Protokoll för odling och lösgöring av Staphylococcus-biofilm

Standardiserade metoder är avgörande för tillförlitliga forskningsresultat. Här hittar du ett protokoll för odling och lösgöring av stafylokockbiofilmer. Protokollet fokuserar på effektiviserad provberedning med hög provgenomströmning med hjälp av ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor för effektiv lösgöring av biofilm med hög provgenomströmning i 96-brunnsplattor. Protokollet innehåller också viktiga steg för odling, tvättning och visualisering av biofilm, med fokus på att minimera variation och säkerställa reproducerbarhet.

Forskning om Staphylococcus-biofilm och antibiotika

Staphylococcus-biofilmer spelar en avgörande roll vid ihållande infektioner på grund av sin motståndskraft mot antibiotika och immunreaktioner. Biofilmsbildning ger bakterier en skyddande miljö, vilket gör infektioner svåra att behandla. Biofilmsforskning fokuserar ofta på att förstå biofilmernas bildning, beteende och känslighet för antimikrobiella medel, med tonvikt på metoder med hög provgenomströmning för att effektivisera experimentella arbetsflöden.
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor erbjuder en betydande fördel inom biofilmsforskning genom att möjliggöra snabb och effektiv lösgöring av biofilmer från 96-brunnsplattor. Enheten tillför jämn ultraljudsenergi till alla brunnar, vilket säkerställer enhetliga resultat samtidigt som variationen minimeras.

Protokoll för odling och lösgöring av Staphylococcus-biofilm

Nedan guidar vi dig steg för steg genom processen för att odla och lösgöra en Staphylococcus-biofilm. Som exempel på ett analyssteg visar vi hur den odlade biomassan kan kvantifieras spektrofotometriskt genom färgning med kristallviolett.

Odling av Staphylococcus-biofilm

Material som behövs:

• Sterila, flatbottnade mikrotiterplattor av polystyren med 96 brunnar och lock, ytbehandlade för vävnadsodling
• Tryptisk sojabuljong (TSB) med 0,25% glukos
• Mikrobiologisk säkerhetsbänk

Steg:

1. Förbered en steril arbetsmiljö i en mikrobiologisk säkerhetsbänk för att minimera kontaminering.
2. Tillsätt TSB med 0,25% glukos till mikrotiterplattans brunnar. TSB utan glukos stöder i allmänhet inte biofilmsbildning och bör endast användas som kontroll vid behov.
3. Inokulera brunnarna med bakteriestammar som har beretts enligt beskrivningen nedan:
4. Bered bakteriesuspensioner och säkerställ att inga redan befintliga cellkluster finns kvar genom att homogenisera suspensionerna med ultraljudsbehandling eller genom att bryta upp klustren med en nål av storlek 23 gauge och kortvarig vortexblandning.
5. Förslut plattan med dess lock och inkubera under optimala förhållanden för biofilmsbildning (t.ex. vid 37°C i 24 timmar).
6. Utför experimentet i triplikat för varje bakteriestam (tre brunnar per stam) för att säkerställa tillförlitlighet.
7. Avsätt sex brunnar per platta för negativa kontroller. Upp till 30 stammar kan testas per 96-brunnsplatta.

Visualisering och tvättning av biofilm

1. Kassera mediet försiktigt efter inkuberingen för att undvika att störa biofilmen.
2. Tvätta varje brunn fyra gånger med fysiologisk koksaltlösning för att avlägsna planktoniska bakterier.
3. Inspektera brunnarnas botten efter vita fläckar som tyder på förekomst av biofilm.

Lösgöring av biofilm med ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor

Utrustningskonfiguration och parametrar:

• Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor
• Driftinställningar: 60% amplitud, cykelläge med 60 sekunder PÅ / 30 sekunder AV

Steg:

1. Placera den tvättade mikrotiterplattan på UIP400MTP-plattformen.
2. Ultraljudsbehandla proverna med de rekommenderade inställningarna (60% amplitud, 60 sekunder PÅ, 30 sekunder AV). Anpassa inställningarna till bakteriestammen.
3. Starta ultraljudsbehandlingen för att lösgöra biofilmen. Ultraljudsvågorna bryter upp biofilmens matris och frigör de vidhäftande bakterierna.
4. UIP400MTP säkerställer enhetlig exponering i alla brunnar för enhetliga resultat vid lösgöring.

Analyssteg: Kvantifiering av biomassa från lösgjord Staphylococcus-biofilm med kristallviolett (CV)

Material som behövs:

• 0,1% kristallviolettlösning (CV)
• 95% etanol eller 30% ättiksyra (för solubilisering)
• Mikroplattläsare som kan mäta vid 570 nm
• Sterila mikrotiterplattor för färgning

Steg:

1. Förberedelse av färgningsplattan: Överför 100 µL av den lossade biofilmsuspensionen från varje brunn i den ultraljudsbehandlade plattan till motsvarande brunnar i en ren, steril mikrotiterplatta med 96 brunnar. Detta säkerställer en ren och enhetlig miljö för färgningen.
2. Färgning av den lossade biofilmen: Tillsätt 150 µL 0,1% kristallviolettlösning till varje brunn som innehåller den lossade biofilmsuspensionen. Pipettera försiktigt för att säkerställa att biofilmsuspensionen och kristallvioletten blandas jämnt.
3. Inkubering: Låt plattan inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter så att kristallvioletten kan färga biomassan effektivt.
4. Tvättning: Avlägsna försiktigt kristallviolettlösningen från brunnarna efter inkuberingen utan att störa biomassan. Tvätta varje brunn tre gånger med steril fysiologisk koksaltlösning för att avlägsna obundet färgämne.
5. Torkning: Låt plattan lufttorka vid rumstemperatur eller i en steril luftflödesbänk. Undvik uppvärmning, eftersom detta kan förändra resultaten.
6. Solubilisering: Tillsätt 200 µL 95% etanol (eller 30% ättiksyra, beroende på laboratoriets standardrutiner) till varje brunn för att solubilisera den bundna kristallvioletten. Blanda försiktigt genom att pipettera eller skaka plattan i 10 minuter vid rumstemperatur.
7. Mätning: Mät den optiska densiteten (OD) hos den solubiliserade kristallviolettlösningen vid 570 nm med en mikroplattläsare.
8. Dataanalys: Subtrahera de negativa kontrollernas genomsnittliga OD570-värde (brunnar med TSB men utan bakterieinokulum) från värdena för försöksbrunnarna för att korrigera för bakgrundsfärgning. Registrera och analysera data.

Obs! Utför experimentet i triplikat för varje betingelse för att säkerställa reproducerbarhet. Säkerställ korrekt hantering av kristallviolett och etanol och följ rutinerna för säkerhet och avfallshantering.
 

De viktigaste fördelarna med UIP400MTP i korthet:

• Bearbetning med hög provgenomströmning: Utformad särskilt för flerbrunnsplattor, vilket gör att du kan bearbeta flera prover samtidigt.
• Jämn ultraljudsfördelning: Säkerställer samma ultraljudsintensitet i alla brunnar och ger enhetliga resultat för alla prover.
• Använd valfri standardplatta: UIP400MTP kan hantera alla typer av standardflerbrunnsplattor, petriskålar och provrörsställ. Inga dyra tillverkarspecifika plattor krävs!
• Användarvänligt gränssnitt: Enkel att ställa in och styra, vilket gör den till ett utmärkt verktyg för att öka laboratoriets produktivitet. Programmerbara inställningar och automatisering underlättar standardisering av processer!