Proteomikprotokoll: Beröringsfri ultraljudsbehandling förbättrar framställningen av peptidprover för masspektrometri

Bottom-up-proteomik har blivit en hörnsten inom modern upptäckt av biomarkörer, strukturbiologi och klinisk diagnostik. Genom att bryta ned proteiner till peptider före masspektrometrianalys (MS) kan forskare uppnå en djupare sekvens täckning och en mer tillförlitlig kvantifiering. Att förbereda biologiska prover med hög komplexitet för MS är dock fortfarande tekniskt krävande. De senaste metodologiska framstegen visar hur kontrollerad ultraljudsbehandling – särskilt med den beröringsfria ultraljudsapparaten VialTweeter Multi-Tube och mikroplattultraljudsapparaten UIP400MTP – kan avsevärt effektivisera detta arbetsflöde, förbättra reproducerbarheten och förebygga vanliga flaskhalsar i instrumenteringen.
Här hittar du ett detaljerat protokoll för provberedning för att erhålla peptider av lämplig storlek för analys med masspektrometri.

Vem bör använda beröringsfri ultraljudsbehandling vid framställning av peptidprover?

• Proteomik med bottom-up-metoden & Discovery Labs: Forskare som förbereder mycket komplexa prover för LC-MS- eller MALDI-arbetsflöden och som behöver en jämn peptidutvinning med hög utbyte från olika biologiska matriser.
• S-Trap™ & Användare som fastnar i avstängningen: Team som använder rening med mikrokolonner och som behöver en kontrollerad DNA-fragmentering för att förhindra att kolonnerna täpps till och för att säkerställa en smidig provpåfyllning och nedbrytning.
• klinisk & Grupper för translationell forskning: Laboratorier som hanterar vävnad, celler, plasma, serum eller cerebrospinalvätska, där reproducerbarhet mellan olika satser och provets integritet är av avgörande betydelse.
• Kvantitativ & Målgrupper för MS Teams: Laboratorier som genomför noggranna jämförande studier där ultraljudsapparater med återanvändbara sonder medför risker för korskontaminering som kan äventyra kvantifieringen av peptider med låg förekomst.
• Gemensamma resurser & Verksamhet med hög genomströmning: Grupper som bearbetar flera biologiska replikat samtidigt och som har nytta av ultraljudsbehandling i slutna rör i block med VialTweeter, vilket eliminerar behovet av rengöring av sonden, minskar den manuella arbetstiden och upprätthåller aseptiska förhållanden.
• Föräldra- och lärarmöte & Forskare inom strukturproteiner: Forskare som behöver en skonsam, temperaturreglerad bearbetning för att bevara labila modifieringar och maximera sekvenstäckningen under celllysering och homogenisering.

Översikt över protokollet: Från vävnad och celler till peptider som är klara för MS-analys

Det allmänt använda bottom-up-proteomikflödet som beskrivs av Wojtkiewicz m.fl. erbjuder en robust och skalbar metod för framställning av peptidprover från olika biologiska matriser. Med utgångspunkt i 50–100 mg snabbfryst vävnad eller 1–20 miljoner celler integrerar protokollet S-Trap™-tekniken för att effektivt avlägsna detergenter, salter och föroreningar före enzymatisk nedbrytning.
Efter lysering, proteinkvantifiering, reduktion och alkylering försuras provet och laddas på en S-Trap™-centrifugkolonn där trypsin/lysC-nedbrytning sker. De resulterande peptiderna elueras, torkas och analyseras med LC-MS. När denna arbetsprocess tillämpas på 50 mg mänsklig hjärtvävnad ger den konsekvent tillräckligt med peptider för 30–40 injektioner, vilket möjliggör identifiering av över 4 000 unika proteiner per körning. Även om kemin och den kolonnbaserade reningen är väldefinierade beror framgången för arbetsflödet i hög grad på de inledande stegen med fysisk uppbrytning och hantering av DNA.
I protokollet rekommenderas användning av VialTweeter Multi-Tube Sonicator för ultraljudsbehandling i syfte att lysera cellerna och bryta ned DNA – Båda stegen är avgörande för peptidanalysen.

