FFPE High-Throughput Sample Prep: Proteinextraktion och nukleinsyraskjuvning
Med hög genomströmning ultraljud UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics tar itu med utmaningarna med formalinfixering och paraffininbäddad (FFPE) vävnadsberedning. Lär dig hur ultraljud processer FFPE-prov i stort antal för FFPE-avparaffinisering, vävnadslys, homogenisering, proteinextraktion och DNA / RNA-skjuvning! Dra nytta av ultraljud FFPE-vävnadsförberedelse – Bearbetning av stora provmängder i flerbrunnsplattor! Skaffa prover av hög kvalitet och få höga provnummer för tillförlitliga forskningsresultat! Och sist men inte minst, spara tid och pengar!
FFPE provberedning underlättas av ultraljudsbehandling med hög genomströmning
Formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE) är den vanligaste metoden för att bevara och arkivera fasta vävnader. Extraktionen av biomolekyler från FFPE-vävnadsprover innebär ofta betydande utmaningar på grund av kvaliteten på de lagrade proverna. Dessa prover, som är ovärderliga tillgångar inom molekylärbiologi och klinisk forskning, utgör en rik källa till biologisk information för retrospektiva studier och diagnostisk biomarkörvalidering. Processen med formalinfixering och paraffininbäddning, samtidigt som vävnadsarkitektur och morfologi bevaras, komplicerar emellertid extraktionen av nukleinsyror och proteiner av hög kvalitet. Formalin inducerar tvärbindning av nukleinsyror och proteiner, vilket leder till molekylär fragmentering och kemiska modifieringar. Lär dig hur ultraljudsapparaten med hög genomströmning UIP400MTP övervinner utmaningarna med FFPE-provberedning!
Ultraljud för effektiv FFPE provberedning
- Lättanvänt arbetsflöde: Förenklade processer som är användarvänliga.
- Deparafinisering, proteinextraktion, DNA/RNA-skjuvning
- Snabb bearbetning med hög genomströmning: Effektiv hantering av plattor med flera brunnar.
- Effektiv avparaffinisering: Förbättrad solubilisering av proteiner.
- Giftfria lösningsmedel: Undviker användning av skadliga organiska lösningsmedel som xylen.
UIP400MTP ultraljudsapparat med hög genomströmning för FFPE-provbearbetning med hög genomströmning i flerbrunnsplattor
Framsteg inom proteinextraktionstekniker från FFPE Tissue
Hielscher Ultrasonics tar itu med utmaningarna vid beredning av FFPE-prov med hög genomströmning. Ultraljudsbehandling använder ultraljudsvågor för att generera mekaniska vibrationer och fokuserad kavitation, vilket effektivt stör cellulära strukturer och förbättrar solubiliseringen av biomolekyler. Denna teknik har vunnit popularitet för sin förmåga att öka effektiviteten och utbytet av nukleinsyra- och proteinextraktion från FFPE-vävnader samt DNA- och RNA-skjuvning för biblioteksberedning. Det är mycket viktigt att betona att ultraljud med hjälp av den UIP400MTP multibrunnsplattan sonikator upprätthåller integriteten hos dessa biomolekyler för nedströms applikationer.
Nukleinsyra skjuvning med hjälp av ultraljud med hög genomströmning
Multi-well ultraljudsapparat UIP400MTP för användning i miljöer med hög genomströmning ger beredningen av FFPE-prover till en ny nivå. Denna multiwell-plate ultraljudsbehandling metod ger en effektiv och pålitlig lösning för samtidig bearbetning av flera prover. Det underlättar snabb och reproducerbar extraktion av DNA, RNA och proteiner, som är avgörande för olika analytiska tekniker, inklusive nästa generations sekvensering (NGS), kvantitativ PCR och proteomikanalyser. Optimering av ultraljudsbehandling parametrar, såsom amplitud, varaktighet och temperatur, förbättrar ytterligare kvaliteten och kvantiteten av de extraherade biomolekylerna.
