Protokoll med Hielscher Multi-Sample Sonicators i biofilm och proteomisk analys

Användningen av ultraljudstekniker med flera prover, såsom VialTweeter Multi-Tube Sonicator och UIP400MTP Microplate Sonicator, effektiviserar laboratoriets arbetsflöden för tillämpningar med hög genomströmning. Båda enheterna möjliggör exakt och enhetlig ultraljudsbehandling över flera prover, vilket minimerar variabilitet och förbättrar reproducerbarheten. Detta är särskilt fördelaktigt i experiment som kräver konsekvent provlys, biofilmavlossning, proteinextraktion eller proteolytisk nedbrytning, där manuella metoder eller metoder med enstaka prov är mindre effektiva och benägna att bli inkonsekventa.

Effektivisera arbetsflöden med Multi-Sample Sonicators

Den UIP400MTP möjliggör till exempel samtidig ultraljudsbehandling av mikroplattbrunnar, vilket säkerställer enhetlig lossning av biofilmer eller cellulärt material. Samtidigt erbjuder VialTweeter exakt lys och homogenisering av flera rörprover utan korskontaminering. Dessa sonikatorer minskar bearbetningstiderna avsevärt, förbättrar experimentell reproducerbarhet och upprätthåller hög provintegritet, vilket gör dem till oumbärliga verktyg inom mikrobiologi, proteomik och molekylärbiologisk forskning.
Nedan följer ett detaljerat protokoll som exemplifierar användningen av Hielscher multi-sample sonikator modeller, VialTweeter Multi-Tube Sonicator och Microplate Sonicator UIP400MTP, i en studie som involverar E. coli biofilm bildning och efterföljande proteomisk analys.

Protokoll: Biofilm bildning, avskiljning, och proteomisk analys med hjälp av Hielscher Multi-Sample sonikatorer

1. Förberedelse av bakteriekultur

• Odling av E. coli-bakterier (stam W3110) vid 30 °C, en temperatur som är gynnsam för bildning av E. coli-biofilm, i tryptonbuljong (TB) medium som innehåller:
  – 10 g/l trypton
  – 5 g/L NaCl
• Komplettera med antibiotika vid behov för att säkerställa plasmidretention.
• För studier av mikroskopi och promotoraktivitet, använd W3110 E. coli-stammen med en genomiskt förbättrad GFP-rapportör (eGFP) under kontroll av rplL-promotorn.
• Använd GFP-reporterplasmider för olika promotorer (t.ex. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) för att mäta de projektansvarigas verksamhet.

2. Odling och avskiljning av biofilm

• Såd 1,5 ml utspädd bakteriekultur per brunn i en platta med 12 brunnar (CellStar plattor med 12 brunnar, Greiner Bio-One).
• Inkubera för att möjliggöra biofilmbildning.
• Ta försiktigt bort den planktoniska (icke-vidhäftande) kulturen.

– Tvätta varje väl med 500 μL PBS.
– Lossa fästa celler genom att sonikera 12-brunnsplattan i den UIP400MTP mikroplattan sonikator. UIP400MTP säkerställer en enhetlig lossning genom att leverera konsekvent ultraljudsenergi över alla brunnar.
– Ultraljudsbehandling inställningar: 60% amplitud, cykelläge: 60 sek PÅ / 30 sek AV.

3. Cellskörd och lys

• Centrifugera lossnade biofilmceller vid 4 500 g i 5 minuter.
• Tvätta pelleterade celler med PBS.
• Återsuspendera cellerna i 100 μl 2 % natriumlauroylsarkosinat, SLS, och inkubera vid 95 °C i 15 minuter.
• Sonicate med hjälp av VialTweeter Multi-Tube Sonicator för att säkerställa fullständig celllys.
  – Ultraljudsbehandling: 100% amplitud, 50 s PÅ / 10 s AV för 10 min total körtid; Förvara proverna på is.

4. Reduktion och alkylering

• Tillsätt 5 mM Tris(2-karboxetyl)fosfin (TCEP) för att minska disulfidbindningar och inkubera vid 95 °C i 15 minuter.
• Alkylatproteiner med 10 mM jodaceetamid i 30 minuter vid 25 °C.

5. Proteinkvantifiering och matsmältning

• Centrifuglysat för att rensa bort skräp.
• Kvantifiera det totala proteininnehållet med hjälp av Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Smält 50 μg totalprotein med 1 μg trypsin i en lösning som innehåller 2 % SLS och 100 mM ammoniumbikarbonat.
• Inkubera matsmältningsreaktionen över natten vid 30 °C.

6. Rening av peptider

• Fäll ut SLS genom att tillsätta 1,5 % trifluorättiksyra (TFA) och centrifugera sedan.
• Rena peptider med hjälp av C18 microspin-kolonner.
• Torka renade peptider och resuspendera i 0,1% TFA.

7. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS)

• Analysera peptider på en Q-Exactive Plus masspektrometer tillsammans med ett Ultimate 3000 RSLC nanosystem.
• Separera peptider med hjälp av en omvänd fas HPLC-kolonn (75 μm × 42 cm) packad med C18-harts (2,4 μm).
• Applicera en gradient från 2 % till 35 % lösningsmedel B (acetonitril med 0,15 % myrsyra) under 140 minuter.
• Samla in data med hjälp av högupplösta MS-skanningar följt av tandem-MS/MS-skanningar av de 10 mest intensiva jonerna.

8. Analys av data

• Bearbeta råa LC-MS-data med hjälp av programvaran Progenesis.
• Exportera .mgf-filer och analysera dem med MASCOT.
• Utför peptidkvantifiering med SafeQuant för kvalitetskontroll och justering av falsk upptäckt.
• Utför alla experiment i duplikat eller tre exemplar för att säkerställa reproducerbarheten.

Multi-Sample Sonicators för High-throughput provberedning

Multi-sample sonikator-modellerna VialTweeter och UIP400MTP avsevärt förbättra precisionen och effektiviteten i experimentella arbetsflöden, särskilt inom biofilmforskning och proteomik. Deras förmåga att bearbeta flera prover enhetligt säkerställer hög genomströmningskapacitet utan att kompromissa med datakvaliteten. Dessa fördelar, i kombination med de strömlinjeformade arbetsflöden som beskrivs ovan, gör Hielscher multi-sample ultraljudsapparater till viktiga verktyg för modern biologisk forskning.

Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.