Protokoll för analys av minsta hämmande koncentration (MIC)

Den biofilmbaserade analysen av minsta hämmande koncentration (MIC) är en väsentlig metod för att utvärdera effekten av antimikrobiella medel mot biofilmassocierade mikroorganismer, som uppvisar ökad resistens på grund av sin skyddande extracellulära matrix. Ett avgörande steg i denna analys är att lösgöra biofilmstrukturer för att frigöra inbäddade celler och möjliggöra en noggrann bedömning av viabiliteten. Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor underlättar denna process genom att använda fokuserat ultraljud för att generera kontrollerad kavitation, vilket effektivt lösgör biofilmceller och dispergerar dem till en homogen suspension. Denna precisa och reproducerbara sönderdelning av biofilm ökar MIC-analysernas tillförlitlighet och provgenomströmning, vilket gör UIP400MTP till ett väsentligt verktyg för att föra biofilmforskningen framåt.

Varför bör jag använda ultraljudsbehandling vid MIC-analyser?

• Noggranna, reproducerbara data: Få homogena cellsuspensioner som eliminerar matrixens skyddande effekt och säkerställer att koloniräkningar och mätningar av optisk densitet verkligen återspeglar de antimikrobiella medlens effekt.
• Effektivitet med hög provgenomströmning: Bearbeta en hel 96-brunnsplatta samtidigt på bara 1–3 minuter och ersätt långsam manuell skrapning med varierande resultat med ett effektiviserat arbetsflöde.
• Bibehållen cellviabilitet: Lösgör varsamt inbäddade celler utan de fysiska skador som skrapning orsakar och bibehåll därmed högre överlevnadsgrad för tillförlitliga MIC/MBEC-beräkningar.
• Ingen risk för korskontaminering: Dra nytta av en beröringsfri konstruktion med ett koppformat ultraljudshorn som behandlar alla brunnar likformigt utan att sonder vidrör enskilda prover eller brunnar.
• Redo att uppfylla standardkrav: Anpassa din metodik till validerade branschprotokoll som ASTM E2799-22 och ge dina data större trovärdighet i regulatoriska sammanhang eller vid publicering.
• Tillförlitlig screening av läkemedel och behandlingar: Lita på dina resultat från känslighetsbestämningar för att fatta bättre beslut om antimikrobiell effekt, resistensprofilering eller utveckling av behandlingar.

Ultraljudsbehandling för lösgöring av biofilm

Den biofilmbaserade MIC-analysen mäter vanligtvis bakteriell viabilitet eller tillväxthämning med metoder som utplattning, koloniräkning eller mätning av optisk densitet. Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i biofilmbaserade MIC-analyser vid bedömning av biofilmassocierade mikroorganismers känslighet för antimikrobiella medel. Dess huvudsakliga funktion är att lösgöra och dispergera celler som är inbäddade i biofilmens matrix till en homogen suspension för noggrann analys.
Biofilmer är betydligt mer resistenta mot antimikrobiella medel än planktoniska celler, vilket gör korrekt lösgöring avgörande för en noggrann analys. Under denna process genererar ultraljudsvågor kontrollerad kavitation som bryter sönder biofilmens matrix och frigör inbäddade celler till en homogen suspension i återvinningsmediet. Detta steg möjliggör precisa bedömningar av viabiliteten hos celler som dispergerats från biofilmen med metoder som utplattning, spädning och koloniräkning. Korrekt sönderdelning av biofilm genom ultraljudsbehandling förhindrar att kvarvarande matrixkomponenter skyddar cellerna, vilket annars skulle kunna leda till en underskattning av den antimikrobiella aktiviteten. Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor är särskilt väl lämpad för detta ändamål och erbjuder precisa och reproducerbara förhållanden för ultraljudsbehandling som säkerställer tillförlitlig beredning av analysplattor med hög provgenomströmning.

Varför ultraljudsbehandling är nödvändig vid biofilmbaserade analyser av minsta hämmande koncentration

För viabilitetsmätningar och cellräkning krävs fullständig och tillförlitlig lösgöring och dispergering av enskilda celler. UIP400MTP främjar en likformig lösgöring av biofilm och dispergering av celler utan att skada dem, vilket ger robusta analysresultat.

• Biofilmens komplexitet: Biofilmer är strukturerade mikrobiella samhällen inneslutna i en matris av extracellulära polymera substanser (EPS), som skyddar mikroorganismerna och gör dem mer resistenta mot antimikrobiella medel.
• Jämn dispergering: För att noggrant mäta viabiliteten hos celler inbäddade i biofilm eller deras känslighet för antimikrobiella medel måste biofilmen först lossas och brytas ned till en homogen suspension.

Protokoll för biofilmbaserad analys av minsta hämmande koncentration

Analysen av minsta hämmande koncentration (MIC) fastställer den lägsta koncentrationen av ett antimikrobiellt medel som krävs för att hämma synlig tillväxt av mikroorganismer. Detta protokoll är utformat för biofilmassocierade mikroorganismer och använder flerbrunnsplattsonikatorn UIP400MTP för att bryta upp biofilmen.

Steg 1: Beredning av bakterieinokulum

1. Bered bakteriesuspensionen:
   Odla bakterier i lämpliga medier till mitten av den logaritmiska tillväxtfasen.
   Späd kulturen för att uppnå en standardiserad celldensitet (t.ex. 0,5 McFarland-standard eller OD600 ~0,1).
2. Bered antimikrobiella lösningar:
   Späd det antimikrobiella medlet i ett lämpligt medium för att skapa en serie koncentrationer (t.ex. seriella tvåfaldiga spädningar).
3. Fördela i 96-brunnsplattan:
   Tillsätt de antimikrobiella lösningarna i brunnarna på en standardplatta med 96 brunnar, med en slutvolym på ~150–200 µL per brunn.
   Inkludera tillväxtkontroller (utan antimikrobiellt medel) och sterilitetskontroller (utan bakterieinokulum).