Den UIP400MTP sonikator för multibrunnsplattor erbjuder betydande fördelar för fragmentering och skjuvning av DNA och RNA från FFPE-vävnad. En av de utmärkande egenskaperna hos detta system är dess förmåga att uppnå smala fragmentstorlekar av DNA och RNA, vilket ger exakt avstämbarhet av ultraljudsbehandling intensitet för att erhålla korta fragment av 150-200 baspar (bp) eller längre fragment av 15-20 kilobaspar (kbp). Denna mångsidighet gör UIP400MTP oumbärlig för både kort- och långläsningssekvenseringsapplikationer, vilket säkerställer högkvalitativa resultat för nästa generations sekvensering (NGS) och helgenomsekvensering (WGS). Dess exakta kontroll över fragmentstorleken är avgörande för forskare inom alla områden av genomik, eftersom den gör det möjligt att förbereda prover enligt specifikationerna.
Kontakta oss för avancerade lösningar inom FFPE Tissue
Upptäck den UIP400MTP multibrunnsplattan ultraljudsbehandling för effektiv återvinning av biomolekyler från FFPE-prover, upprätthålla integriteten hos extraherade nukleinsyror och proteiner och säkerställa reproducerbarhet av resultaten. Denna teknik integreras sömlöst med andra preparativa och analytiska arbetsflöden, vilket effektiviserar och förbättrar molekylära undersökningar med hjälp av FFPE-vävnadsarkiv.
Fixeringsmedel och deras effekter
Fixering är ett avgörande steg i provberedning som bevarar cellulära strukturer, stoppar biokemiska reaktioner och förhindrar nedbrytning. Olika fixeringsmedel används beroende på de specifika experimentella kraven. De två vanligaste fixativen är formaldehyd och paraformaldehyd, som tvärbinder proteiner och nukleinsyror och bevarar cellernas och vävnadernas morfologi och antigenicitet. Andra fixeringsmedel, såsom etanol, metanol och glutaraldehyd, används för specifika applikationer.
Formaldehyd och paraformaldehydfixeringsmedel bildar metylenbryggor mellan aminogrupper, vilket resulterar i tvärbindning av proteiner. Denna process immobiliserar effektivt cellulära komponenter och bevarar deras integritet under efterföljande analyssteg. Effekterna av dessa fixeringsmedel kan påverkas av faktorer som koncentration, pH och temperatur, och att optimera dessa parametrar är avgörande för att säkerställa optimalt bevarande av cellulära strukturer.
Fördelar med ultraljud FFPE-förberedelse
Ultraljud är en kraftfull teknik för att störa fixerade celler och vävnader som utmärker konventionella tekniker. Det erbjuder flera anmärkningsvärda fördelar jämfört med traditionella lyseringsmetoder:
- Snabbhet och effektivitet: Ultraljudslys ger snabb störning av celler och vävnader, vilket avsevärt minskar bearbetningstiden jämfört med mekaniska eller kemiska lysmetoder. Högfrekventa ljudvågor som genereras av ultraljudssonden skapar mekaniska skjuvkrafter, vilket orsakar störningar i de fixerade cellulära strukturerna. Denna snabba och effektiva störning gör det möjligt för forskare att bearbeta stora provvolymer inom en kort tidsram.
- Skonsam och justerbar: Ultraljudslys erbjuder en mild störningsmekanism som minimerar skador på känsliga biomolekyler som proteiner, nukleinsyror och enzymer. Till skillnad från mekaniska metoder som genererar överdriven värme eller skjuvkrafter, använder ultraljudslys kontrollerad kavitation för att störa celler samtidigt som integriteten och funktionaliteten hos de intracellulära komponenterna bevaras.
- Mångsidighet: Ultraljudslys kan appliceras på olika fixativ, vilket gör det möjligt för forskare att arbeta med ett brett spektrum av fixerade prover. Oavsett om du använder formaldehyd, paraformaldehyd eller alternativa fixeringsmedel, ger ultraljudslys konsekvent effektiv störning, vilket säkerställer optimal återhämtning av cellulära komponenter.
- Hög avkastning och kvalitet: Ultraljudslys underlättar höga utbyten av intakta cellulära komponenter på grund av dess förmåga att störa fixerade celler och vävnader enhetligt. Detta gör det möjligt för nedströmsapplikationer som proteinanalys, nukleinsyraextraktion och enzymatiska analyser att ge tillförlitliga och reproducerbara resultat.
- Kompatibilitet med automatisering: Ultraljudslys kan enkelt integreras i automatiserade system, vilket möjliggör provbehandling med hög genomströmning. Denna kompatibilitet gör det möjligt för forskare att effektivisera sitt arbetsflöde och öka produktiviteten, särskilt i storskaliga studier.
