MBEC-analysprotokoll med hjälp av 96-brunnars Plate Sonicator UIP400MTP

MBEC-analysen används för att bestämma koncentrationen av antimikrobiella medel som behövs för att eliminera biofilmer som bildas på pinnlock. För att bedöma biofilmens livskraft måste biofilmerna först lossas från pinnlocken på en platta med 96 brunnar. Ultraljudsbehandling är den mest pålitliga och effektiva metoden för denna avskiljning. Multi-well plate sonicator UIP400MTP är speciellt utformad för att bearbeta analysplattor med maximal effektivitet och bekvämlighet, effektivisera och påskynda MBEC-analyser med hög genomströmning.

Ultraljudsbehandling för biofilm avskiljning

Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i MBEC-analyser (Minimum Biofilm Eradication Concentration), vilket möjliggör effektiv lossning av biofilmceller från deras ytfäste. Biofilmer är till sin natur strukturerade samhällen av mikroorganismer inneslutna i en extracellulär matris, vilket gör dem betydligt mer resistenta mot antimikrobiella medel jämfört med planktoniska celler. Under MBEC-analyser, ultraljudsbehandling använder ultraljudsvågor för att generera kontrollerad kavitation, störa biofilmmatrisen och frigöra inbäddade celler i en suspension. Detta steg säkerställer att biofilmcellerna är jämnt dispergerade i återvinningsmediet, vilket underlättar noggranna livskraftsbedömningar genom plätering, utspädning eller spektrofotometriska metoder. Utan korrekt avskiljning av biofilm kan kvarvarande matriskomponenter skydda celler, vilket leder till underskattning av antimikrobiell effekt. Därför är ultraljudsbehandling oumbärlig för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara MBEC-värden, vilket återspeglar den verkliga utrotningspotentialen hos de testade medlen. Ultraljudssonden med flera brunnar UIP400MTP möjliggör enkel provberedning med hög genomströmning i analysplattor.

Analysprotokoll för minsta biofilmutrotningskoncentration (MBEC)

Steg 1: Bildning av biofilm

1. Förbered den bakteriella suspensionen:
   Odla bakterier i lämpliga medier för att logga fastillväxt.
   Späd bakteriekulturen till en definierad optisk densitet (t.ex. OD600 ~0,1).
2. Inokulera plattan med 96 brunnar:
   Tillsätt den bakteriella suspensionen (t.ex. 150–200 μL) i varje brunn på en standardmikrotiterplatta med 96 brunnar.
3. Fäst pinnlocket:
   Placera pinnlocket på den inokulerade plattan för att tillåta biofilmbildning på pinnytorna.
4. Inkubera plattan:
   Inkubera installationen vid en lämplig temperatur (t.ex. 37 °C) i 24–48 timmar utan att skaka för att främja biofilmstillväxt.

Steg 2: Behandling med antimikrobiella medel

• Förbered antimikrobiella lösningar:
  Bered en rad antimikrobiella koncentrationer i färska medier.
  Exponera biofilmer för antimikrobiella medel:
  Ta bort pinnlocket från bakteriekulturen och skölj det i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna planktoniska celler.
  Placera pinnlocket i en ny platta med 96 brunnar som innehåller de antimikrobiella lösningarna.
• Inkubera plattan:
  Inkubera under en fastställd period (t.ex. 24 timmar) för att möjliggöra exponering för antimikrobiell exponering.

Steg 3: Ultraljudsbehandling med 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP

Ultraljudsbehandlingen är avgörande för att lossa biofilmer från pinnlocken för att bedöma livskraften. Följ dessa steg för UIP400MTP ultraljudsfilter:

1. Förbered installationen:
   Fyll en ny platta med 96 brunnar med återvinningsmedium (t.ex. neutraliserande buljong eller färskt tillväxtmedium) i varje brunn.
2. Överför pinnlocket:
   Ta bort pinnlocket från den antimikrobiella behandlingsplattan.
   Skölj pinnlocket i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna kvarvarande antimikrobiella medel.
3. Placera plattan och ultraljudssonikatorn:
   Fäst pinnlocket på återvinningsmediumplattan.
   Placera återvinningsmediumplattan på den UIP400MTP ultraljudsbehandlingsplattformen och se till att plattan är centrerad och stabil.
4. Justera parametrar för ultraljudsbehandling:
   Ställ in ultraljudsbehandlingsparametrarna på UIP400MTP (inställningarna kan justeras till biofilmen):
   Amplitud: 70–100 %.
   Ultraljudsbehandling tid: 1–3 minuter (justera baserat på biofilm robusthet) vid cykelläge.
5. Sonikera:
   Starta ultraljudsbehandlingsprocessen. Ultraljudsvibrationen kommer att lossa biofilmerna från pinnytorna till återvinningsmediet.
6. Övervaka processen:
   Använd den pluggbara temperatursensorn för att övervaka sample temperatur i brunnarna. UIP400MTP kan anslutas till en labbkylare för kylning.
7. Hantering efter ultraljudsbehandling:
   Överför omedelbart återvinningsmediet (som nu innehåller fristående biofilmer) till en ny steril platta för nedströmsanalys.

(A) Platta som innehåller TSB med 2 % glukos som används för biofilmbildning, cellåtervinning och
bestämning av MIC och MBCB; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer. bestämning av MIC och MBCB; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer.
Biofilmcellerna som bildades på stiften lossnade genom ultraljudsbehandling (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 minuter i 96-brunnars plattor som innehöll färskt odlingsmedium för återhämtning av cellerna.
(Bild och studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Steg 4: Lönsamhetsbedömning

Fristående biofilmer från plattor och kulturer:

1. Utför serieutspädningar av återvinningsmediet och plattan på agar för att räkna upp kolonibildande enheter (CFU).
   Alternativt kan du använda en kolorimetrisk eller fluorescensbaserad viabilitetsanalys.
2. Spela in resultat:
   Bestäm MBEC som den lägsta koncentrationen av antimikrobiella medel som utrotade detekterbar biofilm.

Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher sonikatorer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Läs här hur UIP400MTP används för att lossa biofilm som ett provberedningssteg under ASTM E2799-protokollet för att testa desinfektionsmedlets effektivitet mot Pseudomonas aeruginosa biofilm med hjälp av MBEC-analysen.