Ultraljudsbehandling i mikroplattor inom shotgun-proteomik – applikationsnot

Shotgun-proteomik är beroende av effektiv, reproducerbar provberedning för att omvandla komplext biologiskt material till peptider som är redo för LC-MS/MS. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för mikroplattor stöder denna process genom att möjliggöra standardiserad, parallell ultraljudsbehandling av prover med liten volym, vilket hjälper laboratorier att förbättra sönderdelning, extraktion och återupplösning i mikroplattbaserade arbetsflöden. Denna applikationsnot beskriver hur UIP400MTP kan integreras i provberedning för proteomik, med ett publicerat arbetsflöde för extracellulära vesiklar från PLA2G12A/Th17-studier som ett laboratorietestat exempel.

Ultraljudsbehandling i mikroplattor för mer reproducerbar shotgun-proteomik

För proteomikforskare är reproducerbar provberedning avgörande för LC-MS/MS-data av hög kvalitet. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för mikroplattor stöder standardiserad, parallell ultraljudsbehandling i plattbaserade arbetsflöden och arbetsflöden med små provvolymer och högt provgenomflöde.

Den är särskilt användbar för laboratorier som arbetar med:

• Stora provserier som kräver enhetlig bearbetning i många brunnar
• Material som finns i begränsad mängd, där provförlust och variation måste minimeras
• Lipidrika prover, såsom extracellulära vesiklar
• Komplexa biologiska preparat som kräver effektiv sönderdelning, extraktion eller återupplösning
• Jämförande shotgun-proteomik, där reproducerbarhet mellan betingelser och replikat är väsentlig

Genom att integrera ultraljudsbehandling i mikroplattor före spjälkning kan forskare göra proverna bättre förberedda för:

• Proteinextraktion och återupplösning
• Spjälkning med trypsin/Lys-C
• Datainsamling med nano-LC/MS/MS
• Efterföljande kvantitativ proteomikanalys

Ultraljudsbehandling i mikroplattor kan vara till nytta för:

• Gemensamma serviceenheter för proteomik
• Forskningslaboratorier för EV
• Laboratorier för immunologi och cellbiologi
• Translationella forskargrupper
• Team inom livsvetenskap som skalar upp från beredning av enstaka prover till arbetsflöden med högre provgenomflöde

Provberedning med högt provgenomflöde för proteomanalys av extracellulära vesiklar

Vad är shotgun-proteomik?

Shotgun-proteomik har blivit en central analytisk strategi för att karakterisera komplexa biologiska prover, från helcellslysat och vävnadsextrakt till renade organeller, extracellulära vesiklar och kliniska prover med liten materialmängd. Dess främsta styrka ligger i kombinationen av proteinspjälkning, högupplösande vätskekromatografi kopplad till tandemmasspektrometri och beräkningsbaserad inferens från peptider till proteiner. Kvaliteten på den slutliga proteomdatamängden avgörs dock långt innan provet når masspektrometern. Effektiv sönderdelning av prover, solubilisering av proteiner, avlägsnande av störande ämnen, reproducerbar enzymatisk spjälkning och robust peptidutbyte är alla avgörande för täckningsdjupet och den kvantitativa tillförlitligheten.
För proteomikforskare och laboratorier inom livsvetenskap som arbetar med begränsade mängder prover eller värdefulla prover är provberedningen ofta flaskhalsen.

