Protokoll för användning av Hielscher ultraljudsapparater för flera prover vid biofilmsanalys och proteomisk analys

Användning av ultraljudsapparater för flera prover, såsom VialTweeter Multi-Tube Sonicator och UIP400MTP Microplate Sonicator, effektiviserar laboratoriets arbetsflöden för tillämpningar med hög provgenomströmning. Båda apparaterna möjliggör exakt och enhetlig ultraljudsbehandling av flera prover, vilket minimerar variationen och förbättrar reproducerbarheten. Detta är särskilt fördelaktigt vid experiment som kräver konsekvent provlys, avlägsnande av biofilm, proteinextraktion eller proteolytisk nedbrytning, där manuella metoder eller metoder för enstaka prover är mindre effektiva och tenderar att ge ojämna resultat.

Effektivisera arbetsflöden med ultraljudsapparater för flera prover

UIP400MTP möjliggör exempelvis samtidig ultraljudsbehandling av brunnarna i mikroplattor, vilket säkerställer enhetligt avlägsnande av biofilmer eller cellmaterial. VialTweeter erbjuder samtidigt exakt lys och homogenisering av flera prover i rör utan korskontaminering. Dessa ultraljudsapparater förkortar behandlingstiderna avsevärt, förbättrar experimentens reproducerbarhet och bibehåller hög provintegritet, vilket gör dem till oumbärliga verktyg inom mikrobiologisk, proteomisk och molekylärbiologisk forskning.
Nedan följer ett detaljerat protokoll som exemplifierar användningen av Hielscher-modellerna för ultraljudsbehandling av flera prover, VialTweeter Multi-Tube Sonicator och Microplate Sonicator UIP400MTP, i en studie av biofilmsbildning hos E. coli och efterföljande proteomisk analys.

Protokoll: Biofilmsbildning, avlägsnande av biofilm och proteomisk analys med Hielscher ultraljudsapparater för flera prover

1. Beredning av bakteriekultur

• Odla E. coli-bakterier (stam W3110) vid 30°C, en temperatur som är gynnsam för biofilmsbildning hos E. coli, i ett tryptonbuljongmedium (TB) som innehåller:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• Tillsätt antibiotika vid behov för att säkerställa att plasmiderna bibehålls.
• För mikroskopi och studier av promotoraktivitet, använd E. coli-stammen W3110 med en genomiskt integrerad reporter för förstärkt GFP (eGFP) under kontroll av rplL-promotorn.
• Använd GFP-reporterplasmider för olika promotorer (t.ex. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) för att mäta promotorernas aktivitet.

2. Odling och avlägsnande av biofilm

• Tillsätt 1,5 mL utspädd bakteriekultur per brunn i en 12-brunnsplatta (CellStar 12-brunnsplattor, Greiner Bio-One).
• Inkubera för att möjliggöra biofilmsbildning.
• Avlägsna försiktigt den planktoniska (icke-vidhäftande) kulturen.

– Tvätta varje brunn med 500 µL PBS.
– Lösgör vidhäftande celler genom att ultraljudsbehandla 12-brunnsplattan i mikroplattsultraljudsapparaten UIP400MTP. UIP400MTP säkerställer enhetlig lösgöring genom att tillföra jämn ultraljudsenergi till alla brunnar.
– Inställningar för ultraljudsbehandling: 60% amplitud, cykelläge: 60 sec PÅ / 30 sec AV.

3. Skörd och lys av celler

• Centrifugera de lösgjorda biofilmscellerna vid 4 500 g i 5 minuter.
• Tvätta de pelleterade cellerna med PBS.
• Resuspendera cellerna i 100 µL 2% natriumlauroylsarkosinat (SLS) och inkubera vid 95°C i 15 minuter.
• Ultraljudsbehandla med VialTweeter Multi-Tube Sonicator för att säkerställa fullständig celllys.
  – Inställningar för ultraljudsbehandling: 100% amplitud, 50 s PÅ / 10 s AV under en total körtid på 10 min; håll proverna på is.

4. Reduktion och alkylering

• Tillsätt 5 mM tris(2-karboxietyl)fosfin (TCEP) för att reducera disulfidbindningar och inkubera vid 95°C i 15 minuter.
• Alkylera proteinerna med 10 mM jodacetamid i 30 minuter vid 25°C.

5. Proteinkvantifiering och nedbrytning

• Centrifugera lysaten för att avlägsna cellrester.
• Kvantifiera det totala proteininnehållet med Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Bryt ned 50 µg totalt protein med 1 µg trypsin i en lösning som innehåller 2% SLS och 100 mM ammoniumvätekarbonat.
• Inkubera nedbrytningsreaktionen över natten vid 30°C.

6. Peptidrening

• Fäll ut SLS genom att tillsätta 1,5% trifluorättiksyra (TFA) och centrifugera sedan.
• Rena peptiderna med C18-mikrospinnkolonner.
• Torka de renade peptiderna och resuspendera dem i 0,1% TFA.

7. Vätskekromatografi–masspektrometri (LC-MS/MS)

• Analysera peptiderna med en Q-Exactive Plus-masspektrometer kopplad till ett Ultimate 3000 RSLC nano-system.
• Separera peptiderna med en HPLC-kolonn med omvänd fas (75 µm × 42 cm) packad med C18-harts (2,4 µm).
• Applicera en gradient från 2% till 35% lösningsmedel B (acetonitril med 0,15% myrsyra) under 140 minuter.
• Samla in data med högupplösta MS-skanningar följda av tandem-MS/MS-skanningar av de 10 mest intensiva jonerna.

8. Dataanalys

• Bearbeta rådata från LC-MS med programvaran Progenesis.
• Exportera .mgf-filer och analysera dem med MASCOT.
• Utför peptidkvantifiering med SafeQuant för kvalitetskontroll och justering för falska fynd.
• Utför alla experiment i duplikat eller triplikat för att säkerställa reproducerbarhet.

Ultraljudsapparater för flera prover för provberedning med hög provgenomströmning

Modellerna VialTweeter och UIP400MTP för ultraljudsbehandling av flera prover förbättrar avsevärt precisionen och effektiviteten i experimentella arbetsflöden, särskilt inom biofilmsforskning och proteomik. Deras förmåga att behandla flera prover enhetligt säkerställer hög provgenomströmning utan att äventyra datakvaliteten. Dessa fördelar, tillsammans med de effektiviserade arbetsflöden som beskrivs ovan, gör Hielscher ultraljudsapparater för flera prover till oumbärliga verktyg för modern biologisk forskning.

Konstruktion, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta standarder för kvalitet och konstruktion. Robusthet och enkel användning möjliggör smidig integrering av våra ultraljudsapparater i industrianläggningar. Hielscher ultraljudsapparater klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med toppmodern teknik och användarvänlighet. Hielscher ultraljudsapparater är naturligtvis CE-kompatibla och uppfyller kraven enligt UL, CSA och RoHs.