Analysprotokoll för minsta hämmande koncentration (MIC)

MIC-analysen (Biofilm-Based Minimum Inhibitory Concentration) är en viktig metod för att utvärdera effektiviteten hos antimikrobiella medel mot biofilmassocierade mikroorganismer, som uppvisar ökad resistens på grund av deras skyddande extracellulära matris. Ett avgörande steg i denna analys är att störa biofilmstrukturer för att frigöra inbäddade celler för noggrann bedömning av livskraften. Den UIP400MTP multi-well platta sonikator underlättar denna process genom att använda fokuserat ultraljud för att generera kontrollerad kavitation, effektivt lossa biofilmceller och dispergera dem i en enhetlig suspension. Denna precisa och reproducerbara biofilmsstörning förbättrar tillförlitligheten och genomströmningen hos MIC-analyser, vilket gör UIP400MTP till ett viktigt verktyg för att främja biofilmsforskning.

Ultraljudsbehandling för biofilm avskiljning

Den biofilmsbaserade MIC-analysen mäter vanligtvis bakteriell viabilitet eller tillväxthämning med hjälp av metoder som plätering, koloniräkning eller optiska densitetsmätningar. Ultraljudsbehandling är ett kritiskt steg i biofilmbaserade MIC-analyser vid bedömning av den antimikrobiella känsligheten hos biofilmassocierade mikroorganismer. Dess primära funktion är att lossa och dispergera celler som är inbäddade i biofilmmatrisen till en enhetlig suspension för noggrann analys.
Biofilmer är betydligt mer resistenta mot antimikrobiella medel jämfört med planktoniska celler, vilket gör korrekt avlossning avgörande för korrekt analys. Under denna process genererar ultraljudsvågor kontrollerad kavitation, bryter isär biofilmmatrisen och frigör inbäddade celler i en enhetlig suspension i återvinningsmediet. Detta steg möjliggör exakta viabilitetsbedömningar av biofilmdispergerade celler genom metoder som plätering, utspädning och koloniräkning. Korrekt biofilmstörning via ultraljudsbehandling förhindrar kvarvarande matriskomponenter från att skärma celler, vilket annars skulle kunna leda till en underskattning av antimikrobiell aktivitet. Multi-well plate sonicator UIP400MTP är särskilt väl lämpad för detta ändamål, och erbjuder exakta och reproducerbara ultraljudsbehandlingsförhållanden för att säkerställa tillförlitlig och hög genomströmning förberedelse av analysplattor.

Varför ultraljudsbehandling är nödvändigt i biofilmbaserade minsta hämmande koncentration analyser

För viabilitetsmätningar och cellräkning krävs en fullständig och tillförlitlig avskiljning och dispersion av enskilda celler. UIP400MTP främjar en enhetlig, icke-skadlig biofilmavlossning och celldispersion för robusta analysresultat.

• Biofilmens komplexitet: Biofilmer är strukturerade mikrobiella samhällen inneslutna i en extracellulär polymer substans (EPS) matris, som skyddar mikroorganismerna och gör dem mer resistenta mot antimikrobiella medel.
• Enhetlig spridning: För att noggrant mäta livskraften hos biofilminbäddade celler eller deras känslighet för antimikrobiella medel måste biofilmen först lossna och brytas ner till en homogen suspension.

Biofilmbaserat analysprotokoll för minsta hämmande koncentration

Analysen Minimum Inhibitory Concentration (MIC) bestämmer den lägsta koncentrationen av ett antimikrobiellt medel som krävs för att hämma synlig tillväxt av mikroorganismer. Detta protokoll är utformat för biofilm-associerade mikroorganismer, med hjälp av UIP400MTP multi-well platta sonikator för biofilm störningar.

Steg 1: Förberedelse av bakteriell inokulat

1. Förbered den bakteriella suspensionen:
   Odla bakterier i lämpliga medier till den mellersta logaritmiska fasen.
   Späd ut kulturen för att uppnå en standardiserad celldensitet (t.ex. 0,5 McFarland-standard eller OD600 ~0,1).
2. Förbered antimikrobiella lösningar:
   Späd det antimikrobiella medlet i ett lämpligt medium för att skapa en rad koncentrationer (t.ex. tvåfaldiga seriespädningar).
3. Fördela i 96well-plattan:
   Tillsätt de antimikrobiella lösningarna i brunnarna på en standardplatta med 96 brunnar, med en slutlig brunnsvolym på ~150–200 μL.
   Inkludera tillväxtkontroller (inga antimikrobiella medel) och sterilitetskontroller (inget bakteriellt inokulat).