Ultraljudslysering av celler och vävnad för proteinextraktion

I det bottom-up-baserade proteomikflödet är ultraljudsbehandling ett viktigt steg i lyseringen av cellprover för att extrahera proteiner inför efterföljande masspektrometrianalys. Efter tillsats av SDS-celllyseringsbuffert till cellpelleten utsätts proverna för ultraljudsbehandling med hjälp av VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Protokollet använder 1,5 ml mikrocentrifugrör och anger att ultraljudsbehandlaren ska köras med 30 % effekt i 10 sekunder på och 10 sekunder av, vilket upprepas i tre cykler. Efter en minuts väntetid upprepas cykeln ytterligare två gånger. Proverna kyls kontinuerligt med is.
Denna process bidrar inte bara till att bryta ned cellerna, utan är också nödvändig för att skära upp det genomiska DNA som frigörs under lyseringen. En effektiv uppskärning av DNA är avgörande för att minska provets viskositet och förhindra igensättning av S-Trap™-kolonnerna, vilket säkerställer optimal proteinutvinning och tillförlitlig peptidnedbrytning i efterföljande steg.

Den avgörande betydelsen av DNA-fragmentering med ultraljud

Ett av de vanligaste felen i arbetsflöden som bygger på S-Trap™ är att kolonnen sätts igen, vilket nästan uteslutande orsakas av genom-DNA med hög molekylvikt som frigörs vid homogenisering av celler eller vävnad. Intakt DNA ökar provets viskositet avsevärt, fångar upp peptider och blockerar det mikroporösa S-Trap™-sorbentlagret.
Ultraljudsbehandling löser detta problem genom att mekaniskt bryta ned DNA till små, lösliga fragment. Genom att tillföra kontrollerad akustisk energi skär VialTweeter effektivt ned nukleinsyrorna utan att alstra överdriven värme eller tillföra främmande föroreningar. Denna minskning av viskositeten säkerställer smidig provpåfyllning, jämna genomströmningshastigheter och en oavbruten nedbrytningskinetik.

Optimerade ultraljudsparametrar för VialTweeter

Protokollet beskriver ett mycket reproducerbart ultraljudsbehandlingsförfarande som är optimerat för att bevara biologiska provs integritet och säkerställa kompatibilitet med efterföljande masspektrometri (MS). För prover i 1,5 ml mikrocentrifugrör som behandlas med den beröringsfria blockultraljudsapparaten Hielscher VialTweeter ger följande parametrar lysering och optimal DNA-fragmentering samtidigt som proteinstrukturen bevaras:

• Amplitud: 30 % effekt
• Cykelmönster: 10 sekunder PÅ / 10 sekunder AV
• Varaktighet: 3 cykler (10 sekunder PÅ/10 sekunder AV) → 1 minuts vila på is → upprepa ytterligare 2 gånger
• Temperaturhantering: Proverna placeras på is under bearbetningen för att förhindra termisk denaturering och för tidig enzymaktivitet

Denna metod med pulserande ultraljudsbehandling förhindrar lokal överhettning, minimerar oxidationen av peptider och säkerställer en jämn akustisk exponering i alla provrör. Uppställningen med slutna rör eliminerar dessutom behovet av att rengöra sonden mellan proverna, vilket drastiskt minskar den manuella arbetstiden och variationen mellan olika operatörer.

Viktiga fördelar för moderna proteomikarbetsflöden

Att integrera VialTweeter i er bottom-up-proteomikprocess ger flera praktiska och vetenskapliga fördelar:

1. Konsekvent DNA-fragmentering: En jämn tillförsel av akustisk energi till alla ampuller säkerställer en reproducerbar viskositetsminskning och förhindrar variationer mellan olika satser vid fyllning av S-Trap™.
2. Bevarande av labila modifieringar: Bearbetning vid låg temperatur i ett isbad skyddar posttranslationella modifieringar (PTM) och förhindrar värmeinducerad proteinaggregering under celllys.
3. Effektiviserad efterbearbetning: Lysat som bearbetats med VialTweeter kan direkt renas genom centrifugering och kvantifieras utan ytterligare reningssteg, vilket påskyndar processen fram till S-Trap™-nedbrytning.
4. Skalbarhet & Flexibilitet: Samma ultraljudsinställningar gäller både för vävnadsprover med hög komplexitet och för cellsuspensioner, vilket underlättar arbetsflöden inom upptäcktsproteomik, målinriktad kvantifiering och glykoproteomik. Hielschers ultraljudsenheter för mikroplattor möjliggör enkel uppskalning till stora provvolymer i flerhålsplattor.

Litteratur / Referenser