Ultraljudsbehandling med 96 brunnar UIP400MTP för ultraljudsbehandling av mikrotiter- och multibrunnsplattor
Ultraljudslys har revolutionerat störningen av fixerade celler och vävnader, vilket erbjuder många fördelar jämfört med traditionella lysmetoder. Dess hastighet, effektivitet, selektivitet, mångsidighet, höga avkastning och automationskompatibilitet gör den till ett oumbärligt verktyg inom molekylärbiologi och bioteknikforskning. Hielscher Ultrasonics erbjuder beröringsfria ultraljudstekniker samt sond-typ sonikator och erbjuder den mest lämpliga ultraljudshomogenisatorn för din biovetenskapliga tillämpning. Oavsett om du vill bearbeta enstaka prover, flera prov eller mycket höga provantal samtidigt, kommer vi att erbjuda dig den bästa sonikatorn som matchar dina forsknings- och diagnostiska krav.
Läs mer om Hielscher beröringsfria sonikatorer för multi-sample och high-throughput provberedning!
- Engångsinvestering
- Använd dina egna förbrukningsartiklar
- Inga återkommande kostnader för egna tillbehör och förbrukningsvaror
- Hög genomströmning
- Precisionsstyrning
- Toppmodern teknik
- tillförlitlighet & robusthet
- Justerbar, exakt processtyrning
- Industriell kvalitet: Kan drivas kontinuerligt 24/7
- Enkel och säker att använda
- Lågt underhåll
Läs mer om tillämpningarna av ultraljudsmätare inom biovetenskap!
Plate sonicator UIP400MTP för alla 96-brunns plattor, mikrotiterplattor och multi-well plattor.
Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.
Kontakta oss! / Fråga oss!
UIP400MTP Ultraljudsapparat: FFPE-provförberedelse med hög genomströmning i Multi-Well-Plate
FAQ
Nedan svarar vi på vanliga frågor som är relevanta för FFPE-vävnadsberedning och ultraljud av FFPE-prover.
Hur bereds FFPE-vävnad?
Steg för förberedelse av FFPE-vävnad: Den noggranna hanteringen och bearbetningen av färsk vävnad är avgörande för att generera FFPE-prover av hög kvalitet. Att säkerställa bevarandet av cellulär arkitektur, nukleinsyror och proteiner är avgörande för korrekt nedströmsanalys. Varje steg – från insamling till inbäddning – kräver precision för att upprätthålla provets integritet för olika analyser, inklusive histologisk undersökning, immunhistokemi och molekylära studier. Korrekt utförd säkerställer denna fixerings- och inbäddningsprocess att den bevarade vävnaden korrekt återspeglar in vivo-tillståndet, vilket möjliggör tillförlitliga diagnostiska och forskningsresultat.
Vi går igenom de 6 huvudstegen i inbäddningsprocessen för FFPE-vävnadsprover.
- Insamling av vävnader
Biopsier från levande däggdjur och vävnadskulturer är båda livskraftiga källor för att erhålla färsk vävnad för beredning av FFPE-prover.
Det är viktigt att använda en aseptisk teknik: Använd sterila instrument och handskar för att undvika kontaminering. Helst ska du samla in vävnader i en steril miljö, t.ex. i en operationssal eller huva med laminärt flöde.
Eftersom provet är mycket ömtåligt är det viktigt att det hanteras på ett känsligt sätt: Minimera förseningar i bearbetningen och påbörja omedelbart efterföljande vävnadsbearbetning efter excisionen. Detta är avgörande för att förhindra autolys och nedbrytning. Förvara näsduken i rumstemperatur; Undvik frysning eftersom det kan orsaka iskristallbildning och vävnadsskador. - Fixering av vävnad
Först behandlas vävnaden med en fixativ lösning: Använd 10 % neutralbuffrat formalin (NBF), vilket motsvarar 4 % formaldehyd i vatten, buffrat till ett neutralt pH.
