Deparaffinisering och proteinextraktion från FFPE

Underlätta proteinextraktion från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadssektioner med hjälp av en optimerad kombination av avparaffinisering, solubilisering och ultraljudsbehandling med en VialTweeter multi-tube ultraljudsapparat. Detta protokoll stöder nedströms masspektrometri-baserad proteomik och är kompatibelt med SP3-sanering och enzymatisk nedbrytningsarbetsflöden.

Denna SOP är avsedd för laboratoriepersonal som är involverad i proteomisk analys av FFPE-vävnadsprover, med hjälp av högpresterande ultraljudsbehandling. Den är optimerad för upp till tio FFPE-prover som bearbetas parallellt med hjälp av VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokoll: Proteinextraktion från FFPE-prover med hjälp av VialTweeter

Material och reagenser

Reagenser

• Xylen (histologisk kvalitet)
• Etanol (absolut 96 %)
• Buffert för lys:

6 M Guanidinhydroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboxetyl)fosfin)
40 mM CAA (2-kloracetamid)

• Proteashämmare (tillval, t.ex. fullständig™ mini EDTA-fri)

Utrustning

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1,5 ml eller 2,0 ml lågbindande mikrocentrifugrör
• Värmeblock eller inkubator (inställningar för 95 °C och 80 °C)
• Mikrocentrifug
• Termomixer (tillval men rekommenderas)

Exempel på indata

• 1–2 sektioner av 10 μm tjock FFPE-vävnad per prov (dvs. per injektionsflaska)

eller

• Totalt ~100 μg vävnad per prov (dvs. per injektionsflaska)

Notera: Använd nya blad för mikrotomi för att minimera kontaminering av paraffinskräp.

Procedur

1. Deparaffinisering
   1. Överför FFPE-sektioner till lågbindande mikrocentrifugrör.
   2. Tillsätt 1 ml xylen, virvla kort.
   3. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.
   4. Centrifugera vid 14 000 × g i 2 minuter; Kassera supernatant.
   5. Upprepa xylentvätten en gång till (steg 2–4).
   6. Tvätta pellet med 1 ml 96% etanol, virvla och centrifugera sedan vid 14 000 × g i 2 minuter. Kassera supernatant.
   7. Upprepa etanoltvätten en gång till (totalt 2 etanoltvättar).
   8. Lufttorka pellet i 10 minuter vid rumstemperatur med öppna lock för att avdunsta kvarvarande etanol.
2. Proteinextraktion och ultraljudsbehandling
   1. Tillsätt 200 μL lyseringsbuffert till varje torr pellet.
      Notera: Även om ultraljudssonackan rymmer upp till 1 ml, är 200 μL optimalt för nedströmsbearbetning.

   2. Blanda genom virvelning eller försiktig pipettering.
3. Första termiska inkubationen
   1. Inkubera rören vid 95 °C i 30 minuter, med omrörning vid 400 varv per minut med hjälp av en termomixer eller värmeblock.
   2. Låt proverna svalna i rumstemperatur i 5 min.
4. Första ultraljudsbehandling med VialTweeter
   1. Placera rören i VialTweeter.
   2. Ställ in VialTweeter UP200St till värdena nedan och ultraljudsbehandla.
Inställningar för ultraljudsbehandling
• Ställ in amplituden (A) till 100 %
• Ställ in pulsationsläget (C) på 100 %
• Periodur: På
• I tid: 60-talet
• Fritid: 30s
• Gränsvärde: 15 min (motsvarar 10 cykler)
(Beräkningsanmärkning: (60 s på + 30 s av) × 10 cykler = 900 s = 15 min)
5. Andra termiska inkubationen
   Ta bort rören och inkubera igen vid 95 °C i 15 min, 400 rpm.
6. Andra ultraljudsbehandling
   Upprepa ultraljudsbehandling på VialTweeter med samma inställningar (som ovan) för ytterligare 10 cykler (15 min totalt).
7. Klarning av lysat
   1. Centrifugera proverna vid 13 000 × g i 10 minuter vid 23 °C (rumstemperatur).
   2. Samla försiktigt upp supernatanten i en ny 2,0 ml Safe-lock Eppendorf-tub. Undvik att störa pelleten.
8. Bearbetning nedströms
   Lysatet är nu redo för SP3-sanering och enzymatisk nedbrytning.

Anmärkningar och bästa praxis

1. Överhettningsrisk under ultraljudsbehandling mildras av programmerad ON / OFF cykling.
2. Undvik att virvla efter ultraljudsbehandling för att förhindra proteinaggregering.

Avfallshantering och säkerhet

Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten för våra ultraljudsapparater i labbstorlek: