts för vortexblandning och ultraljudsbehandling för att lossa och disaggregera vidhäftande biofilmsceller till en planktonisk suspension före seriespädning och bestämning av antalet viabla celler (MBEC avläses som den lägsta koncentration som minskar antalet återvunna viabla celler med ≥3 log10 jämfört med obehandlad biofilm). Ultraljudsbehandling förbättrar dispergeringskvaliteten avsevärt: ofullständig frisättning av inbäddade celler från EPS-matrisen leder till att eradikeringen underskattas och MBEC-värdena blir för höga. Riktad ultraljudsbehandling av brunnarna för stifthållare i analysplattorna med ultraljudsapparaten för mikroplattor UIP400MTP övervinner de traditionella svagheterna med ultraljudsbad – nämligen ojämn energifördelning, uppvärmning och risk för aerosoler/korskontaminering.
Läs om hur den beröringsfria ultraljudsapparaten för mikroplattor UIP400MTP underlättar MBEC-analyser!
Används ultraljudsbehandling i MIC-analyser?
Ultraljudsbehandling används i olika arbetsflöden med anknytning till MIC för att förbättra effektiviteten och reproducerbarheten:
- mykobakteriologi, där sputum och andra viskösa prover rutinmässigt dekontamineras och homogeniseras, ibland med ultraljudsbehandling, före känslighetsbestämning, och där kortvarig dispergering av klumpbildande mykobakterieinokulat bidrar till korrekta MIC-värden;
- organismer som lätt bildar aggregat (t.ex. streptokocker och stafylokocker i pellets), där mikroaggregat förvränger inokulumtätheten; och
- kombinerad diagnostik såsom odling av vätska från ultraljudsbehandling av implantat följd av känslighetsbestämning vid protesledsinfektion (en tillämpning som liknar MBEC, snarare än klassisk MIC).
Litteratur / Referenser
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Välj din egen platta! Ultraljudsapparaten för mikroplattor UIP550MTP disaggregerar bakterieprover i vilken standardplatta med flera brunnar som helst.
Hielschers modeller av ultraljudsapparater för flera prover UIP400MTP för mikroplattor, VialTweeter och CupHorn: provberedning med hög hastighet och hög provgenomströmning