Protokoll för MBEC-analys med ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor

MBEC-analysen används för att bestämma den koncentration av antimikrobiella medel som behövs för att eliminera biofilmer som bildats på stiftlock. För att bedöma biofilmernas viabilitet måste biofilmerna först lossas från stiftlocken på en 96-brunnsplatta. Ultraljudsbehandling är den mest tillförlitliga och effektiva metoden för denna lösgöring. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor är särskilt utformad för att behandla analysplattor med maximal effektivitet och användarvänlighet, vilket effektiviserar och påskyndar MBEC-analyser med hög provgenomströmning.

Ultraljudsbehandling för lösgöring av biofilm

Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i analyser av minsta biofilmeradikerande koncentration (MBEC), eftersom den möjliggör effektiv lösgöring av biofilmsceller från ytan där de sitter fast. Biofilmer är till sin natur strukturerade samhällen av mikroorganismer inneslutna i en extracellulär matris, vilket gör dem betydligt mer motståndskraftiga mot antimikrobiella medel än planktoniska celler. Vid MBEC-analyser används ultraljudsvågor för att skapa kontrollerad kavitation, som bryter upp biofilmsmatrisen och frigör inbäddade celler till en suspension. Detta steg säkerställer att biofilmscellerna fördelas jämnt i återhämtningsmediet, vilket underlättar noggranna viabilitetsbedömningar genom utplattning, spädning eller spektrofotometriska metoder. Om biofilmen inte lossas ordentligt kan kvarvarande matriskomponenter skydda cellerna, vilket kan leda till att de antimikrobiella medlens effekt underskattas. Därför är ultraljudsbehandling oumbärlig för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara MBEC-värden som återspeglar de testade medlens verkliga eradikeringsförmåga. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor möjliggör enkel provberedning med hög provgenomströmning i analysplattor.

Analysprotokoll för minsta biofilmeradikerande koncentration (MBEC)

Steg 1: Biofilmsbildning

1. Förbered bakteriesuspensionen:
   Odla bakterier i lämpliga medier tills de befinner sig i logaritmisk tillväxtfas.
   Späd bakteriekulturen till en definierad optisk densitet (t.ex. OD600 ~0,1).
2. Inokulera 96-brunnsplattan:
   Tillsätt bakteriesuspensionen (t.ex. 150–200 µL) i varje brunn i en standardmikrotiterplatta med 96 brunnar.
3. Sätt på stiftlocket:
   Placera stiftlocket på den inokulerade plattan så att biofilm kan bildas på stiftens ytor.
4. Inkubera plattan:
   Inkubera uppställningen vid lämplig temperatur (t.ex. 37°C) i 24–48 timmar utan skakning för att främja biofilmstillväxt.

Steg 2: Behandling med antimikrobiella medel

• Förbered antimikrobiella lösningar:
  Förbered en serie koncentrationer av antimikrobiella medel i färska medier.
  Exponera biofilmerna för antimikrobiella medel:
  Ta bort stiftlocket från bakteriekulturen och skölj det i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna planktoniska celler.
  Placera stiftlocket i en ny 96-brunnsplatta som innehåller de antimikrobiella lösningarna.
• Inkubera plattan:
  Inkubera under en definierad tidsperiod (t.ex. 24 timmar) för att låta de antimikrobiella medlen verka.

Steg 3: Ultraljudsbehandling med ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor

Ultraljudssteget är avgörande för att lossa biofilmer från stiftlocken så att viabiliteten kan bedömas. Följ dessa steg för ultraljudsapparaten UIP400MTP:

1. Förbered uppställningen:
   Fyll varje brunn i en ny 96-brunnsplatta med återhämtningsmedium (t.ex. neutraliserande buljong eller färskt odlingsmedium).
2. Flytta stiftlocket:
   Ta bort stiftlocket från plattan för antimikrobiell behandling.
   Skölj stiftlocket i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna kvarvarande antimikrobiella medel.
3. Placera plattan och ultraljudsapparaten:
   Sätt stiftlocket på plattan med återhämtningsmedium.
   Placera plattan med återhämtningsmedium på ultraljudsapparaten UIP400MTP:s plattform och se till att plattan är centrerad och står stabilt.
4. Justera ultraljudsparametrarna:
   Ställ in ultraljudsparametrarna på UIP400MTP (inställningarna kan anpassas till biofilmen):
   Amplitud: 70–100%.
   Ultraljudsbehandlingstid: 1–3 minuter (anpassa efter biofilmens motståndskraft) i cykelläge.
5. Ultraljudsbehandla:
   Starta ultraljudsbehandlingen. Ultraljudsvibrationerna lossar biofilmerna från stiftens ytor så att de hamnar i återhämtningsmediet.
6. Övervaka processen:
   Använd den anslutningsbara temperatursensorn för att övervaka provtemperaturen i brunnarna. UIP400MTP kan anslutas till en laboratoriekylare för kylning.
7. Hantering efter ultraljudsbehandling:
   Överför omedelbart återhämtningsmediet (som nu innehåller lossade biofilmer) till en ny steril platta för efterföljande analys.

(A) Platta med TSB med 2% glukos som används för biofilmsbildning, återvinning av celler och
bestämning av MIC och MBCB; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer. bestämning av MIC och MBCB; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer.
Biofilmscellerna som bildats på stiften lossades genom ultraljudsbehandling (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 min i 96-brunnsplattor med färskt odlingsmedium för återvinning av cellerna.
(Bild och studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Steg 4: Viabilitetsbedömning

Platta ut och odla lossade biofilmer:

1. Gör seriespädningar av återhämtningsmediet och platta ut på agar för att räkna kolonibildande enheter (CFU).
   Använd alternativt en kolorimetrisk eller fluorescensbaserad viabilitetsanalys.
2. Registrera resultaten:
   Bestäm MBEC som den lägsta koncentrationen av ett antimikrobiellt medel som eliminerade all detekterbar viabilitet i biofilmen.

Konstruktion, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielschers ultraljudsapparater är välkända för sina högsta standarder inom kvalitet och konstruktion. Robusthet och enkel användning gör att våra ultraljudsapparater smidigt kan integreras i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsapparater klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och hög användarvänlighet. Hielschers ultraljudsapparater är självklart CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Läs här hur UIP400MTP används för att lossa biofilm som ett provberedningssteg i ASTM E2799-protokollet för att testa desinfektionsmedels effekt mot biofilm av Pseudomonas aeruginosa med hjälp av MBEC-analysen.