Ultraljudsbaserad celluppbrytning av bakterieprover
Bakterieprover anländer sällan som äkta encellssuspensioner. Odlingar växer i kedjor och flockar, miljöisolat bildar aggregat som hålls samman av extracellulära polymera substanser, och centrifugerade sediment är ofta svåra att resuspendera trots noggrann vortexning. Mätningar av livsdugliga celler, optisk densitet, flödescytometri och mikrobiomprofilering utgår alla från att en partikel motsvarar en cell. Ultraljudsdisaggregering av celler löser denna konflikt: korta, kontrollerade ultraljudspulser separerar aggregaten till enskilda celler utan att lysera dem.
Varför cellaggregation påverkar dina resultat negativt
Aggregering är ett biologiskt fenomen, inte ett fel i provberedningen. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces och många miljöbakterier växer i kedjor, kluster eller biofilmfragment, och extracellulärt DNA och polysackarider binder samman cellerna i pelletar och i eluat från provpinnar. De analytiska konsekvenserna är systematiska:
- Antalet kolonier underskattas, eftersom en klump räknas som en koloni oavsett hur många celler den består av.
- Optisk densitet och partikelräknare mäter aggregat istället för celler, vilket ger en snedvridning av tillväxtkurvorna.
- Vid flödescytometri och cellsortering räknas klumpbildningar inte med och utesluts från analysen.
- DNA- och proteinextraktionerna omfattar endast cellerna på aggregatets yta, vilket ger en skev bild av mikrobiom- och omikdata.
Konventionella metoder är långsamma, ofullständiga eller medför kemiska förändringar. Kraftig pipettering och vortexning lämnar kvar mikroaggregat. Enzymatisk eller kelatorbaserad dispersion förändrar den cellyta som man avser att analysera. Mekanisk upplösning genom kontrollerad kavitation verkar inom några sekunder och kräver inga tillsatser.
En aggregerad enhet motsvarar en koloni – och ett felaktigt resultat. Se hur ultraljudsdisaggregering ger äkta encellssuspensioner utan celllys, aerosoler eller hantering av prober. Begär mer information!
Multi-Tube Sonicator VialTweeter För beredning av prover utan fysisk kontakt: Bryt upp cellklumpar i förseglade rör
Hur ultraljudsbehandling bryter upp celler utan att lyserera dem
Vid ultraljudsdisaggregering utnyttjas skillnaden i mekanisk hållfasthet. Bakterieaggregat hålls samman av relativt svaga intercellulära bindningar och en extracellulär matris, medan ett intakt cellhölje tål betydligt högre skjuvspänning. När kalibrerad ultraljudstrålning tränger in i suspensionen genererar akustisk kavitation mikroströmmar, tryckpulser och skjuvkrafter som först verkar vid aggregatens gränsytor. Klumpar, kedjor och biofilmfragment skjuvs isär (deagglomerering) innan den energinivå nås vid vilken membranen brister (lysis).
Ultraljudsupplösning av bakterieklumpar
Uppdelning eller lysering – Varför ultraljudsparametrarna är viktiga
Den praktiska konsekvensen är att disaggregation och lysering utförs med samma instrument men med olika inställningar. Vid måttlig amplitud, korta pulscykler och kontrollerad temperatur erhålls en livsduglig encellsuspension. Genom att öka amplituden, exponeringstiden eller provtemperaturen förskjuts processen mot fullständig cellnedbrytning för intracellulära mål. Med Hielschers generatorer kan man ställa in amplitud, effekt, puls och energitillförsel exakt och spara metoden, vilket gör att disaggregeringssteget blir reproducerbart mellan olika prover, operatörer och körningar.
Effektiv beröringsfri ultraljudsbehandling
Ultraljudsbehandling i bad kan inte mäta sig med denna kontroll. Ultraljudsrengöringsbad och -tankar tillför endast låg ultraljudsenergi, vilket leder till ofullständig förberedelse, och kavitationen sker ojämnt, vilket innebär att varje rör behandlas beroende på sin placering i badet. VialTweeter överför intensiva, fokuserade ultraljudskrafter direkt genom kärlväggen till upp till 10 förseglade prover samtidigt. Behandlingar som kräver lång, varierande exponering i ett bad genomförs enligt ett standardiserat pulsmönster.
