Extraktion av extracellulär matrix med ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor

Traditionella metoder för extraktion av extracellulär matrix (EM) omfattar ofta flera steg för att bryta upp biofilmens matrix. Dessa tekniker kan dock vara tidskrävande och ge ojämna resultat, vilket leder till variationer i resultaten. Med ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor underlättas EM-extraktionen avsevärt genom mycket effektiv, precis och enhetlig uppbrytning av biofilm i format med hög provgenomströmning. UIP400MTP använder fokuserat ultraljud för att generera kontrollerad kavitation som effektivt bryter ned biofilmens matrix samtidigt som viabiliteten och integriteten hos cellerna som är inbäddade i biofilmen bevaras. Användning av UIP400MTP förbättrar reproducerbarheten och noggrannheten hos efterföljande analyser, såsom metabolomiska och proteomiska analyser, viabilitetstester och studier av antimikrobiell känslighet. Genom att effektivisera EM-extraktionen gör UIP400MTP det möjligt för forskare att uppnå konsekventa resultat av hög kvalitet, vilket ger djupare insikter i biofilmers dynamik och interaktioner med externa agens.

Extraktion av extracellulär matrix

Extracellulär matrix (EM) är en avgörande beståndsdel i biofilmer som bildas av mikroorganismer såsom Candida albicans. EM består av polysackarider, proteiner, lipider och extracellulärt DNA, ger strukturell integritet, förmedlar vidhäftning till ytor och bidrar avsevärt till antimikrobiell resistens. Extraktion och analys av EM är avgörande för att förstå biofilmers biologi, klarlägga mekanismer bakom läkemedelsresistens och identifiera nya terapeutiska mål.

Protokoll för extraktion av extracellulär matrix (EM) från Candida albicans-biofilmer med UIP400MTP

Detta protokoll fokuserar på extraktion av extracellulär matrix (EM) från statiska Candida albicans-biofilmer. Ultraljudsapparaten UIP400MTP integreras för att ersätta traditionell skrapning eller enzymbaserade steg och därmed förbättra effektiviteten och reproducerbarheten.

Material som behövs

Stegvisa instruktioner för EM-extraktion

1. Bildning av statisk biofilm
   För statiska biofilmer, inokulera C. albicans i brunnarna i en 96-brunnsplatta med RPMI-1640-medium. Varje brunn bör innehålla samma volym inokulum (t.ex. 200 µL per brunn).
   Inkubera plattan vid 37°C under statiska förhållanden i 24 timmar för att möjliggöra biofilmsbildning på brunnarnas ytor.
2. Förberedelse av biofilm för extraktion
   Efter inkubationen, aspirera försiktigt och kassera det förbrukade mediet från varje brunn utan att störa biofilmen.
   Skölj varje brunn försiktigt med steril PBS (t.ex. 200 µL) för att avlägsna löst vidhäftande celler och planktoniska rester. Upprepa detta steg två gånger.
   Tillsätt färsk PBS eller extraktionsbufferten (t.ex. 200 µL) till varje brunn som förberedelse för ultraljudsbehandling.
3. Ultraljudsbehandling med UIP400MTP
   Placera 96-brunnsplattan som innehåller PBS eller extraktionsbuffert i ultraljudsapparaten UIP400MTP:s bricka. Följ anvisningarna i bruksanvisningen för att placera flerbrunnsplattan korrekt.
   Ultraljudsbehandla i 5–6 minuter med en skonsam inställning (60% amplitud, pulsläge) och säkerställ en enhetlig uppbrytning av biofilmstrukturen och frisättning av EM-komponenter.
   Använd ultraljudsapparaten UIP400MTP:s temperaturreglering (temperaturgivare och inställningar) för att undvika överdriven uppvärmning eller skador på proverna.
4. Behandling med katjonbytarharts (CER)
   Överför den ultraljudsbehandlade vätskan från varje brunn till en ny 96-brunnsplatta.
   Tillsätt en dubbel volym CER-suspension (beredd i PBS eller buffert) till varje brunn (t.ex. 400 µL total volym per brunn).
   Förslut plattan och inkubera den på en plattskakare eller rotator vid 400 rpm i 3 timmar för att möjliggöra bindning och isolering av EM-komponenter.
5. Separation och filtrering
   Centrifugera plattan vid 2 000 × g i 10 minuter för att separera hartset och cellerna från supernatanten.
   Överför försiktigt den EM-innehållande supernatanten från varje brunn till en ny 96-brunnsplatta.
   Filtrera supernatanten genom ett 0,22 µm filter med hjälp av ett plattbaserat vakuumfördelarsystem eller motsvarande för att erhålla ett rent EM-extrakt.
6. Analys av EM
   Använd tekniker såsom UPLC-Q-TOF-MS för oriktad metabolitprofilering, eller använd specifika analyser (t.ex. BCA för proteiner samt kit för kvantifiering av triglycerider och kolhydrater) för att karakterisera EM-komponenter.

Extraktion av extracellulär matrix med hög provgenomströmning

Den höga effektiviteten vid extraktion av extracellulär matrix (EM) med ultraljudsapparaten UIP400MTP har revolutionerat provberedningen för analyser som kräver noggrann analys av biofilmers egenskaper. UIP400MTP använder ultraljudsvågor för att precist och enhetligt bryta upp biofilmens matrix, vilket möjliggör effektiv frisättning av EM-komponenter samtidigt som cellernas viabilitet och integritet bevaras. Detta tillvägagångssätt förbättrar avsevärt tillförlitligheten hos analyser såsom viabilitetstester för biofilm, proteomiska och metabolomiska studier samt utvärderingar av antimikrobiell känslighet.

Vid analyser av återvinning av celler från biofilm, såsom räkning av kolonibildande enheter (CFU), säkerställer EM-extraktion med UIP400MTP att reagenser får obehindrad tillgång till cellerna som är inbäddade i biofilmen. På liknande sätt drar proteomiska och metabolomiska analyser, såsom UPLC-Q-TOF-MS, nytta av isoleringen av proteiner, lipider och metaboliter med högt utbyte. UIP400MTP stöder också precis testning av antimikrobiell känslighet, vilket möjliggör noggrann bestämning av MIC- och MBEC-värden för biofilm. Dessutom underlättar den effektiva extraktionen med UIP400MTP enzymaktivitetsanalyser, kvantifiering av komponenter och strukturstudier, vilket ger värdefulla insikter i den extracellulära matrixens roll i biofilmers arkitektur, vidhäftning och resistensmekanismer.

Denna reproducerbara extraktionsmetod med hög provgenomströmning optimerar EM-beredningen och säkerställer överlägsna resultat i en rad biofilmsrelaterade analyser.