FFPE-provberedning med hög genomströmning: proteinextraktion och skjuvning av nukleinsyror
Med ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för hög genomströmning tar Hielscher Ultrasonics itu med utmaningarna vid beredning av formalinfixerad och paraffininbäddad (FFPE) vävnad. Läs om hur ultraljudsbehandling bearbetar stora antal FFPE-prover för avparaffinering, vävnadslys, homogenisering, proteinextraktion och DNA-/RNA-skjuvning! Dra nytta av ultraljudsbaserad beredning av FFPE-vävnad – bearbeta stora antal prover i flerbrunnsplattor! Få högkvalitativa prover och stora provantal för tillförlitliga forskningsresultat! Och sist men inte minst, spara tid och pengar!
FFPE-provberedning underlättas med ultraljudsbehandling med hög genomströmning
Formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE) är den vanligaste metoden för att bevara och arkivera fasta vävnader. Extraktion av biomolekyler från FFPE-vävnadsprover innebär ofta betydande utmaningar på grund av de lagrade provernas kvalitet. Dessa prover, som är ovärderliga tillgångar inom molekylärbiologi och klinisk forskning, utgör en rik källa till biologisk information för retrospektiva studier och validering av diagnostiska biomarkörer. Även om formalinfixering och paraffininbäddning bevarar vävnadens arkitektur och morfologi, försvårar processen extraktion av högkvalitativa nukleinsyror och proteiner. Formalin inducerar tvärbindning av nukleinsyror och proteiner, vilket leder till molekylär fragmentering och kemiska modifieringar. Läs om hur ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för hög genomströmning övervinner utmaningarna vid FFPE-provberedning!
Ultraljudsbehandlare för effektiv FFPE-provberedning
- Lättanvänt arbetsflöde: Förenklade processer som är användarvänliga.
- Avparaffinering, proteinextraktion, DNA-/RNA-skjuvning
- Snabb bearbetning med hög genomströmning: Effektiv hantering av flerbrunnsplattor.
- Effektiv avparaffinering: Förbättrad solubilisering av proteiner.
- Giftfria lösningsmedel: Undviker användning av skadliga organiska lösningsmedel som xylen.
UIP400MTP ultraljudsbehandlare för hög genomströmning för bearbetning av FFPE-prover med hög genomströmning i flerbrunnsplattor
Framsteg inom tekniker för proteinextraktion från FFPE-vävnad
Hielscher Ultrasonics tar itu med utmaningarna vid FFPE-provberedning med hög genomströmning. Ultraljudsbehandling använder ultraljudsvågor för att generera mekaniska vibrationer och fokuserad kavitation, vilket effektivt bryter sönder cellstrukturer och förbättrar solubiliseringen av biomolekyler. Denna teknik har blivit populär tack vare sin förmåga att öka effektiviteten och utbytet vid extraktion av nukleinsyror och proteiner från FFPE-vävnader samt vid DNA- och RNA-skjuvning för bibliotekspreparering. Det är mycket viktigt att framhålla att ultraljudsbehandling med UIP400MTP för flerbrunnsplattor bevarar dessa biomolekylers integritet för efterföljande tillämpningar.
Skjuvning av nukleinsyror med ultraljudsbehandling med hög genomströmning
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor, avsedd för användning vid hög provgenomströmning, tar beredningen av FFPE-prover till en ny nivå. Denna metod för ultraljudsbehandling av flerbrunnsplattor ger en effektiv och tillförlitlig lösning för samtidig bearbetning av flera prover. Den möjliggör snabb och reproducerbar extraktion av DNA, RNA och proteiner, vilka är avgörande för olika analystekniker, däribland nästa generations sekvensering (NGS), kvantitativ PCR och proteomiska analyser. Optimering av parametrar för ultraljudsbehandlingen, såsom amplitud, varaktighet och temperatur, förbättrar ytterligare kvaliteten och mängden av de extraherade biomolekylerna.
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor erbjuder betydande fördelar vid fragmentering och skjuvning av DNA och RNA från FFPE-vävnad. En av systemets mest framträdande egenskaper är dess förmåga att uppnå ett snävt intervall av fragmentstorlekar för DNA och RNA, med möjlighet att finjustera ultraljudsintensiteten för att erhålla korta fragment på 150–200 baspar (bp) eller längre fragment på 15–20 kilobaspar (kbp). Denna mångsidighet gör UIP400MTP oumbärlig för sekvensering med både korta och långa läsningar och säkerställer högkvalitativa resultat vid nästa generations sekvensering (NGS) och helgenomsekvensering (WGS). Den exakta kontrollen över fragmentstorleken är avgörande för forskare inom alla genomikområden, eftersom den gör det möjligt att bereda prover enligt specifikationerna.