Utmaningen med extracellulära vesiklar inom proteomik

Extracellulära vesiklar (EV) utgör till exempel en särskilt krävande provklass. De är membranbundna, lipidrika partiklar i nanoskala med relativt lågt proteinutbyte och stor risk för överföring av lipider, salter, detergenter, serumproteiner och andra matriskomponenter till efterföljande steg. Dessa egenskaper kan störa digereringseffektiviteten, den kromatografiska prestandan, elektrosprayens stabilitet och peptididentifieringen. Ett provberedningsarbetsflöde för EV-proteomik måste därför vara tillräckligt kraftfullt för att bryta upp vesikelstrukturer och solubilisera deras proteininnehåll, samtidigt som det förblir kompatibelt med efterföljande enzymatisk digerering och LC-MS/MS-analys.
I detta sammanhang erbjuder ultraljudsbehandling som är kompatibel med mikroplattor en praktisk metod för reproducerbar, parallelliserad provbearbetning. Hielschers mikroplattsonikatorer UIP400MTP (400 W) och UIP550MTP (550 W) är utformade för sonikering av prover i flerbrunnsplattor och kärl för små volymer och möjliggör arbetsflöden med högre provgenomströmning än konventionella sonikatorer med en enda sond. För proteomiklaboratorier är detta format attraktivt eftersom det kan minska variationen vid manuell hantering, förbättra parallell behandling av flera prover och integreras mer naturligt i plattbaserade provberedningsflöden.

Exempel på arbetsflöde

Ett aktuellt arbetsflöde för proteomik av extracellulära vesiklar inom PLA2G12A-driven Th17-cellbiologi ger ett användbart, laboratorietestat exempel på hur mikroplattsonikatorn UIP400MTP kan införlivas i provberedning för shotgunproteomik. I denna studieserie bearbetades EV-prover för proteomanalys med metanolbehandling, sonikering med UIP400MTP, centrifugering, torkning, digerering med trypsin/Lys-C och vätskekromatografi med nanoflöde kopplad till högupplösande tandem-MS. Det biologiska arbetet rapporterades 2026 av Mochizuki-Ono och kollegor, där proteomikanalysen bidrog till att karakterisera hur PLA2G12A förändrar proteininnehållet i EV i samband med patogena T-cellsresponser.

Sonikator för flerbrunnsplattor UIP400MTP

Varför ultraljudsbehandling i mikroplattor?
UIP400MTP möjliggör standardiserad, parallell ultraljudsbehandling av prover med liten volym. Detta är användbart när reproducerbarhet, liten provmängd och hög provgenomströmning vid bearbetning av flera prover är viktiga.


Checklista för kvalitetskontroll

• Bekräfta att EV-mängden motsvarar samma proteinmängd i alla prover.
• Använd randomiserade eller balanserade provplaceringsscheman för provbearbetningen.
• Håll metanolvolym, ultraljudsbehandlingstid, torkningstid och spjälkningsvolym konstanta.
• Övervaka peptidutbytet och det totala antalet proteinidentifieringar.
• Kontrollera andelen missade klyvningar och peptidernas längdfördelning.
• Granska de kromatografiska topparnas form och retentionstidernas reproducerbarhet.
• Inkludera blankprover för att övervaka överföring mellan prover.
• Använd poolade QC-prover för större studier.
• Utvärdera variationskoefficienten mellan replikat.
• Använd PCA eller liknande metoder för att identifiera batcheffekter eller avvikande prover.

Rekommendationer för dokumentation

Vid publicering eller dokumentation av detta arbetsflöde ska följande anges: EV-provmängd, plattformat, metanolvolym, amplitud och ultraljudsbehandlingstid för UIP400MTP, centrifugeringsförhållanden, torkningsmetod, spjälkningsbuffert, enzymkoncentration, spjälkningstid, surgörningsförhållanden, LC-MS/MS-plattform, datainsamlingsläge, programvaruversion, databas, FDR-tröskelvärde, normaliseringsmetod och statistiskt arbetsflöde.
Alla Hielschers mikroplattsonikatorer registrerar automatiskt viktiga processparametrar såsom amplitud, sonikeringstid och temperatur med datum- och tidsstämpel som en CVS-fil på det integrerade SD-kortet. Dataloggning för reproducerbarhet och kvalitetskontroll har aldrig varit enklare!

