Sonikácia pre lýzu: narušenie a extrakcia buniek

Rozpad alebo lýza buniek je bežnou súčasťou každodennej prípravy vzoriek v biotechnologických laboratóriách. Cieľom lýzy je narušiť časti bunkovej steny alebo celej bunky na uvoľnenie biologických molekúl. Ultrazvukové homogenizátory sú široko používané na úspešnú lýzu buniek. Hlavnou výhodou sofistikovaných ultrazvukových prístrojov je presná kontrola parametrov procesu, ako je intenzita a teplota, čo umožňuje jemné, ale vysoko účinné narušenie a extrakciu buniek.

Lýza buniek pomocou ultrazvuku

Ultrazvukové prístroje typu sondy, ako je UP200St, sú spoľahlivé tkanivové homogenizátory a široko používané na prípravu vzoriek v genetike, napr. na ultrazvukom asistovanú transformáciu agrobaktérií (SAAT).Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je metóda používaná na rozbitie otvorených buniek a extrakciu obsahu pomocou vysokofrekvenčných zvukových vĺn, t.j. ultrazvuk. Sonikácia je technika lýzy, ktorá sa široko používa ako zavedená a spoľahlivá metóda bunkového narušenia a extrakcie intracelulárneho materiálu. Ultrazvuková lýza je spoľahlivá technika na prípravu lyzátu obsahujúceho napr. plazmid, receptorové testy, proteíny, DNA, RNA atď. Keďže ultrazvuková intenzita môže byť vyrovnaná nastavením parametrov procesu, optimálna intenzita ultrazvukom od veľmi mäkkej po intenzívnu môže byť nastavená individuálne pre každú látku a médium tak, aby spĺňala špecifické požiadavky aplikácie. Nasledujúcimi krokmi lýzy sú frakcionácia, izolácia organel alebo/a extrakcia a purifikácia proteínov. Extrahovaný materiál (= lyzát) sa musí oddeliť a je predmetom ďalšieho skúmania alebo použitia, napr. na proteomický výskum.

Ultrazvukové laboratórne dismembrátory UP100H a UP400St na prípravu vzoriek (homogenizácia, lýza, extrakcia).

Ultrazvukové homogenizátory UP100H (100 wattov) a UP400St (400 w) na prípravu vzoriek, ako je lýza a extrakcia.

Žiadosť o informácie





V porovnaní s inými metódami lýzy a extrakcie buniek má ultrazvuková lýza buniek niekoľko výhod:

  1. Rýchlosť: Ultrazvuková lýza buniek a extrakcia je rýchla metóda, ktorá môže rozbiť otvorené bunky v priebehu niekoľkých sekúnd. To je oveľa rýchlejšie ako iné metódy, ako je homogenizácia, mraz-rozmrazovanie alebo mletie guľôčok.
  2. Účinnosť: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek sa môže použiť na ošetrenie malých, veľkých alebo viacerých vzoriek naraz, čo je efektívnejšie ako iné metódy, ktoré vyžadujú individuálne spracovanie malých vzoriek.
  3. Bez chemikálií: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je neinvazívna metóda, ktorá nevyžaduje použitie drsných chemikálií alebo enzýmov. Vďaka tomu je ideálny pre aplikácie, kde je potrebné zachovať integritu obsahu buniek. Je možné zabrániť nežiaducej kontaminácii vzoriek.
  4. Vysoký výťažok: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek môže extrahovať vysoký výťažok bunkového obsahu, vrátane DNA, RNA a proteínov. Je to preto, že vysokofrekvenčné zvukové vlny rozbíjajú bunkové steny a uvoľňujú obsah do okolitého roztoku.
  5. Regulácia teploty: Sofistikované ultrasonciátory umožňujú presnú kontrolu teploty vzorky. Hielscher digitálne sonicators sú vybavené pripojiteľným snímačom teploty a softvérom na monitorovanie teploty.
  6. Reprodukovateľné: Protokoly pre ultrazvukovú lýzu buniek je možné ľahko reprodukovať a dokonca prispôsobiť rôznym väčším alebo menším objemom vzoriek jednoduchým lineárnym zväčšením.
  7. Všestranný: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek sa môže použiť na extrakciu širokej škály typov buniek, vrátane baktérií, kvasiniek, húb, rastlinných buniek a buniek cicavcov. Môže sa tiež použiť na extrakciu rôznych typov molekúl, vrátane proteínov, DNA, RNA a lipidov.
  8. Súčasná príprava veľkého počtu vzoriek: Hielscher Ultrasonics ponúka niekoľko riešení na pohodlné spracovanie mnohých vzoriek v presne rovnakých podmienkach procesu. Vďaka tomu je krok prípravy vzorky lýzy a extrakcie vysoko efektívny a časovo úsporný.
  9. Jednoduché použitie: Ultrazvukové zariadenie na lýzu a extrakciu buniek sa ľahko používa a vyžaduje minimálny tréning. Zariadenie je tiež ekonomické, pretože ide o jedinú investíciu bez požiadavky na spätný nákup likvidácie. Vďaka tomu je atraktívny pre širokú škálu výskumníkov a laboratórií.