Kontakta oss för avancerade lösningar för FFPE-vävnad
Upptäck ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor för effektiv utvinning av biomolekyler ur FFPE-prover, med bibehållen integritet hos extraherade nukleinsyror och proteiner samt säkerställd reproducerbarhet hos resultaten. Denna teknik integreras sömlöst med andra preparativa och analytiska arbetsflöden och effektiviserar och förbättrar molekylära undersökningar med hjälp av FFPE-vävnadsarkiv.
Fixeringsmedel och deras effekter
Fixering är ett avgörande steg i provberedningen som bevarar cellulära strukturer, stoppar biokemiska reaktioner och förhindrar nedbrytning. Olika fixeringsmedel används beroende på de specifika experimentella kraven. De två vanligaste fixeringsmedlen är formaldehyd och paraformaldehyd, vilka tvärbinder proteiner och nukleinsyror och därigenom bevarar cellernas och vävnadernas morfologi och antigenicitet. Andra fixeringsmedel, såsom etanol, metanol och glutaraldehyd, används för specifika tillämpningar.
Fixeringsmedlen formaldehyd och paraformaldehyd bildar metylenbryggor mellan aminogrupper, vilket leder till tvärbindning av proteiner. Denna process immobiliserar effektivt cellulära komponenter och bevarar deras integritet under efterföljande analyssteg. Effekterna av dessa fixeringsmedel kan påverkas av faktorer såsom koncentration, pH och temperatur, och optimering av dessa parametrar är avgörande för att säkerställa optimalt bevarande av cellulära strukturer.
Fördelar med ultraljudsbaserad FFPE-beredning
Ultraljudsbehandling är en kraftfull teknik för sönderdelning av fixerade celler och vävnader som överträffar konventionella tekniker. Den erbjuder flera betydande fördelar jämfört med traditionella lysmetoder:
- Snabbhet och effektivitet: Ultraljudslys ger snabb sönderdelning av celler och vävnader och minskar bearbetningstiden avsevärt jämfört med mekaniska eller kemiska lysmetoder. Högfrekventa ljudvågor som genereras av ultraljudssonden skapar mekaniska skjuvkrafter som sönderdelar de fixerade cellulära strukturerna. Denna snabba och effektiva sönderdelning gör det möjligt för forskare att bearbeta stora provvolymer på kort tid.
- Skonsam och justerbar: Ultraljudslys erbjuder en skonsam sönderdelningsmekanism som minimerar skador på känsliga biomolekyler såsom proteiner, nukleinsyror och enzymer. Till skillnad från mekaniska metoder som genererar alltför mycket värme eller alltför stora skjuvkrafter använder ultraljudslys kontrollerad kavitation för att sönderdela celler samtidigt som de intracellulära komponenternas integritet och funktion bevaras.
- Mångsidighet: Ultraljudslys kan användas med olika fixeringsmedel, vilket gör det möjligt för forskare att arbeta med ett brett spektrum av fixerade prover. Oavsett om formaldehyd, paraformaldehyd eller alternativa fixeringsmedel används ger ultraljudslys genomgående effektiv sönderdelning och säkerställer optimal återvinning av cellkomponenter.
- Högt utbyte och hög kvalitet: Ultraljudslys möjliggör höga utbyten av intakta cellkomponenter tack vare sin förmåga att sönderdela fixerade celler och vävnader jämnt. Detta gör att efterföljande tillämpningar såsom proteinanalys, nukleinsyraextraktion och enzymatiska analyser kan ge tillförlitliga och reproducerbara resultat.
- Kompatibilitet med automatisering: Ultraljudslys kan enkelt integreras i automatiserade system, vilket möjliggör provbearbetning med hög provgenomströmning. Denna kompatibilitet gör det möjligt för forskare att effektivisera sitt arbetsflöde och öka produktiviteten, särskilt i storskaliga studier.
Ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor för ultraljudsbehandling av mikrotiter- och flerbrunnsplattor
Ultraljudslys har revolutionerat sönderdelningen av fixerade celler och vävnader och erbjuder många fördelar jämfört med traditionella lysmetoder. Dess snabbhet, effektivitet, selektivitet, mångsidighet, höga utbyte och kompatibilitet med automatisering gör den till ett oumbärligt verktyg inom molekylärbiologisk och bioteknisk forskning. Hielscher Ultrasonics erbjuder både beröringsfria ultraljudsapparater och ultraljudsapparater med sond och kan därmed erbjuda den lämpligaste ultraljudshomogenisatorn för din tillämpning inom livsvetenskaperna. Oavsett om du vill bearbeta enstaka prover, flera prover eller mycket stora antal prover samtidigt erbjuder vi den bästa ultraljudsapparaten för dina forsknings- och diagnostikkrav.
Läs mer om Hielschers beröringsfria ultraljudsapparater för beredning av flera prover och provberedning med hög provgenomströmning!
- engångsinvestering
- använd dina egna förbrukningsartiklar
- inga återkommande kostnader för tillverkarspecifika tillbehör och förbrukningsartiklar
- hög provgenomströmning
- precisionsstyrning
- toppmodern teknik
- tillförlitlighet & robusthet
- justerbar, exakt processtyrning
- industrikvalitet: kan köras kontinuerligt 24/7
- enkel och säker att använda
- lågt underhållsbehov
Läs mer om användningen av ultraljudsapparater inom livsvetenskaperna!
Ultraljudsapparaten UIP400MTP för alla 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor och flerbrunnsplattor.
Konstruktion, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielschers ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och konstruktionsstandarder. Robusthet och enkel användning gör det möjligt att smidigt integrera våra ultraljudsapparater i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsapparater klarar utan problem tuffa förhållanden och krävande miljöer.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med toppmodern teknik och användarvänlighet. Hielschers ultraljudsapparater uppfyller självklart CE-kraven och kraven enligt UL, CSA och RoHs.
Kontakta oss! / Fråga oss!
Ultraljudsapparaten UIP400MTP: FFPE-provberedning med hög provgenomströmning i flerbrunnsplatta
Vanliga frågor
Nedan besvarar vi vanliga frågor som är relevanta för beredning av FFPE-vävnad och ultraljudsbehandling av FFPE-prover.
Hur bereds FFPE-vävnad?
Steg för beredning av FFPE-vävnad: Noggrann hantering och bearbetning av färsk vävnad är avgörande för att framställa FFPE-prover av hög kvalitet. Att säkerställa att cellarkitektur, nukleinsyror och proteiner bevaras är nödvändigt för korrekt efterföljande analys. Varje steg – från insamling till inbäddning – kräver precision för att bibehålla provets integritet för olika analyser, inklusive histologisk undersökning, immunhistokemi och molekylära studier. När fixerings- och inbäddningsprocessen utförs korrekt säkerställer den att den bevarade vävnaden korrekt återspeglar tillståndet in vivo, vilket möjliggör tillförlitliga resultat inom diagnostik och forskning.
Vi går igenom de 6 huvudsakliga stegen i inbäddningsprocessen för FFPE-vävnadsprover.
- Vävnadsinsamling
Både biopsier från levande däggdjur och vävnadskulturer är användbara källor till färsk vävnad för beredning av FFPE-prover.
Det är viktigt att använda aseptisk teknik: Använd sterila instrument och handskar för att undvika kontaminering. Samla helst in vävnad i en steril miljö, exempelvis i en operationssal eller en LAF-bänk.
Eftersom provet är mycket ömtåligt är varsam hantering nödvändig: Minimera fördröjningar i bearbetningen och påbörja den efterföljande vävnadsbearbetningen omedelbart efter excisionen. Detta är avgörande för att förhindra autolys och nedbrytning. Håll vävnaden vid rumstemperatur; undvik frysning eftersom det kan orsaka iskristallbildning och vävnadsskador. - Vävnadsfixering
Först behandlas vävnaden med en fixeringslösning: Använd 10% neutralbuffrad formalin (NBF), vilket motsvarar 4% formaldehyd i vatten, buffrad till neutralt pH.