Sänk ner vävnaden helt i formalin. Säkerställ ett förhållande mellan fixeringsmedel och vävnadsvolym på minst 10:1. Fixeringstiden varierar vanligtvis från 6 till 24 timmar, beroende på vävnadstyp och storlek. Det är viktigt att fixeringsmedlet kan tränga in i vävnaden ordentligt. Överfixering kan dock leda till tvärbindning som komplicerar antigenhämtning, medan underfixering kan resultera i dålig vävnadsbevarande. - Trimning av vävnader
För det andra, trimma vävnaden till en tjocklek av cirka 3-5 mm för att tillåta tillräcklig penetration av fixeringsmedel. Se till att vävnaden är korrekt orienterad för att fånga relevanta histologiska strukturer. Detta underlättar extraktionsprocessen när vävnaden senare används för analys. - Bearbetning av det fixerade provet
Nu måste den fixerade vävnaden dehydreras: Efter fixering måste vävnaden dehydreras för att säkerställa noggrann penetration av paraffinvaxet. Låt vävnaden passera genom en graderad serie etanol (70 %, 80 %, 90 % och 100 %) för att avlägsna vatten.
Rensning med xylen: Paraffinvax är olösligt i vatten, men lösligt i xylen. Därför måste vattnet i vävnaden ersättas med xylen. Xylen i sig är dock olösligt i vatten men lösligt i alkohol, vilket kräver ett mellansteg där vatten först ersätts med alkohol. Sänk ner vävnaden i xylen eller en xylenersättning för att avlägsna etanol och förbereda vävnaden för paraffininfiltration.
Infiltration med paraffin: Bädda in vävnaden i smält paraffinvax, vilket säkerställer fullständig infiltration. Detta steg innebär vanligtvis flera förändringar av paraffin för att säkerställa en grundlig impregnering. - Bädda in vävnaden
I detta steg formas vävnaden till ett vävnadsblock: Placera vävnaden i en form med önskad orientering och häll smält paraffin över den. Låt paraffinet stelna genom att kyla i rumstemperatur eller på en kall platta. - Sektionering och montering
Mikrotomi: För att skära den inbäddade vävnaden, använd en mikrotom för att skära tunna sektioner (vanligtvis 4-5 mikrometer) från paraffinblocket. Sedan monteras provet och sektionerna placeras på glasskivor för efterföljande färgning och mikroskopisk analys.
Kontrollera slutligen kvaliteten på histologin: Utvärdera de första sektionerna under ett mikroskop för att säkerställa korrekt fixering och bearbetning. Justera protokoll efter behov baserat på vävnadstyp och observerad kvalitet.
FFPE-vävnader kan användas för att återvinna RNA, DNA och proteiner samt upptäcka tecken på cancer eller andra sjukdomar. De kan lagras i åratal och är en viktig del av hur forskare och läkare använder vävnadsprover för diagnos och forskning.
Vilka är de vanligaste problemen och utmaningarna med FFPE-vävnad?
Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) vävnadsprover används i stor utsträckning inom forskning och diagnostik, men de innebär flera utmaningar och vanliga problem:
- Nedbrytning av biomolekyler: Långvarig fixering kan leda till nedbrytning av DNA, RNA och proteiner, vilket gör det svårt att extrahera nukleinsyror eller proteiner av hög kvalitet för nedströmsapplikationer. Korrekt fixering (undvikande av under- och överfixering) är avgörande för vävnadsbevarande.
- Antigen maskering: Fixeringsprocessen kan maskera antigenplatser, vilket minskar effektiviteten av antikroppsbindning i immunhistokemi och andra immunologiska analyser. Detta kräver ofta antigenhämtning, en procedur där maskeringen av en epitop reverseras och epitop-antikroppsbindningen återställs. Det är dock inte säkert att den fullständiga antigeniciteten återställs.
- Variabel fixeringskvalitet: Skillnader i fixeringstider och förhållanden kan leda till inkonsekvent provkvalitet, vilket påverkar reproducerbarheten och jämförbarheten av resultaten. Använd pålitliga fixeringsprotokoll och undvik under- och överfixering.
- DNA-skador och fragmentering: Formalinfixering av FFPE-prover kan orsaka olika typer av DNA-skador, inklusive cytosindeaminering (C till T-mutationer), oxidativ skada (t.ex. 8-oxo-guanin som leder till G till T-mutationer), såväl som fysiska störningar som hack, luckor och abasiska platser som hindrar DNA-polymerasaktivitet. Formalinfixeringsprocessen kan orsaka fragmentering av DNA, vilket komplicerar genetiska och genomiska analyser som PCR och sekvensering.
- RNA-kvalitet: RNA som extraheras från FFPE-vävnader är ofta fragmenterat och kemiskt modifierat, vilket gör det utmanande att utföra transkriptomiska analyser av hög kvalitet.