Hielschers beröringsfria ultraljudsenheter tillför intensivt, fokuserat ultraljud genom väggarna på slutna provrör. VialTweeter bearbetar upp till 10 provrör samtidigt med identisk intensitet, utan sond i provet, utan korskontaminering och utan utsläpp av aerosoler. När genomströmningen kräver det utökar mikroplattsonikatorerna UIP400MTP och UIP550MTP samma kontrollerade energiöverföring till flerhålsplattor.
Den VialTweeter sonikerar upp till 10 mindre flaskor och upp till 5 större provrör samtidigt.
Fördelar med beröringsfri ultraljudsdisaggregering
- Ingen korskontaminering: Eftersom provrören förblir permanent förslutna och ingen sond sänks ned i provet undviks korskontaminering och provförlust helt. Det finns inget som behöver steriliseras mellan provtagningarna, och en analys kan inte påverka nästa.
- Skydd mot aerosoler: Ultraljudsbehandling med öppen sond ger upphov till smittsamma aerosoler och förorenar instrumentytorna. Vid ultraljudsbehandling i förseglade provrör hålls provet inneslutet i sitt eget rör, vilket är viktigt vid hantering av patogena bakterier såsom Mycobacterium tuberculosis och andra BSL-2- eller BSL-3-agenser.
- Ingen minskning av dricks: Titanprober kan under drift avge en liten mängd mikropartiklar till provet. Dessa partiklar påverkar den optiska densiteten och partikelantalet nedströms. Indirekt ultraljudsbehandling genom kärlväggen eliminerar denna källa till fasta partiklar helt.
- Jämn genomströmning: VialTweeter levererar samma ultraljudsintensitet till vart och ett av upp till 10 provrör, vilket gör att ultraljudsbehandlingen blir jämn och reproducerbar. Positionseffekter som ofta är ett problem vid användning av ultraljudsbad och sondering av enstaka prover försvinner, och dina baslinjer förblir jämförbara mellan olika replikat.
- Provets integritet: Rören förblir stängda under hela bearbetningen, vilket innebär att provet inte kan kontamineras, förstöras eller avdunsta. Små volymer kan hanteras utan utspädning, inklusive värdefulla kliniska pellets där man inte har råd med ett extra överföringssteg.
- Processtyrning: Amplituden kan ställas in mellan 20 och 100 %, pulsläget mellan 0 och 100 %, och systemen har stöd för temperaturövervakning så att värmekänsliga stammar och proteiner hålls under skadliga tröskelvärden.
Typiska tillämpningar
- Analys av mikrobiomet och tarminnehållet: sprid ut Lactobacillus, Bifidobacterium och avföringsprover innan de läggs på odlingsplattor eller sekvenseras, så att antalet bakterier inte underskattas på grund av klumpar.
- Mikrobiologi inom livsmedel och vatten: upplösning av flockar i svabbprover, sköljvätskor och anrikningsbuljonger för noggrann bestämning av kolonier och livsduglighet.
- Biofilmforskning: utvinning av celler från bärare och ytor i form av encellssuspensioner, utan enzymatisk behandling som skulle avlägsna ytproteiner.
- Klinisk diagnostik: omsuspendering av slem, var och utdrag från svabbprover under inneslutningsförhållanden.
- Cellodling: separering av klumpar av däggdjurs-, insekts- och CHO-aggregat före räkning och passering.
- Förberedelse av hela arbetsflödet: samma instrument som separerar vid låg amplitud utför fullständig cellnedbrytning vid högre inställningar, vilket innebär att lysering, proteinextraktion och DNA-fragmentering kan ske utan att proverna behöver flyttas mellan rör.
Sonikator för plattor med flera brunnar UIP400MTP för deagglomerering av cellklumpar med hög genomströmning
Modellerna UIP400MTP och UIP550MTP är inte bara avsedda för plattor med flera brunnar, utan kan även användas för att bearbeta rörställ.
Hitta rätt ultraljudsapparat för din uppbrytningsprocess
VialTweeter Multi-Tube Ultraljudsapparat
Den bästa metoden för upplösning av innehållet i sterila, förseglade ampuller. Drivs av en 200-watts UP200St-processor på 26 kHz med automatisk inställning, sänder VialTweeter ultraljud indirekt genom väggarna på upp till 10 slutna ampuller samtidigt, med upp till 10 W per ampull, för jämna och reproducerbara resultat utan korskontaminering och utan provförlust. VialTweeter-sonotroden i titan är autoklaverbar, och amplitud och puls är justerbara och kan sparas, vilket utgör det regleringsområde som krävs för ett deagglomereringsprotokoll. Standardsonotroden med 10 positioner är kompatibel med ampuller för autosamplare, mikrocentrifugrör samt Eppendorf- eller Nunc-rör på 1 till 5 ml. Klämanordningen VialPress hanterar upp till 5 större behållare med en diameter på upp till 20 mm.