Sänk ned vävnaden helt i formalin. Säkerställ ett volymförhållande mellan fixeringsmedel och vävnad på minst 10:1. Fixeringstiden varierar vanligtvis från 6 till 24 timmar, beroende på vävnadstyp och storlek. Det är viktigt att fixeringsmedlet kan tränga igenom vävnaden ordentligt. Överfixering kan dock leda till tvärbindning som försvårar antigenåtervinning, medan underfixering kan resultera i dåligt bevarad vävnad. - Trimning av vävnaden
Trimma därefter vävnaden till en tjocklek på cirka 3–5 mm så att fixeringsmedlet kan tränga in tillräckligt. Säkerställ att vävnaden är korrekt orienterad för att få med relevanta histologiska strukturer. Detta underlättar extraktionsprocessen när vävnaden senare används för analys. - Bearbetning av det fixerade provet
Nu måste den fixerade vävnaden dehydreras: Efter fixeringen behöver vävnaden dehydreras för att säkerställa att paraffinvaxet tränger in ordentligt. För vävnaden genom en etanolserie med stigande koncentration (70%, 80%, 90% och 100%) för att avlägsna vatten.
Klarning med xylen: Paraffinvax är olösligt i vatten men lösligt i xylen. Därför måste vattnet i vävnaden ersättas med xylen. Xylen i sig är dock olösligt i vatten men lösligt i alkohol, vilket kräver ett mellansteg där vattnet först ersätts med alkohol. Sänk ned vävnaden i xylen eller ett xylenersättningsmedel för att avlägsna etanol och förbereda vävnaden för paraffininfiltration.
Infiltration med paraffin: Bädda in vävnaden i smält paraffinvax och säkerställ fullständig infiltration. Detta steg innefattar vanligtvis flera byten av paraffin för att säkerställa grundlig impregnering. - Inbäddning av vävnaden
I detta steg formas vävnaden till ett vävnadsblock: Placera vävnaden i en form med önskad orientering och häll smält paraffin över den. Låt paraffinet stelna genom kylning vid rumstemperatur eller på en kylplatta. - Snittning och montering
Mikrotomi: Använd en mikrotom för att skära tunna snitt (vanligtvis 4–5 mikrometer) av den inbäddade vävnaden från paraffinblocket. Därefter monteras provet genom att snitten placeras på objektglas för efterföljande färgning och mikroskopisk analys.
Kontrollera slutligen den histologiska kvaliteten: Bedöm de första snitten i mikroskop för att säkerställa korrekt fixering och bearbetning. Anpassa protokollen efter behov utifrån vävnadstyp och observerad kvalitet.
FFPE-vävnader kan användas för att utvinna RNA, DNA och proteiner samt upptäcka tecken på cancer eller annan sjukdom. De kan lagras i åratal och är en väsentlig del av hur forskare och läkare använder vävnadsprover för diagnostik och forskning.
Vilka är de vanligaste problemen och utmaningarna med FFPE-vävnad?
Formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadsprover används i stor utsträckning inom forskning och diagnostik, men medför flera utmaningar och vanliga problem:
- Nedbrytning av biomolekyler: Långvarig fixering kan leda till nedbrytning av DNA, RNA och proteiner, vilket gör det svårt att extrahera nukleinsyror eller proteiner av hög kvalitet för efterföljande tillämpningar. Korrekt fixering (där under- och överfixering undviks) är avgörande för att bevara vävnaden.
- Antigenmaskering: Fixeringsprocessen kan maskera antigena bindningsställen, vilket minskar effektiviteten hos antikroppsbindningen vid immunhistokemi och andra immunologiska analyser. Detta kräver ofta antigenåtervinning, en procedur där maskeringen av en epitop hävs och bindningen mellan epitop och antikropp återställs. Full antigenicitet kan dock inte alltid återställas.
- Varierande fixeringskvalitet: Skillnader i fixeringstider och fixeringsförhållanden kan leda till ojämn provkvalitet, vilket påverkar resultatens reproducerbarhet och jämförbarhet. Använd tillförlitliga fixeringsprotokoll och undvik under- och överfixering.
- DNA-skador och fragmentering: Formalinfixering av FFPE-prover kan orsaka olika typer av DNA-skador, inklusive deaminering av cytosin (mutationer från C till T), oxidativa skador (t.ex. 8-oxo-guanin som leder till mutationer från G till T) samt fysiska skador såsom enkelsträngsbrott, luckor och abasiska positioner som hämmar DNA-polymerasets aktivitet. Formalinfixeringsprocessen kan orsaka fragmentering av DNA, vilket försvårar genetiska och genomiska analyser såsom PCR och sekvensering.
