Proteomikprotokoll: Kontaktfri sonikering förbättrar beredningen av peptidprover för MS
Bottom-up-proteomik har blivit en hörnsten inom modern biomarkörupptäckt, strukturbiologi och klinisk diagnostik. Genom att spjälka proteiner till peptider före analys med masspektrometri (MS) kan forskare uppnå större sekvenstäckning och mer tillförlitlig kvantifiering. Beredning av biologiska prover med hög komplexitet för MS är dock fortfarande tekniskt krävande. Nya metodologiska framsteg visar hur kontrollerad ultraljudsbehandling – särskilt med den kontaktfria flerrörssonikatorn VialTweeter och mikroplattssonikatorn UIP400MTP – avsevärt kan effektivisera detta arbetsflöde, förbättra reproducerbarheten och förebygga vanliga flaskhalsar i instrumentanvändningen.
Här finns ett detaljerat protokoll för provberedning för att erhålla peptider av lämplig storlek för analys med MS.
Vilka bör använda kontaktfri sonikering för beredning av peptidprover?
- Laboratorier för bottom-up-proteomik och upptäcktsforskning: Forskare som bereder prover med hög komplexitet för LC-MS- eller MALDI-arbetsflöden och behöver ett konsekvent, högt peptidutbyte från olika biologiska matriser.
- Användare av S-Trap™ och suspensionsinfångning: Team som använder rening med mikrokolonner och behöver kontrollerad DNA-skjuvning för att förhindra igensättning av kolonnerna och säkerställa smidig provapplicering och spjälkning.
- Kliniska och translationella forskargrupper: Laboratorier som bearbetar vävnad, celler, plasma, serum eller cerebrospinalvätska och där reproducerbarhet mellan provsatser och provintegritet är avgörande.
- Team för kvantitativ och riktad MS: Laboratorier som utför rigorösa jämförande studier där sondsonikatorer medför risker för korskontaminering som skulle kunna äventyra kvantifieringen av peptider med låg förekomst.
- Centralfaciliteter och verksamheter med hög provgenomströmning: Grupper som bearbetar flera biologiska replikat samtidigt och drar nytta av blocksonikering av flera slutna rör med VialTweeter, vilket eliminerar behovet av sondrengöring, minskar den manuella arbetstiden och upprätthåller aseptiska förhållanden.
- Forskare inom PTM och proteinstruktur: Forskare som behöver skonsam, temperaturkontrollerad behandling för att bevara labila modifieringar och maximera sekvenstäckningen under cellys och homogenisering.
Flerprovssonikatorn ”VialTweeter” för kontaktfri provberedning av flera förslutna provflaskor för proteomik
Protokollöversikt: Från vävnad och celler till peptider redo för MS
Det allmänt använda arbetsflödet för bottom-up-proteomik som beskrivs av Wojtkiewicz et al. erbjuder en robust, skalbar metod för beredning av peptidprover från olika biologiska matriser. Med utgångspunkt i 50–100 mg snabbfryst vävnad eller 1–20 miljoner celler integrerar protokollet teknik för suspensionsinfångning (S-Trap™) för att effektivt avlägsna detergenter, salter och föroreningar före enzymatisk spjälkning.
Efter lys, proteinkvantifiering, reduktion och alkylering surgörs provet och appliceras på en S-Trap™-spinnkolonn där spjälkning med trypsin/lysC sker. De resulterande peptiderna elueras, torkas och analyseras med LC-MS. När detta arbetsflöde tillämpas på 50 mg human hjärtvävnad ger det konsekvent tillräckligt med peptider för 30–40 injektioner, med identifiering av över 4 000 unika proteiner per körning. Även om kemin och den kolonnbaserade reningen är väldefinierade beror arbetsflödets framgång i hög grad på de inledande stegen för fysisk sönderdelning och DNA-hantering.
Protokollet rekommenderar användning av flerrörssonikatorn VialTweeter för att lysera cellerna och skjuva DNA med sonikering – båda stegen är avgörande för peptidanalys.
VialTweeter sonikerar förslutna Eppendorf-rör på 1,0, 1,5 och 2,0mL samt olika NUNC-provflaskor
Ultraljudslys av celler och vävnad för proteinextraktion
I arbetsflödet för bottom-up-proteomik är ultraljudsbehandling ett centralt steg vid lysering av cellprover för att extrahera proteiner för efterföljande masspektrometrisk analys. Efter tillsats av SDS-celllysbuffert till cellpelleten ultraljudsbehandlas proverna med VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Protokollet använder 1,5 mL mikrocentrifugrör och anger att sonikatorn ska köras vid 30% effekt i 10 sekunder med ultraljudet på och 10 sekunder med ultraljudet av, upprepat under 3 cykler. Efter en väntetid på 1 minut upprepas cykeln ytterligare två gånger. Proverna kyls kontinuerligt med is.