Steg 2: Biofilmbildning på stiftlock

• Sätt på stiftlocket:
  Placera det specialutformade stiftlocket över de inokulerade brunnarna och säkerställ att stiften är helt nedsänkta i bakteriesuspensionen.
• Inkubera plattan:
  Inkubera vid lämplig temperatur (t.ex. 37°C) under en angiven tid (t.ex. 24 timmar) under statiska förhållanden för att möjliggöra biofilmbildning på stiften.

Steg 3: Exponering för antimikrobiella medel

• Skölj stiften:
  Ta bort stiftlocket från bakteriesuspensionen och skölj försiktigt i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna löst vidhäftande planktoniska celler.
• Exponera för antimikrobiella medel:
  Överför stiftlocket till en ny 96-brunnsplatta som innehåller de tidigare beredda spädningarna av det antimikrobiella medlet.
  Inkubera under en fastställd tid (t.ex. 24 timmar) under statiska förhållanden så att det antimikrobiella medlet kan verka på biofilmerna.

Steg 4: Ultraljudsbehandling med mikroplattsonikatorn UIP400MTP

Ultraljudsbehandlingen är ett avgörande steg för att lossa biofilmer från stiftlocken för att bedöma viabiliteten. Följ dessa steg för sonikatorn UIP400MTP:

1. Förbered uppställningen:
   Fyll varje brunn i en ny 96-brunnsplatta med återhämtningsmedium (t.ex. neutraliserande buljong eller sterilt tillväxtmedium).
2. Överför stiftlocket:
   Ta bort stiftlocket från plattan för antimikrobiell behandling.
   Skölj stiftlocket i steril koksaltlösning eller PBS för att avlägsna rester av antimikrobiella medel.
3. Placera plattan i sonikatorn:
   Sätt stiftlocket på plattan med återhämtningsmedium.
   Placera plattan med återhämtningsmedium i sonikatorn UIP400MTP och säkerställ att plattan står centrerat och stabilt enligt beskrivningen i manualen.
4. Justera parametrarna för ultraljudsbehandlingen:
   Ställ in parametrarna för ultraljudsbehandlingen på UIP400MTP (inställningarna kan anpassas till biofilmen):
   Amplitud: 70–100%.
   Ultraljudsbehandlingstid: 1–3 minuter (anpassa efter biofilmens struktur) i cykelläge.
5. Ultraljudsbehandla:
   Starta ultraljudsbehandlingen. Ultraljudsvågorna kommer att bryta upp biofilmsmatrisen och frigöra cellerna till återhämtningsmediet.
6. Övervaka processen:
   Använd den anslutningsbara temperatursensorn för att övervaka provtemperaturen i brunnarna. UIP400MTP kan anslutas till en laboratoriekylare för kylning.
7. Hantering efter ultraljudsbehandlingen:
   Överför omedelbart återhämtningsmediet som innehåller lossade biofilmer till en ny steril platta för efterföljande analys.

(A) Platta innehållande TSB med 2% glukos som används för biofilmsbildning, återvinning av celler och bestämning av MIC och MBEC; (B) Lock med stift för bildning av stafylokockbiofilmer.
Biofilmscellerna som bildats på stiften lossades genom ultraljudsbehandling (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 min i 96-brunnsplattor innehållande färskt odlingsmedium för återvinning av cellerna.
(Bild och studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Steg 4: Bedömning av viabilitet

Platta ut och odla lossade biofilmer:

1. Utför seriespädningar av återvinningsmediet och platta ut på agar för att räkna kolonibildande enheter (CFU).
2. Utvärdera MIC:
   Bestäm MIC som den lägsta antimikrobiella koncentration som fullständigt hämmar synlig mikrobiell tillväxt i återvinningsmediet.

MIC, minsta hämmande koncentration: Exempel på mikrotiterplatta och tolkning av mikrospädningsresultat.
(Studie och bild: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Vilka har nytta av ultraljudsbehandling vid MIC-analyser?

• Tillverkare av medicintekniska produkter: För att testa ytbeläggningars effektivitet och validera rengöringsprotokoll för produkter som är benägna att utveckla biofilm.
• Kliniska mikrobiologer: För att noggrant diagnostisera implantatassocierade infektioner (såsom PJI) genom att återvinna bakterier från medicinteknisk utrustning.
• Läkemedelsutvecklare: För att utvärdera nya antimikrobiella medels effektivitet mot motståndskraftiga patogener inbäddade i biofilm.
• Akademiska forskare: För att genomföra reproducerbara studier med hög provgenomströmning av biofilmers biologi och mekanismer för antimikrobiell resistens.
• Industriella kvalitetskontrollteam: För att bedöma biologisk påväxt och desinfektionsmedels effektivitet i industriella miljöer (t.ex. med hjälp av standarder som ASTM E2799-22).

Konstruktion, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielschers ultraljudsapparater är välkända för sin högsta kvalitet och sina högsta konstruktionsstandarder. Robusthet och enkel användning gör det möjligt att smidigt integrera våra ultraljudsapparater i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsapparater klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och god användarvänlighet. Självklart är Hielschers ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Läs här hur UIP400MTP används för att lossa biofilm i ASTM E2799-protokollet – testning av desinfektionsmedels effektivitet mot biofilm av Pseudomonas aeruginosa med hjälp av MBEC-analysen.