- RNA-kvalitet: RNA som extraheras från FFPE-vävnader är ofta fragmenterat och kemiskt modifierat, vilket gör det svårt att utföra transkriptomiska analyser av hög kvalitet.
- Proteinmodifieringar: Formalin kan framkalla kemiska modifieringar i proteiner som påverkar deras struktur och funktion, vilket kan störa proteomiska analyser.
- Artefakter vid provbearbetning: Under inbäddnings- och snittningsprocessen kan mekanisk belastning och värme ge upphov till artefakter och orsaka ytterligare skador på vävnaden.
- Variation mellan provsatser: Variationer i fixerings- och inbäddningsprotokoll mellan olika provsatser kan leda till betydande variation i resultaten, vilket försvårar jämförelser mellan studier.
- Lagringsproblem: Långtidslagring av FFPE-block kan leda till ytterligare nedbrytning och förlust av nukleinsyrornas integritet över tid, vilket påverkar arkivprovernas användbarhet för retrospektiva studier.
Tvärbindning: Formalinfixering orsakar tvärbindning av proteiner och nukleinsyror, vilket kan försvåra molekylära analyser och påverka noggrannheten i immunhistokemi och andra analyser.
Användning av optimerade protokoll, varsam provhantering och tillämpning av avancerade tekniker bidrar till att förbättra kvaliteten och tillförlitligheten hos data som erhålls från FFPE-vävnader.
Vad är skillnaden mellan FFPE-vävnad och fryst vävnad?
FFPE-vävnad (formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad) bevaras genom fixering med formalin och bäddas sedan in i paraffinvax, vilket möjliggör långtidslagring i rumstemperatur med bibehållen vävnadsmorfologi. Fryst vävnad bevaras däremot snabbt genom frysning, vilket bättre bevarar nukleinsyrornas och proteinernas integritet men kräver lagring vid mycket låga temperaturer.
Vilka kemikalier används för FFPE-inbäddning?
De kemikalier som används vid FFPE-inbäddning omfattar normalt formalin för fixering och paraffinvax för inbäddning. Vid FFPE-inbäddning fixeras vävnader vanligtvis med antingen 10% (v/v) neutralbuffrat formalin (FA) eller en nyberedd 4% (w/v) formaldehydlösning (PFA) framställd av paraformaldehydpulver. Formalin, som är en lösning av formaldehyd i vatten, buffras till neutralt pH för att bevara vävnadens morfologi och förhindra alltför omfattande tvärbindning. Den paraformaldehydbaserade lösningen ger också effektiv fixering genom att tvärbinda proteiner, vilket stabiliserar vävnadsstrukturen inför efterföljande inbäddning i paraffinvax. Dessa kemikalier är avgörande för att bibehålla vävnadens integritet och morfologi under fixerings- och inbäddningsprocessen.
Hur avlägsnas paraffinet från FFPE-prover?
För att avlägsna paraffin från FFPE-prover utsätts vävnadssnitten vanligtvis för en serie xylentvättar följt av rehydrering genom en graderad serie alkoholer och slutligen vatten. Eftersom xylen är mycket giftigt och medför hälsorisker såsom luftvägsbesvär, hudirritation och potentiella långtidseffekter vid upprepad exponering, håller paraffinborttagning med ultraljud på att etableras som ett lovande alternativ i många laboratorier. Denna metod använder intensiva ultraljudsvågor för att effektivt och säkert avlägsna paraffin utan behov av giftiga lösningsmedel som xylen, vilket minskar risken för laboratoriepersonalen och skapar en säkrare arbetsmiljö.
Hur länge bör jag fixera mina vävnader för att få FFPE-prover av god kvalitet?
Allmänna rekommendationer för fixeringstid anger vanligtvis att vävnadsprover bör fixeras i formalin i 24 till 48 timmar. Denna tid är i allmänhet tillräcklig för att bevara vävnadens morfologi och cellstrukturer samtidigt som överfixering minimeras, vilken kan leda till alltför omfattande tvärbindning och nedbrytning av nukleinsyror och proteiner. Den optimala fixeringstiden kan dock variera beroende på vävnadens storlek och typ, och mindre eller ömtåligare prover kräver kortare fixeringstider. Det är avgörande att uppnå tillräcklig fixering för att förhindra autolys och nedbrytning av vävnaden samtidigt som långvarig fixering som kan försvåra efterföljande molekylära analyser undviks.