Denna process bidrar inte bara till att sönderdela cellerna utan är särskilt nödvändig för att skjuva det genomiska DNA som frigörs vid lyseringen. Effektiv DNA-skjuvning är avgörande för att minska provets viskositet och förhindra igensättning av S-Trap™-kolonnerna, vilket säkerställer optimalt proteinutbyte och tillförlitlig efterföljande proteolytisk nedbrytning till peptider.
Den avgörande rollen för DNA-skjuvning med ultraljud
Ett av de vanligaste problemen i S-Trap™-baserade arbetsflöden är igensättning av kolonner, som nästan uteslutande orsakas av genomiskt DNA med hög molekylvikt som frigörs vid homogenisering av celler eller vävnad. Intakt DNA ökar provets viskositet dramatiskt, fångar peptider och blockerar den mikroporösa sorbentbädden i S-Trap™.
Ultraljudsbehandling löser detta problem genom att mekaniskt fragmentera DNA till små, lösliga fragment. Genom att tillföra kontrollerad akustisk energi skjuvar VialTweeter effektivt nukleinsyror utan att generera alltför mycket värme eller tillföra främmande föroreningar. Denna viskositetsminskning säkerställer smidig provladdning, jämna genomflödeshastigheter och oavbruten nedbrytningskinetik.
Optimerade parametrar för ultraljudsbehandling med VialTweeter
Protokollet anger ett mycket reproducerbart ultraljudsbehandlingsschema som är optimerat för biologiska provers integritet och kompatibilitet med efterföljande MS-analys. För prover i 1,5mL mikrocentrifugrör som behandlas med den kontaktfria blocksonikatorn Hielscher VialTweeter ger följande parametrar lysering och optimal DNA-skjuvning samtidigt som proteinstrukturen bevaras:
- Amplitud: 30% effekt
- Cykelmönster: 10 sekunder PÅ / 10 sekunder AV
- Varaktighet: 3 cykler (10sec PÅ/10sec AV) → 1 minuts vila på is → upprepa ytterligare 2 gånger
- Temperaturkontroll: Proverna placeras på is under behandlingen för att förhindra termisk denaturering och för tidig enzymaktivitet
Denna pulsade ultraljudsbehandling förhindrar lokal överhettning, minimerar peptidoxidation och säkerställer enhetlig akustisk exponering i samtliga provrör. Uppställningen med slutna rör eliminerar också behovet av att rengöra sonden mellan proverna, vilket drastiskt minskar den manuella arbetstiden och variationen mellan operatörer.
Viktiga fördelar för moderna arbetsflöden inom proteomik
Att integrera VialTweeter i ditt arbetsflöde för bottom-up-proteomik ger flera praktiska och vetenskapliga fördelar:
- Enhetlig DNA-fragmentering: Enhetlig tillförsel av akustisk energi till samtliga provrör säkerställer reproducerbar viskositetsminskning och förhindrar variation mellan provomgångar vid laddning av S-Trap™.
- Bevarande av labila modifieringar: Behandling vid låg temperatur i ett isbad skyddar posttranslationella modifieringar (PTM) och förhindrar värmeinducerad proteinaggregation under celllysering.
- Effektiviserad efterföljande bearbetning: Lysat som behandlats med VialTweeter kan klaras direkt genom centrifugering och kvantifieras utan ytterligare reningssteg, vilket påskyndar vägen till proteolytisk nedbrytning i S-Trap™.
- Skalbarhet och flexibilitet: Samma inställningar för ultraljudsbehandling gäller för både vävnadsprover med hög komplexitet och cellsuspensioner, vilket stöder arbetsflöden för upptäckande proteomik, riktad kvantifiering och glykoproteomik. Hielschers mikroplattsonikatorer möjliggör enkel uppskalning till stora antal prover i flerbrunnsplattor.
Den kontaktfria VialTweeter Multi-Tube Sonicator kan användas i kylskåp
Sonikatorer för provberedning inom proteomik
Att bereda peptidprover av hög kvalitet för masspektrometri kräver mer än effektiv lys – det kräver noggrann kontroll över DNA-skjuvning, temperatur och förebyggande av kontaminering. Genom att integrera Hielscher VialTweeter i ditt arbetsflöde för bottom-up-proteomik kan du eliminera igensättning av S-Trap™, säkerställa reproducerbart proteinutbyte och upprätthålla den renhet som krävs för känsliga MS-analyser. Oavsett om du bearbetar human vävnad, odlade celler eller komplexa lysat ger ultraljudsbehandling i block den tillförlitlighet, skalbarhet och processkontroll som moderna proteomiklaboratorier kräver.
För att skala upp till ett större antal prover kan du använda Hielschers fokuserade, beröringsfria ultraljudsapparater för mikroplattor, modellerna UIP400MTP och UIP550MTP! Bearbeta valfri standardplatta med flera brunnar för proteomik med hög provgenomströmning!