Det finns särskilda VialTweeter-modeller med ett rör för Falcon-rör och för enskilda provrör som anpassats efter kärlets storlek. Om man demonterar blocksonotroden fungerar UP200St-huvudenheten som en konventionell sondultraljudsapparat för direkt behandling av små till medelstora prover.
Ultraljudsapparater för mikroplattor
Skala upp till provberedning med hög genomströmning genom ultraljudsbehandling av flerhålsplattor: För plattbaserade arbetsflöden utökar mikroplattsonikatorerna UIP400MTP och UIP550MTP den beröringsfria, enhetliga ultraljudsbehandlingen från tio rör till en hel platta.
UIP400MTP på 400 watt är avsedd för standardmikrotiterplattor och flerbrunnsplattor, inklusive 96-brunnsformat, och erbjuder precis styrning av amplitud, effekt och pulsering samt timer, temperaturgivare och vattenbadskylning. Avlägsnande av biofilm och bearbetning av bakteriekulturer är etablerade tillämpningar för mikroplattsonikatorn UIP400MTP.
UIP550MTP på 550 watt är det kraftfullare alternativet – perfekt för mer krävande användningsområden.
Båda de beröringsfria ultraljudssystemen hanterar på ett tillförlitligt sätt plattor med 6, 12, 24, 48, 96 och 384 brunnar samt rörställ och petriskålar. Hielschers ultraljudsbehandlare för mikroplattor fungerar med alla standardplattor, vilket gör att man slipper dyra tillverkarspecifika förbrukningsartiklar. Tack vare programmerbara temperaturgränser avbryts ultraljudsbehandlingen automatiskt vid den maximala provtemperaturen och återupptas efter avkylning, vilket säkerställer provens livskraft vid upprepade cykler. Smart och pålitlig provberedning med hög genomströmning för reproducerbara resultat.
Tabellen nedan ger dig en översikt över den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater för laboratorieprover som används inom biovetenskap, genomik, proteomik och diagnostik:
| Rekommenderade enheter | Batchvolym | Flöde |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Ultraljudsapparat | 0ampuller på 0,5–1,5 ml | N.A. |
| UIP400MTP ultraljudsapparat för flerhålsplattor (440 watt) | Multi-brunnar / mikrotiterplattor | N.A. |
| UIP550MTP ultraljudsapparat för flerhålsplattor (550 watt) | Multi-brunnar / mikrotiterplattor | N.A. |
| Ultraljud CupHorn | CupHorn för ampuller eller bägare | N.A. |
| UP100H, 100 watt, ultraljudsapparat av sondtyp | 1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St Ultraljudsapparater av sondtyp på 200 watt | 10 till 1000 ml | 20 till 200 ml/min |
| UP400St, 400 watt ultraljudsapparat av sondtyp | 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min |
| GDmini2 | steril ultraljudsreaktor för mikrofödo | N.A. |
| Ultraljud Sikt Shaker | N.A. | N.A. |
Vanliga frågor om celldisaggregering med ultraljud
Vad är skillnaden mellan cellupplösning och celllys?
Disaggregering, även kallad deagglomerering, separerar klumpade celler till en suspension av enskilda celler samtidigt som cellerna förblir intakta och livsdugliga. Lysering bryter upp cellhöljet och frigör det intracellulära innehållet. Båda processerna drivs av kavitationsskjuvning, och skillnaden ligger i energitillförseln. Med optimerade inställningar för amplitud, puls och temperatur uppnår ultraljudsbehandling disaggregering under lyseringströskeln.
Varför är ultraljudsbad inte lämpliga för standardiserad upplösning?
Bad ger endast låg ultraljudsenergi, vilket leder till ofullständig bearbetning, och kavitationen utvecklas mycket ojämnt i tanken, vilket innebär att varje prov behandlas olika beroende på dess placering. Mikrobiologiska räkningar och jämförande studier är beroende av jämförbarhet. Beröringsfria ultraljudsapparater, såsom Multi-Tube Sonicator VialTweeter samt mikroplattsonikatormodellerna UIP400MTP och UIP550MTP, bearbetar alla behållare under anpassade ultraljudsförhållanden, vilket förbättrar reproducerbarheten mellan replikaterna.