Studien i detalj: shotgunproteomik av EV i PLA2G12A-studien

PLA2G12A-studien ger ett konkret exempel på användning av UIP400MTP i ett arbetsflöde för shotgunproteomik. Den biologiska frågeställningen var hur det utsöndrade fosfolipaset PLA2G12A modifierar extracellulära vesiklar från Th17-celler och därigenom påverkar patogen T-cellsdifferentiering. Författarna visade att PLA2G12A verkar på EV-membran och bildar lysofosfolipider, däribland 1-oleoyl-lysofosfatidyletanolamin, och att efterföljande signalering med lysofosfatidsyra via LPA2 bidrar till Th17-differentiering. Utöver lipidsignalering undersökte studierna även innehållet i EV, inklusive RNA- och proteininnehåll, vilket gjorde shotgunproteomik till en viktig del av karakteriseringsstrategin.
I arbetsflödet för EV-beredning odlades Th17-celler i medium som innehöll fetalt bovint serum från vilket exosomer hade avlägsnats. Odlingssupernatanterna centrifugerades först för att avlägsna celler, filtrerades genom ett 0,22 µm-filter, koncentrerades genom ultrafiltrering/ultracentrifugering, tvättades, resuspenderades i PBS och kvantifierades med en BCA-proteinanalys. Denna inledande EV-beredning säkerställde att en definierad mängd EV-material, uttryckt i proteinekvivalenter, kunde föras vidare till proteomikarbetsflödet.
För analys med shotgunproteomik använde författarna EV-prover motsvarande 5 µg proteinekvivalenter. Dessa prover torkades i PCR-rör och 25 µL metanol tillsattes. Proverna sonikerades sedan i 3 minuter med mikroplattsonikatorn UIP400MTP. Efter sonikeringen centrifugerades proverna vid 4°C i 20 minuter vid 19 000 × g. Efter att 20 µL supernatant hade avlägsnats centrifugerades proverna till torrhet. Proteinerna löstes därefter upp genom sonikering i 4 µL trypsin/Lys-C-lösning med koncentrationen 100 ng/µL i 50 mM ammoniumbikarbonat. Spjälkningen utfördes i 2 timmar vid 37°C under skakning vid 300 rpm. Spjälkningsblandningen surgjordes med 1 µL 1,25% trifluorättiksyra och analyserades med LC med nanoflöde kopplad till högupplösande tandemmasspektrometri.
Detta arbetsflöde belyser flera användbara principer för EV-proteomik med liten utgångsmängd. För det första normaliserades utgångsmängden efter proteinekvivalenter, vilket är viktigt när EV från olika genotyper eller behandlingar jämförs. För det andra användes metanol före sonikeringen, vilket främjade sönderdelning och extraktion samtidigt som detergentsystem som kan försvåra LC-MS/MS undveks. För det tredje var sonikeringssteget kort och standardiserat, vilket är förenligt med parallell provbearbetning. För det fjärde utfördes trypsin/Lys-C-spjälkningen i en mycket liten volym, vilket minskade utspädningen och främjade peptidåtervinningen vid liten utgångsmängd. Slutligen minimerade den direkta övergången från spjälkning till surgörning och LC-MS/MS onödiga hanteringssteg.
Den efterföljande LC-MS/MS-metoden använde omvänd fasseparation med nanoflöde kopplad till en Q-Exactive HF Orbitrap-masspektrometer. Proverna fångades upp på en C18-förkolonn och separerades sedan på en analytisk kolonn med 50 µm innerdiameter vid 200 nL/min och 40°C. Gradienten gick från låg halt organiskt lösningsmedel till 35% lösningsmedel B under 60 minuter, följt av tvättning med hög halt organiskt lösningsmedel och återekvilibrering. MS-datainsamlingen utfördes i positivt jonläge med dataoberoende datainsamling och kollisionsinducerad dissociation vid högre energi. DIA-råfiler analyserades med DIA-NN 1.8 med ett spektralbibliotek predikterat in silico.