Steg 2: Bildning av biofilm på pinnlocket

• Fäst pinnlocket:
  Placera det specialiserade pinnlocket på de inokulerade brunnarna och se till att pinnarna är helt nedsänkta i bakteriesuspensionen.
• Inkubera plattan:
  Inkubera vid lämplig temperatur (t.ex. 37 °C) under en specificerad tidsperiod (t.ex. 24 timmar) under statiska förhållanden för att möjliggöra biofilmbildning på pinnarna.

Steg 3: Antimikrobiell exponering

• Skölj pinnarna:
  Ta bort pinnlocket från bakteriesuspensionen och skölj försiktigt i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna löst fästa planktonceller.
• Utsätt för antimikrobiella medel:
  Överför pinnlocket till en ny 96well-platta som innehåller de antimikrobiella utspädningar som förberetts tidigare.
  Inkubera under en fastställd period (t.ex. 24 timmar) under statiska förhållanden så att det antimikrobiella medlet kan verka på biofilmerna.

Steg 4: Ultraljudsbehandling med Microplate Sonicator UIP400MTP

Ultraljudsbehandlingen är avgörande för att lossa biofilmer från pinnlocken för att bedöma livskraften. Följ dessa steg för UIP400MTP ultraljudsfilter:

1. Förbered installationen:
   Fyll en ny platta med 96 brunnar med återvinningsmedium (t.ex. neutraliserande buljong eller sterilt tillväxtmedium) i varje brunn.
2. Överför pinnlocket:
   Ta bort pinnlocket från den antimikrobiella behandlingsplattan.
   Skölj pinnlocket i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna kvarvarande antimikrobiella medel.
3. Placera plattan i ultraljudssonikatorn:
   Fäst pinnlocket på återvinningsmediumplattan.
   Placera återvinningsmediumplattan i UIP400MTP ultraljudssonikator, se till att plattan sitter centrerad och stabil som i manualen som beskrivs.
4. Justera parametrar för ultraljudsbehandling:
   Ställ in ultraljudsbehandlingsparametrarna på UIP400MTP (inställningarna kan justeras till biofilmen):
   Amplitud: 70–100 %.
   Ultraljudsbehandling tid: 1–3 minuter (justera baserat på biofilm struktur) vid cykelläge.
5. Sonikera:
   Starta ultraljudsbehandlingsprocessen. Ultraljudsvågorna kommer att störa biofilmmatrisen och lossa cellerna i återvinningsmediet.
6. Övervaka processen:
   Använd den pluggbara temperatursensorn för att övervaka sample temperatur i brunnarna. UIP400MTP kan anslutas till en labbkylare för kylning.
7. Hantering efter ultraljudsbehandling:
   Överför omedelbart återvinningsmediet som innehåller lossnade biofilmer till en ny steril platta för efterföljande analys.

(A) Platta som innehåller TSB med 2 % glukos som används för biofilmbildning, cellåterhämtning och bestämning av MIC och MBEC; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer.
Biofilmcellerna som bildades på stiften lossnade genom ultraljudsbehandling (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 minuter i 96-brunnars plattor som innehöll färskt odlingsmedium för återhämtning av cellerna.
(Bild och studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Steg 4: Lönsamhetsbedömning

Fristående biofilmer från plattor och kulturer:

1. Utför serieutspädningar av återvinningsmediet och plattan på agar för att räkna upp kolonibildande enheter (CFU).
2. Utvärdera MIC:
   Bestäm MIC som den lägsta antimikrobiella koncentrationen som helt hämmar synlig mikrobiell tillväxt i återvinningsmediet.

MIC Minimum Inhibitory Concentration: Exempel på mikrotiterplatta och tolkning av mikrospädningsresultat.
(Studie och bild: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher sonikatorer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Här kan du läsa om hur UIP400MTP används för att lossa biofilm i ASTM E2799-protokollet – Testning av desinfektionsmedlets effektivitet mot Pseudomonas aeruginosa biofilm med hjälp av MBEC-analysen.