Staphylococcus Biofilm odling och avskiljningsprotokoll

Standardiserade metoder är avgörande för tillförlitliga forskningsresultat. Här hittar du ett odlings- och avskiljningsprotokoll för stafylokockbiofilmer. Detta protokoll fokuserar på strömlinjeformad provberedning med hög genomströmning med hjälp av UIP400MTP multi-well plate sonicator för effektiv biofilmslossning med hög genomströmning i 96-brunnars plattor. Protokollet innehåller också viktiga steg för odling, tvättning och visualisering av biofilm, med fokus på att minimera variabilitet och säkerställa reproducerbarhet.

Staphylococcus Biofilm och antibiotikaforskning

Stafylokockbiofilmer spelar en avgörande roll vid ihållande infektioner på grund av deras resistens mot antibiotika och immunsvar. Bildandet av biofilm ger en skyddande miljö för bakterier, vilket gör infektioner svåra att behandla. Forskning om biofilmer fokuserar ofta på att förstå deras bildning, beteende och känslighet för antimikrobiella medel, med tonvikt på metoder med hög genomströmning för att effektivisera experimentella arbetsflöden.
Den UIP400MTP multi-well plate sonicator erbjuder en betydande fördel inom biofilmsforskning genom att möjliggöra snabb och effektiv lossning av biofilmer från 96-brunnars plattor. Denna enhet ger enhetlig ultraljudsenergi till alla brunnar, vilket säkerställer konsekventa resultat samtidigt som variabiliteten minimeras.

Protokoll för odling och avskiljning av stafylokockbiofilm

Nedan guidar vi dig med en steg-för-steg-instruktion genom processen att odla och lossa en stafylokockbiofilm. Som ett föredömligt analytiskt steg visar vi dig hur du kvantifierar den odlade biomassan spektrofotometriskt genom kristallviolett färgning.

Odling av Staphylococcus Biofilm

Material som krävs:

• Sterila flatbottnade 96-brunnars polystyrenvävnadskulturbehandlade mikrotiterplattor med lock
• Tryptisk sojabuljong (TSB) med 0,25 % glukos
• Biologiskt säkerhetsskåp

Trappsteg:

1. Förbered en steril arbetsmiljö i ett biologiskt säkerhetsskåp för att minimera kontaminering.
2. Tillsätt TSB som innehåller 0,25 % glukos till mikrotiterplattans brunnar. TSB utan glukos stöder i allmänhet inte biofilmbildning och bör endast användas som kontroll vid behov.
3. Inokulera brunnarna med bakteriestammar som beretts enligt beskrivningen nedan:
4. Förbered bakteriella suspensioner, se till att det inte finns några redan existerande cellkluster genom att homogenisera suspensionerna med hjälp av ultraljudsbehandling eller genom att bryta upp kluster med en 23-gauge nål och kort virvel.
5. Försegla plattan med locket och inkubera under förhållanden som är optimala för biofilmbildning (t.ex. 37 °C i 24 timmar).
6. Utför experimentet i tre exemplar för varje bakteriestam (tre brunnar per stam) för att säkerställa tillförlitligheten.
7. Allokera sex brunnar per platta för negativa kontroller. Upp till 30 stammar kan testas per platta med 96 hål.

Visualisering och tvätt av biofilm

1. Efter inkubation, kassera mediet försiktigt för att undvika att störa biofilmen.
2. Tvätta varje brunn fyra gånger med fysiologisk koksaltlösning för att avlägsna planktonbakterier.
3. Inspektera botten av brunnarna för vita fläckar som tyder på förekomst av biofilm.