- Proteinmodifieringar: Formalin kan inducera kemiska modifieringar i proteiner, vilket påverkar deras struktur och funktion, vilket kan störa proteomikanalyser.
- Exempel på bearbetningsartefakter: Under inbäddnings- och sektioneringsprocessen kan mekanisk stress och värme introducera artefakter och orsaka ytterligare skador på vävnaden.
- Batch-till-batch-variabilitet: Variationer i fixerings- och inbäddningsprotokoll mellan olika batcher kan leda till betydande variabilitet i resultaten, vilket komplicerar jämförelser mellan studier.
- Problem med lagring: Långvarig lagring av FFPE-block kan leda till ytterligare nedbrytning och förlust av nukleinsyraintegritet över tid, vilket påverkar livskraften hos arkivprover för retrospektiva studier.
Tvärbindning: Formalinfixering orsakar tvärbindning av proteiner och nukleinsyror, vilket kan hindra molekylär analys och påverka noggrannheten hos immunhistokemi och andra analyser.
Att använda optimerade protokoll, noggrann provhantering och tillämpning av avancerade tekniker hjälper till att förbättra kvaliteten och tillförlitligheten hos data som erhålls från FFPE-vävnader.
Vad är skillnaden mellan FFPE och fryst vävnad?
FFPE-vävnad (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) bevaras med hjälp av formalin för att fixera vävnaden och bäddas sedan in i paraffinvax, vilket möjliggör långvarig lagring vid rumstemperatur samtidigt som vävnadens morfologi bibehålls. Däremot bevaras fryst vävnad snabbt genom frysning, vilket bättre upprätthåller integriteten hos nukleinsyror och proteiner men kräver lagring vid mycket låga temperaturer.
Vilka kemikalier används för FFPE-inbäddning?
De kemikalier som används för FFPE-inbäddning inkluderar normalt formalin för fixering och paraffinvax för inbäddning. För FFPE-inbäddning fixeras vävnader vanligtvis med hjälp av antingen 10 % (v/v) neutralt buffrat formalin (FA) eller en nyberedd 4 % (w/v) formaldehydlösning (PFA) tillverkad av paraformaldehydpulver. Formalin, som är en lösning av formaldehyd i vatten, buffras till ett neutralt pH för att bevara vävnadsmorfologi och förhindra överdriven tvärbindning. Den paraformaldehydbaserade lösningen ger också effektiv fixering genom att tvärbinda proteiner och därigenom stabilisera vävnadsstrukturen för efterföljande inbäddning i paraffinvax. Dessa kemikalier är viktiga för att upprätthålla vävnadens integritet och morfologi under fixerings- och inbäddningsprocessen.
Hur avlägsnas paraffinet från FFPE-prover?
För att avlägsna paraffin från FFPE-prover utsätts vävnadssnitten vanligtvis för en serie xylentvättar följt av rehydrering genom en graderad serie alkoholer och slutligen vatten. Eftersom xylen är mycket giftigt och utgör hälsorisker som andningsproblem, hudirritation och potentiella långsiktiga effekter vid upprepad exponering, framträder avlägsnande av ultraljudsparaffin som ett lovande alternativ i många laboratorier. Denna metod använder intensiva ultraljudsvågor för att effektivt och säkert avlägsna paraffin utan behov av giftiga lösningsmedel som xylen, vilket minskar risken för laboratoriepersonal och skapar en säkrare arbetsmiljö.
Hur länge ska jag fixera mina vävnader för god FFPE-provkvalitet?
Allmänna rekommendationer för fixeringstid föreslår vanligtvis att vävnadsprover fixeras i formalin i 24 till 48 timmar. Denna varaktighet är i allmänhet tillräcklig för att bevara vävnadsmorfologi och cellulära strukturer samtidigt som överfixering minimeras, vilket kan leda till överdriven tvärbindning och nedbrytning av nukleinsyror och proteiner. Den optimala fixeringstiden kan dock variera beroende på storlek och typ av vävnad, med mindre eller mer ömtåliga prover som kräver kortare fixeringstider. Det är viktigt att balansera adekvat fixering för att förhindra vävnadsautolys och nedbrytning samtidigt som man undviker långvarig fixering som kan komplicera molekylära analyser nedströms.