Celkovo je ultrazvuková lýza a extrakcia buniek rýchla, efektívna, presne kontrolovateľná a všestranná metóda extrakcie bunkového obsahu. Jeho výhody oproti alternatívnym metódam z neho robia atraktívnu voľbu pre širokú škálu výskumných a priemyselných aplikácií.

Pracovný princíp ultrazvukovej lýzy buniek

Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek využíva vysokofrekvenčné zvukové vlny na narušenie buniek a extrakciu ich obsahu. Zvukové vlny vytvárajú tlakové zmeny v okolitej kvapaline, čo spôsobuje tvorbu malých bublín a kolaps v procese známom ako kavitácia. Tieto bubliny vytvárajú lokalizované vysoko intenzívne mechanické sily, ktoré môžu rozbiť otvorené bunky a uvoľniť ich obsah do okolitého roztoku.

Lýza buniek pomocou ultrasonicatora bežne zahŕňa nasledujúce kroky:

  • Vzorka sa umiestni do skúmavky alebo nádoby s kvapalným tlmivým roztokom.
  • Do vzorky sa vloží ultrazvuková sonda a aplikujú sa vysokofrekvenčné zvukové vlny s cca 20-30 kHz.
  • Ultrazvukové vlny spôsobujú osciláciu a kavitáciu v okolitej kvapaline, čím vytvárajú lokalizované sily, ktoré rozbíjajú bunky a uvoľňujú ich obsah.
  • Vzorka sa odstredí alebo prefiltruje, aby sa odstránili všetky bunkové zvyšky, a extrahovaný obsah sa odoberie na následnú analýzu.
Ultrazvuková extrakcia je práca narušením bunkových štruktúr a podporou prenosu hmoty

Silné ultrazvukové vlny narúšajú bunkovú matricu biologických štruktúr a uvoľňujú bioaktívne zlúčeniny. Prenos hmoty medzi rastlinným materiálom a rozpúšťadlom (napr. tlmivý roztok) sa zintenzívňuje. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Tento videoklip ukazuje Hielscher ultrazvukový homogenizátor UP100H, ultrazvukom široko používaný na prípravu vzoriek v laboratóriách.

Ultrazvukový homogenizátor UP100H

Miniatúra videa

Nevýhody bežných metód lýzy

Počas vašej práce v laboratóriách ste už možno zažili problémy s lýzou buniek pomocou tradičných mechanických alebo chemických protokolov lýzy.

  • Mechanická lýza: Metódy mechanickej lýzy, ako je mletie maltou a paličkou alebo homogenizácia pomocou francúzskeho lisu, mlynčeka na guľôčky alebo rotor-statorového systému, často nemajú možnosti kontroly a nastavenia preciky. To znamená, že použitie mletia a mletia môže rýchlo generovať tepelné a šmykové sily, ktoré môžu poškodiť vzorku a denaturálne proteíny. Môžu byť tiež časovo náročné a vyžadujú veľké množstvo vstupnej suroviny.
  • Chemická lýza: Metódy chemickej lýzy, ako je lýza na báze detergentov, môžu poškodiť vzorku narušením lipidovej dvojvrstvy a denaturáciou proteínov. Môžu tiež vyžadovať viac krokov a môžu zanechať zvyškové kontaminanty, ktoré narúšajú následné aplikácie. Nájdenie optimálneho dávkovania čistiaceho prostriedku je ďalšou výzvou.
  • Cykly zmrazovania a rozmrazovania: Cykly zmrazovania a rozmrazovania môžu spôsobiť prasknutie bunkových membrán, ale opakované cykly môžu tiež spôsobiť denaturáciu a degradáciu proteínov. Táto metóda môže tiež vyžadovať viac cyklov, čo môže byť časovo náročné a často vedie k nižším výnosom.
  • Enzymatická lýza: Metódy enzymatickej lýzy môžu byť špecifické pre určité typy buniek a vyžadujú viac krokov, čo ich robí časovo náročnými. Vytvárajú tiež odpad a vyžadujú starostlivú optimalizáciu, aby sa zabránilo degradácii vzorky. Súpravy na enzymatickú lýzu sú často drahé. Ak váš súčasný postup enzymatickej lýzy neprináša dostatočné výsledky, sonikácia ako synergická metóda sa môže použiť na zintenzívnenie narušenia buniek.