Bearbetning i slutna rör jämfört med traditionella ultraljudsapparater med sond
Traditionellt har forskare använt ultraljudsapparater med sond i direktkontakt med provet för DNA-skjuvning. Även om sondsystem är effektiva medför de flera kritiska begränsningar i proteomikarbetsflöden:
- Risk för korskontaminering: Återanvändning av en sond i flera prover orsakar överföring via aerosoler och tillför föroreningar från andra prover som snedvrider kvantitativa MS-resultat.
- Provförlust: Direkt införande kan leda till stänk, avdunstning och att värdefulla peptider fastnar på sondens yta.
- Rengöring: Noggrann dekontaminering av sonden mellan körningar är tidskrävande och ofta ofullständig, vilket äventyrar studier av proteiner med låg förekomst.
VialTweeter-ultraljudsapparaten med block bearbetar prover helt inuti förslutna mikrocentrifugrör. Denna konstruktion med ett slutet system eliminerar kontakt mellan sond och prov, förhindrar aerosolbildning och upprätthåller strikt aseptiska förhållanden under hela homogeniseringen och lysen. För laboratorier som bearbetar vävnadslysat med hög komplexitet eller flera cellinjer innebär detta renare MS-data, högre peptidutbyte och mer tillförlitliga biologiska replikat.
Uppskalning till provberedning med hög provgenomströmning i plattor med flera brunnar
Med ultraljudsapparaterna för mikroplattor, modellerna UIP400MTP och UIP550MTP, kan bearbetningen i rör enkelt skalas upp till provbearbetning med hög provgenomströmning i valfri standardplatta med flera brunnar.
Ultraljudsapparaten UIP400MTP för plattor med flera brunnar för proteinextraktion från prover med hög provgenomströmning
Vanliga frågor om ultraljudsbehandling vid beredning av peptidprover
Varför krävs ultraljudsbehandling före bearbetning av peptider med S-Trap™?
Ultraljudsbehandling är nödvändig för att skjuva genomiskt DNA med hög molekylvikt som frigörs vid cell- eller vävnadslys. Intakt DNA ökar provets viskositet drastiskt, vilket kan sätta igen S-Trap™-mikrokolonnen och fånga peptider, så att utbytet och kompatibiliteten med MS försämras avsevärt.
Hur förbättrar VialTweeter-ultraljudsapparaten med block provberedningen jämfört med traditionella ultraljudsapparater med sond?
Till skillnad från ultraljudsapparater med sond i direktkontakt med provet, som kräver noggrann rengöring mellan körningar och medför risk för överföring via aerosoler, bearbetar VialTweeter prover helt inuti förslutna provflaskor och mikrocentrifugrör. Denna konstruktion med slutna rör eliminerar korskontaminering, förhindrar provförlust och upprätthåller strikt aseptiska förhållanden under hela homogeniseringen och celllysen.
Vilka är de optimala parametrarna för ultraljudsbehandling vid provberedning för proteomik?
För biologiska prover som celler och vävnader används enligt det rekommenderade protokollet en VialTweeter-ultraljudsapparat vid 30% effekt med en cykel på 10 sekunder på / 10 sekunder av, som upprepas 3 gånger. Proverna bör hållas på is under bearbetningen, och cykeln bör upprepas ytterligare två gånger vid bearbetning av ≥5 miljoner celler. (jfr Wojtkiewicz et al., 2021)
Vad ska jag göra om min S-Trap™-kolonn sätts igen vid provappliceringen?
Igensättning av kolonnen orsakas vanligtvis av hög DNA-viskositet eller otillräcklig klarning. För att lösa detta ska du centrifugera lysatet grundligt före pipettering och säkerställa att DNA är tillräckligt skjuvat genom ultraljudsbehandling.
Hur gynnar beröringsfri ultraljudsbehandling arbetsflöden för kvantitativ proteomik?
I kvantitativa studier kan även spår av korskontaminering mellan prover snedvrida mätningar av peptider med låg förekomst. VialTweeters bearbetning av flera prover i förslutna rör eliminerar införandet av en sond, säkerställer reproducerbarhet mellan provomgångar och bevarar provintegriteten för noggranna jämförande analyser.
Vilket proteinutbyte och vilket analysdjup med MS kan jag förvänta mig av detta protokoll?
Med 50 mg human hjärtvävnad eller 5 miljoner celler som utgångsmaterial ger S-Trap™-arbetsflödet vanligtvis tillräckligt med peptider för 30–50 LC-MS-injektioner, och över 4 000 unika proteiner identifieras konsekvent per körning. (jfr Wojtkiewicz et al., 2021)
Litteratur / Referenser
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics tillhandahåller kraftfulla beröringsfria ultraljudsapparater för provberedning och klinisk analys. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor, VialTweeter, CupHorn och genomflödesultraljudsapparaten GDmini2 bearbetar proverna utan att vidröra dem.