Kan ultraljudsbehandling skada cellerna?
Ja, om parametrarna inte kontrolleras. Överdriven ultraljudsbehandling eller okontrollerad uppvärmning kan skada cellerna, och frigjort DNA gör proverna viskösa och främjar återaggregering. Därför bör processen utformas noggrant: måttlig amplitud, pulsade cykler, kylning och instrument med temperaturbegränsning ser till att behandlingen hålls på den del av kurvan där cellerna bryts ned.
Alla digitala ultraljudsenheter från Hielscher erbjuder exakt reglerbara parametrar, anslutningsbara temperaturgivare, programmerbara inställningar och automatisk dataloggning för tillförlitlig provberedning.
Måste provet överföras till ett annat kärl?
Nej. Provrör och plattor behandlas i sina ursprungliga, förslutna behållare. Indirekt ultraljudsbehandling förhindrar både förluster vid överföring och överföring av material som uppstår vid hantering av sonden.
Vilka typer av ampuller kan VialTweeter hantera?
Standardsonotroden med 10 positioner är anpassad för flaskor till automatisk provtagare, mikrocentrifugrör samt Eppendorf- eller Nunc-rör med volym mellan 1 och 5 ml. Tillbehöret VialPress rymmer upp till 5 större behållare med en diameter på upp till 20 mm. Särskilda VialTweeter-modeller för enstaka rör finns tillgängliga för Falcon-rör samt för anpassade format med enstaka rör eller större format.
Kan jag separera och lysera med en och samma apparat?
Ja. Samma uppställning som utför deaggregering vid måttlig amplitud åstadkommer fullständig celluppbrytning vid högre amplitud och längre exponeringstid, vilket innebär att framställningen av enskilda celler i suspension och den efterföljande extraktionen kan genomföras i följd utan att man behöver byta plattform.
Används ultraljud i MBEC-analyser?
Ultraljudsbehandling är en etablerad och i stort sett standardiserad del av metoden. I MBEC-analysen med peg-lid odlas biofilmer på polystyrenpinnar och utsätts för antibiotika, varefter pinnarna överförs till färskt medium och utsätts för vortexning samt ultraljudsbehandling för att lossa och bryta upp vidhäftande biofilmceller till en planktonisk suspension före seriedilution och bestämning av antalet livsdugliga celler (MBEC avläses som den lägsta koncentrationen som minskar antalet återvunna celler med ≥3 log10 jämfört med obehandlad biofilm). Ultraljudsbehandling förbättrar dispersionskvaliteten avsevärt: ofullständig frigöring av inbäddade celler från EPS-matrisen underskattar utrotningen och överdriver MBEC-värdena. Den riktade ultraljudsbehandlingen av brunnarna med PEG-hållare på analysplattorna med mikroplattultraljudsapparaten UIP400MTP övervinner de traditionella svagheterna hos badultraljudsbehandling – nämligen ojämn energifördelning, uppvärmning samt risk för aerosolbildning och korskontaminering.
Läs mer om hur den kontaktlösa mikroplattsonikatorn UIP400MTP underlättar MBEC-analyser!
Används ultraljud i MIC-bestämningar?
Ultraljudsbehandling används i olika arbetsflöden i anslutning till MIC för att förbättra effektiviteten och reproducerbarheten:
- mykobakteriologi, där sputum och andra viskösa prover rutinmässigt dekontamineras och homogeniseras, ibland med ultraljudsbehandling, före känslighetsbestämning, och där klumpbildande mykobakteriella inokulum gynnas av en kortvarig dispersion för att uppnå exakta MIC-värden;
- organismer som lätt bildar aggregat (t.ex. streptokocker och stafylokocker i pellets), där mikroaggregat snedvrider inokulumtätheten; och
- kombinerade diagnostiska metoder, såsom ultraljudsundersökning av implantat och vätskekultur följt av känslighetsbestämning vid protesinfektion (en tillämpning av typen MBEC, inte klassisk MIC).
Litteratur / Referenser
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Välj din egen tallrik! Mikroplattsonikatorn UIP550MTP separerar bakterieprover i vilken standardplatta med flera brunnar som helst.
Hielscher Multi-Sample Sonicator modeller UIP400MTP för mikroplattor, VialTweeter och Kopparhorn: provberedning med hög hastighet och hög genomströmning