Lossning av biofilm med hjälp av multi-well plate sonicator UIP400MTP

Enhetsinställningar och parametrar:

• UIP400MTP ultraljudsbehandling med flera brunnar
• Driftinställningar: 60 % amplitud, cykelläge med 60 sekunder PÅ / 30 sekunder AV

Trappsteg:

1. Placera den tvättade mikrotiterplattan på den UIP400MTP plattformen.
2. Ultraljudsbehandla proverna vid rekommenderade inställningar (60 % amplitud, 60 sekunder PÅ, 30 sekunder AV). Anpassa inställningarna efter bakteriestammen.
3. Starta ultraljudsbehandlingsprocessen för att lossa biofilmen. Ultraljudsvågorna stör biofilmmatrisen och frigör de vidhäftande bakterierna.
4. Den UIP400MTP säkerställer enhetlig exponering över alla brunnar för konsekventa lossningsresultat.

Analytiskt steg: Kvantifiering av fristående Staphylococcus biofilmsbiomassa med hjälp av kristallviolett (CV)

Material som krävs:

• 0.1% kristallviolett (CV) lösning
• 95 % etanol eller 30 % ättiksyra (för solubilisering)
• Mikroplattläsare som kan läsa vid 570 nm
• Sterila mikrotiterplattor för färgning

Trappsteg:

1. Förberedelse av färgningsplatta: Överför 100 μL av den fristående biofilmsuspensionen från varje brunn på den sonikerade plattan till motsvarande brunnar på en ren, steril 96-håls mikrotiterplatta. Detta säkerställer en tydlig och enhetlig miljö för färgning.
2. Färgning av den lossnade biofilmen: Tillsätt 150 μL 0,1 % kristallviolett lösning till varje brunn som innehåller den lossnade biofilmsuspensionen. Pipettera försiktigt för att säkerställa en jämn blandning av biofilmssuspensionen och kristallviolett.
3. Inkubation: Låt plattan inkuberas i rumstemperatur i 15 minuter så att den kristallvioletta färgen kan färga biomassan effektivt.
4. Tvättning: Efter inkubation, kassera försiktigt den kristallvioletta lösningen från brunnarna utan att störa biomassan. Tvätta varje brunn tre gånger med steril fysiologisk koksaltlösning för att ta bort obunden fläck.
5. Torkning: Låt plattan lufttorka i rumstemperatur eller under en steril luftflödeskåpa. Undvik uppvärmning, eftersom det kan förändra resultaten.
6. Solubilisering: Tillsätt 200 μL 95 % etanol (eller 30 % ättiksyra, beroende på standardlaboratoriepraxis) till varje brunn för att solubilisera den bundna kristallvioletten. Blanda försiktigt genom att pipettera eller skaka plattan i 10 minuter i rumstemperatur.
7. Mätning: Mät den optiska densiteten (OD) för den lösliga kristallvioletta lösningen vid 570 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
8. Dataanalys: Subtrahera det genomsnittliga OD570-värdet för negativa kontroller (brunnar med TSB men ingen bakteriell inokulat) från experimentella brunnar för att ta hänsyn till bakgrundsfärgning. Registrera och analysera data.

Observera: Utför experimentet i tre exemplar för varje tillstånd för att säkerställa reproducerbarheten. Säkerställ korrekt hantering av kristallviolett och etanol, i enlighet med säkerhets- och kasseringsprotokoll.
 

De viktigaste fördelarna med UIP400MTP i korthet:

• Bearbetning med högt dataflöde: Designad speciellt för plattor med flera brunnar, vilket gör att du kan bearbeta flera prover samtidigt.
• Enhetlig ultraljudsfördelning: Säkerställer samma ultraljudsintensitet över brunnar, vilket ger konsekventa resultat över alla prover.
• Använd vilken standardplatta som helst: UIP400MTP kan hantera alla vanliga tallrikar med flera brunnar, petriskålar och rörställ. Inga dyra proprietära plattor krävs!
• Användarvänligt gränssnitt: Lätt att installera och kontrollera, vilket gör det till ett utmärkt verktyg för att öka labbproduktiviteten. Programmerbara inställningar och automatisering underlättar standardisering av processer!