Avparaffinering och proteinextraktion från FFPE

Underlätta proteinextraktion från formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadssnitt med en optimerad kombination av avparaffinering, solubilisering och ultraljudsbehandling med en VialTweeter ultraljudsapparat för flera provrör. Detta protokoll stöder efterföljande masspektrometribaserad proteomik och är kompatibelt med arbetsflöden för SP3-rening och enzymatisk nedbrytning.

Denna standardarbetsrutin (SOP) är avsedd för laboratoriepersonal som utför proteomiska analyser av FFPE-vävnadsprover med högpresterande ultraljudsbehandling. Den är optimerad för upp till tio FFPE-prover som bearbetas parallellt med VialTweeter ultraljudsapparat för flera provrör.

Protokoll: Proteinextraktion från FFPE-prover med VialTweeter

Material och reagenser

Reagenser

• Xylen (histologisk kvalitet)
• Etanol (absolut 96%)
• Lyseringsbuffert:

6 M guanidinhydroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboxietyl)fosfin)
40 mM CAA (2-kloracetamid)

• Proteashämmare (valfritt; t.ex. cOmplete™ mini EDTA-free)

Utrustning

• VialTweeter ultraljudsapparat för flera provrör
• Mikrocentrifugrör på 1,5 mL eller 2,0 mL med låg bindningsförmåga
• Värmeblock eller inkubator (inställningar för 95°C och 80°C)
• Mikrocentrifug
• Termomixer (valfritt men rekommenderas)

Provmängd

• 1–2 snitt av 10 µm tjock FFPE-vävnad per prov (dvs. per provrör)

ELLER

• Totalt ~100 µg vävnad per prov (dvs. per provrör)

Obs! Använd nya blad vid mikrotomi för att minimera kontaminering med paraffinrester.

Förfarande

1. Avparaffinering
   1. Överför FFPE-snitten till mikrocentrifugrör med låg bindningsförmåga.
   2. Tillsätt 1 mL xylen och vortexblanda kort.
   3. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
   4. Centrifugera vid 14 000 × g i 2 minuter; kassera supernatanten.
   5. Upprepa xylentvätten en gång till (steg 2–4).
   6. Tvätta pelleten med 1 mL 96% etanol, vortexblanda och centrifugera sedan vid 14 000 × g i 2 minuter. Kassera supernatanten.
   7. Upprepa etanoltvätten en gång till (totalt 2 etanoltvättar).
   8. Lufttorka pelleten i 10 minuter vid rumstemperatur med öppna lock för att låta kvarvarande etanol avdunsta.
2. Proteinextraktion och ultraljudsbehandling
   1. Tillsätt 200 µL lyseringsbuffert till varje torr pellet.

      Obs! Även om ultraljudsapparaten rymmer upp till 1 mL är 200 µL optimalt för efterföljande bearbetning.

   2. Blanda genom vortexblandning eller försiktig pipettering.
3. Första värmeinkuberingen
   1. Inkubera rören vid 95 °C i 30 min med skakning vid 400 rpm med hjälp av en termomixer eller ett värmeblock.
   2. Låt proverna svalna vid rumstemperatur i 5 min.
4. Första ultraljudsbehandlingen med VialTweeter
   1. Placera rören i VialTweeter.
   2. Ställ in VialTweeter UP200St på värdena nedan och ultraljudsbehandla.
Inställningar för ultraljudsapparaten
• Ställ in amplituden (A) på 100%
• Ställ in pulseringsläget (C) på 100%
• Periodtimer: På
• På-tid: 60s
• Av-tid: 30s
• Gränsvärde: 15 min (motsvarar 10 cykler)
(Beräkningsanmärkning: (60 s på + 30 s av) × 10 cykler = 900 s = 15 min)
5. Andra värmeinkuberingen
   Ta ut rören och inkubera på nytt vid 95 °C i 15 min, 400 rpm.
6. Andra ultraljudsbehandlingen
   Upprepa ultraljudsbehandlingen med VialTweeter med samma inställningar (som ovan) i ytterligare 10 cykler (totalt 15 min).
7. Klarning av lysatet
   1. Centrifugera proverna vid 13 000 × g i 10 min vid 23°C (rumstemperatur).
   2. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt 2,0 mL Safe-lock Eppendorf-rör. Undvik att rubba pelleten.
8. Efterföljande bearbetning
   Lysatet är nu klart för SP3-rening och enzymatisk nedbrytning.

Anmärkningar och bästa praxis

1. Risken för överhettning under ultraljudsbehandlingen minskas genom programmerade PÅ/AV-cykler.
2. Undvik vortexblandning efter ultraljudsbehandlingen för att förhindra proteinaggregation.

Avfallshantering och säkerhet

Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater i laboratoriestorlek: