Ultraljudsbehandling av mikroplattor inom shotgun-proteomik – Användningsanvisning

Shotgun-proteomik är beroende av ett effektivt och reproducerbart provförberedelseförfarande för att omvandla komplext biologiskt material till peptider som är klara för LC-MS/MS-analys. Mikrotiterplattsonikatorn UIP400MTP stödjer denna process genom att möjliggöra standardiserad, parallell sonikering av prov med liten volym, vilket hjälper laboratorier att förbättra uppbrytningen, extraktionen och återlösningen i mikrotiterplattbaserade arbetsflöden. Denna applikationsnot beskriver hur UIP400MTP kan integreras i proteomisk provberedning, med ett publicerat arbetsflöde för extracellulära vesiklar från PLA2G12A/Th17-studier som ett laboratorietestat exempel.

Ultraljudsbehandling av mikroplattor för mer reproducerbar shotgun-proteomik

För proteomikforskare är reproducerbar provberedning avgörande för att uppnå LC-MS/MS-data av hög kvalitet. Mikrotallriksultraljudsapparaten UIP400MTP möjliggör standardiserad, parallell ultraljudsbehandling i arbetsflöden som bygger på mikrotallrikar samt i arbetsflöden med små volymer och hög genomströmning.

Det är särskilt användbart för laboratorier som arbetar med:

• Stora provuppsättningar som kräver enhetlig bearbetning i många brunnar
• Material med begränsad tillförsel, där provförlust och variabilitet måste minimeras
• Fettrika prover, såsom extracellulära vesiklar
• Komplexa biologiska preparat som kräver effektiv uppbrytning, extraktion eller återlösning
• Jämförande shotgun-proteomik, där reproducerbarhet mellan olika förhållanden och replikat är avgörande

Genom att integrera ultraljudsbehandling av mikroplattor före nedbrytningen kan forskarna förbättra provens lämplighet för:

• Proteinextraktion och återlösning
• Trypsin-/Lys-C-nedbrytning
• Datainsamling med Nano-LC/MS/MS
• Kvantitativ proteomikanalys i senare steg

 

Skala upp din proteomik-provberedning med fullt förtroende!
Läs mer om hur ultraljudsbehandling av mikroplattor bidrar till att minska variationen vid manuell hantering, förbättra provuppbrytningen och förbereda komplexa biologiska prover för tillförlitlig LC-MS/MS-analys.

Begäran om information


E-postadress (obligatoriskt)


Produkt eller intresseområde



Jag godkänner integritetspolicyn









Begär information

Ultraljudsbehandling av mikroplattor kan vara till nytta vid:

• Kärnanläggningar för proteomik
• Forskningslaboratorier för elfordon
• Laboratorier för immunologi och cellbiologi
• Grupper inom translationell forskning
• Team inom biovetenskap som utökar sin verksamhet från beredning av enstaka prover till arbetsflöden med högre genomströmning

Provberedning med hög genomströmning för proteomanalys av extracellulära vesiklar

Vad är Shotgun-proteomik?

Shotgun-proteomik har blivit en central analysstrategi för att karakterisera komplexa biologiska prover, från helcellslysater och vävnadsextrakt till renade organeller, extracellulära vesiklar och kliniska prover med låg ingångsmängd. Dess främsta styrka ligger i kombinationen av proteinnedbrytning, högupplöst vätskekromatografi-tandemmasspektrometri och datorbaserad inferens från peptider till proteiner. Kvaliteten på den slutliga proteomdatauppsättningen avgörs dock långt innan provet når masspektrometern. Effektiv provuppbrytning, proteinsolubilisering, avlägsnande av störande ämnen, reproducerbar enzymatisk nedbrytning och robust peptidåtervinning är alla avgörande för täckningsdjupet och den kvantitativa tillförlitligheten.
För proteomikforskare och laboratorier inom biovetenskap som arbetar med begränsade eller värdefulla prover utgör provberedningen ofta en flaskhals.

Utmaningen med extracellulära vesiklar inom proteomik

Extracellulära vesiklar (EV) utgör till exempel en särskilt krävande provklass. De är membranbundna, lipidrika partiklar i nanoskala med relativt låg proteinutbyte och en hög risk för överföring av lipider, salter, detergenter, serumproteiner och andra matriskomponenter. Dessa egenskaper kan påverka nedbrytningseffektiviteten, kromatografisk prestanda, elektrospraystabilitet och peptididentifiering negativt. Ett arbetsflöde för beredning inom EV-proteomik måste därför vara tillräckligt kraftfullt för att bryta ned vesikelstrukturerna och lösa upp proteininnehållet, samtidigt som det förblir kompatibelt med efterföljande enzymatisk nedbrytning och LC-MS/MS-analys.
I detta sammanhang erbjuder ultraljudsbehandling som är kompatibel med mikroplattor en praktisk metod för reproducerbar och parallelliserad provbearbetning. Hielschers ultraljudsbehandlare för mikroplattor, modellerna UIP400MTP (400 W) och UIP550MTP (550 W), är utformade för ultraljudsbehandling av prover i flerhålsplattor och behållare med liten volym, vilket möjliggör arbetsflöden med högre genomströmning än konventionella ultraljudsbehandlare med en enda sond. För proteomiklaboratorier är detta format attraktivt eftersom det kan minska variationen i det manuella arbetet, förbättra parallellbehandlingen av flera prover och integreras mer naturligt i plattbaserade arbetsflöden för provberedning.

Ett exempel på ett arbetsflöde

En ny arbetsprocess för proteomik av extracellulära vesiklar inom PLA2G12A-styrd Th17-cellbiologi utgör ett användbart, laboratorietestat exempel på hur mikroplattsonikatorn UIP400MTP kan integreras i provberedningen för shotgun-proteomik. I den studien bearbetades EV-prover för proteomanalys genom metanolbehandling, ultraljudsbehandling med UIP400MTP, centrifugering, torkning, trypsin/Lys-C-nedbrytning samt nanoflödes-LC med högupplöst tandem-MS. Samma biologiska arbete rapporterades först som ett bioRxiv-preprint och publicerades därefter i Cell Reports, där proteomikanalysen bidrog till att karakterisera hur PLA2G12A förändrar EV-lastproteiner i samband med patogena T-cellsreaktioner.

Ultraljudsbehandling med flera brunnar för plattor UIP400MTP

Varför ultraljudsbehandling av mikroplattor?
UIP400MTP möjliggör standardiserad, parallell ultraljudsbehandling av prover med liten volym. Detta är användbart när reproducerbarhet, små provmängder och hög genomströmning av flera prover är viktigt.

Checklista för kvalitetskontroll

• Kontrollera att alla prover har samma mängd EV-proteinekvivalenter.
• Använd slumpmässiga eller balanserade layouter för bearbetning av urval.
• Se till att metanolvolymen, ultraljudsbehandlingstiden, torkningstiden och uppslutningsvolymen hålls konstanta.
• Övervaka peptidutbytet och identifieringen av totalt protein.
• Kontrollera andelen misslyckade klyvningar och peptidlängdsfördelningen.
• Kontrollera kromatografiska toppars form och reproduktibiliteten hos retentionstiderna.
• Lägg in tomma rader för att övervaka överföringen.
• Använd sammanslagna kvalitetskontrollprover vid större studier.
• Utvärdera variationskoefficienten för replikat.
• Använd PCA eller liknande metoder för att identifiera batcheffekter eller avvikande prover.

Rekommendationer för protokollföring

När detta arbetsflöde publiceras eller dokumenteras ska följande uppgifter anges: EV-tillförselmängd, plattformat, metanolvolym, amplitud och ultraljudsbehandlingstid för UIP400MTP, centrifugeringsförhållanden, torkningsmetod, nedbrytningsbuffert, enzymkoncentration, nedbrytningstid, försurningsförhållanden, LC-MS/MS-plattformen, insamlingsläget, programvaruversionen, databasen, FDR-tröskelvärdet, normaliseringsmetoden samt det statistiska arbetsflödet.
Alla Hielscher-ultraljudsenheter för mikroplattor registrerar automatiskt viktiga processparametrar såsom amplitud, ultraljudsbehandlingens varaktighet och temperatur, tillsammans med datum- och tidsstämpel, i form av en CSV-fil på det inbyggda SD-kortet. Det har aldrig varit enklare att dokumentera data för reproducerbarhet och kvalitetskontroll!

En detaljerad genomgång av studien: Proteomik med EV-shotgun-metoden i PLA2G12A-studien

PLA2G12A-studien utgör ett konkret exempel på användningen av UIP400MTP i ett arbetsflöde för shotgun-proteomik. Den biologiska frågan var hur det utsöndrade fosfolipaset PLA2G12A modifierar extracellulära vesiklar som härrör från Th17-celler och därigenom påverkar differentieringen av patogena T-celler. Författarna visade att PLA2G12A verkar på EV-membranen och producerar lysofosfolipider, däribland 1-oleoyl-lysofosfatidyletanolamin, och att den efterföljande signaleringen av lysofosfatidsyra via LPA2 bidrar till Th17-differentieringen. Utöver lipidsignaleringen undersökte studierna även EV-innehållet, inklusive RNA- och proteininnehåll, vilket gjorde shotgun-proteomik till en viktig del av karakteriseringsstrategin.
I arbetsflödet för EV-framställning odlades Th17-celler i odlingsmedium som innehöll exosomavlägsnat fetalt bovint serum. Odlingssupernatanten centrifugerades först för att avlägsna celler, filtrerades genom ett 0,22 µm-filter, koncentrerades genom ultrafiltrering/ultracentrifugering, tvättades, resuspenderades i PBS och kvantifierades med BCA-proteintest. Denna inledande EV-beredning säkerställde att en definierad, proteinekvivalent mängd EV-material kunde överföras till proteomikarbetsflödet.
För shotgun-proteomikanalys använde författarna EV-prover motsvarande 5 µg proteinekvivalenter. Dessa prover torkades i PCR-rör, varefter 25 µL metanol tillsattes. Proverna sonikerades därefter i 3 minuter med hjälp av mikroplattsonikatorn UIP400MTP. Efter ultraljudsbehandlingen centrifugerades proverna vid 4 °C i 20 minuter vid 19 000 × g. Efter att 20 µL supernatant hade avlägsnats centrifugerades proverna tills de var helt torra. Proteinerna löstes därefter genom ultraljudsbehandling i 4 µL trypsin/Lys-C-lösning (100 ng/µL) i 50 mM ammoniumbikarbonat. Nedbrytningen utfördes i 2 timmar vid 37 °C under skakning vid 300 rpm. Nedbrytningsprodukten försuredes med 1 µL 1,25 % trifluorättiksyra och analyserades med nanoflödes-LC-högupplöst tandemmasspektrometri.
Detta arbetsflöde belyser flera användbara principer för EV-proteomik med små provmängder. För det första normaliserades provmängden utifrån proteinekvivalent, vilket är viktigt vid jämförelse av EV:er från olika genotyper eller behandlingar. För det andra användes metanol före ultraljudsbehandlingen, vilket underlättade nedbrytningen och extraktionen samtidigt som man undvek detergenter som kan komplicera LC-MS/MS-analysen. För det tredje var ultraljudsbehandlingen kort och standardiserad, vilket är förenligt med parallell provbearbetning. För det fjärde utfördes trypsin/Lys-C-nedbrytningen i en mycket liten volym, vilket minskade utspädningen och underlättade återvinningen av peptider från prov med låg halt. Slutligen minimerade den direkta övergången från nedbrytning till försurning och LC-MS/MS onödiga hanteringssteg.
Den efterföljande LC-MS/MS-metoden utnyttjade separation med omvänd fas i nanoflöde i kombination med en Q-Exactive HF Orbitrap-masspektrometer. Proverna fångades upp på en C18-förkolonn och separerades därefter på en analyskolonn med en innerdiameter på 50 µm vid 200 nL/min och 40 °C. Gradienten gick från låg halt av organiskt lösningsmedel till 35 % lösningsmedel B under 60 minuter, följt av tvättning med hög halt av organiskt lösningsmedel och återjämviktning. MS-insamlingen utfördes i positivjonläge med hjälp av datauberoende insamling med kollisionsdissociation med högre energi. DIA-råfilerna analyserades med hjälp av DIA-NN 1.8 med ett spektralbibliotek baserat på in silico-förutsägelser.