Na rozdiel od konvenčných metód mechanickej a chemickej lýzy buniek je sonikácia veľmi efektívnym a spoľahlivým nástrojom na rozpad buniek, ktorý umožňuje úplnú kontrolu nad parametrami sonikácie. To zaisťuje vysokú selektivitu pri uvoľňovaní materiálov a čistote produktu. [porov. Balasundaram et al., 2009]
Je vhodný pre všetky typy buniek a ľahko použiteľný v malom aj veľkom meradle – vždy za kontrolovaných podmienok. Ultrazvukové prístroje sa ľahko čistia. Ultrazvukový homogenizátor má vždy funkciu clean-in-place (CIP) a sterilize-in-place (SIP). Sonotróda pozostáva z masívneho titánového rohu, ktorý je možné utrieť alebo prepláchnuť vodou alebo rozpúšťadlom (v závislosti od pracovného média). Údržba ultrasonicators je kvôli ich robustnosti takmer zanedbávateľná.

 

Tento návod vysvetľuje, aký typ ultrazvukom je najlepší pre vaše úlohy prípravy vzoriek, ako je lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov, fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analýza a výskum. Vyberte si ideálny typ ultrazvukom pre vašu aplikáciu, objem vzorky, počet vzoriek a priepustnosť. Hielscher Ultrasonics má ideálny ultrazvukový homogenizátor pre vás!

Ako nájsť perfektný sonikátor pre narušenie buniek a extrakciu bielkovín vo vede a analýze

Miniatúra videa

 

Ultrazvukový lysis a bunkové narušenie

Všeobecne platí, že lýza vzoriek v laboratóriu bude trvať 15 sekúnd až 2 minúty. Vzhľadom k tomu, intenzita ultrazvukom je veľmi ľahko prispôsobiť amplitúda nastavenie ultrazvukom čas, rovnako ako výberom správneho zariadenia, je možné narušiť bunkové membrány veľmi jemne alebo veľmi náhle, v závislosti na bunkovej štruktúre a na účely rozpadu ( napríklad extrakcia DNA vyžaduje mäkšie ultrazvukom, Úplná extrakcia bielkovín baktérií vyžaduje intenzívnejšiu ultrazvukovú liečbu). Teplota počas procesu môže byť monitorovaná integrovaným teplotným snímačom a môže byť ľahko riadená chladením (ľadová vaňa alebo prietokové bunky s chladiacimi bundy) alebo ultrazvukom v pulzovanom režime. Počas impulzný režim ultrazvukom, krátke ultrazvukom praskla cykly 1-15 sekúnd trvania umožňujú odvod tepla a chladenie počas dlhšieho občasné obdobie.
Všetky ultrazvuk-riadený procesy sú úplne reprodukovateľné a lineárne škálovateľné.

Žiadosť o informácie





VialTweeter je MultiSample Ultraonicator, ktorý umožňuje spoľahlivú homogenizáciu vzoriek v sterilných podmienkach.

Injekčná liekovkaTweeter je ultrazvukový homogenizátor na súčasnú, jednotnú a rýchlu sterilnú prípravu mnohých vzoriek.

Ultrazvukové homogenizátory na lýzu a extrakciu buniek

Rôzne typy ultrazvukových zariadení umožňujú zhodu s cieľom prípravy vzorky a zabezpečiť užívateľskú prívetivosť a komfort obsluhy. Ultrazvukové prístroje sondového typu sú najbežnejšími zariadeniami v laboratóriu. Sú najvhodnejšie na prípravu malých a stredne veľkých vzoriek s objemom 0,1 ml do 1000 ml. Rôzne veľkosti výkonu a sonotródy umožňujú prispôsobiť ultrasonicator objemu vzorky a nádobe pre najúčinnejšie a najúčinnejšie výsledky sonikácie. Zariadenie ultrazvukovej sondy je najlepšou voľbou, keď je potrebné pripraviť jednotlivé vzorky.

Ak je potrebné pripraviť viac vzoriek, napr. 8-10 injekčných liekoviek bunkového roztoku, intenzívna nepriama ultrazvukom s ultrazvukovými systémami, ako je VialTweeter alebo ultrazvukový cuphorn, sú najvhodnejšou homogenizačnou metódou pre efektívnu lýzu. Niekoľko injekčných liekoviek je sonikovaných súčasne, s rovnakou intenzitou. To šetrí nielen čas, ale zabezpečuje aj rovnaké spracovanie všetkých vzoriek, vďaka čomu sú výsledky medzi vzorkami spoľahlivé a porovnateľné. Okrem toho sa počas nepriamej ultrazvukom zabráni krížovej kontaminácii ponorením ultrazvukovej sonotródy (tiež známy ako ultrazvuková sonda, roh, špička alebo prst). Keďže sa používajú injekčné liekovky prispôsobené veľkosti vzorky jednotlivo podľa veľkosti vzorky, vynecháva sa časovo náročné čistenie a strata vzorky v dôsledku dekantácie nádob. Pre jednotnú sonikáciu multiwell alebo mikrotitračných dosiek, Hielscher ponúka UIP400MTP.
Pre vyššie objemy, napríklad pre komerčnú produkciu výťažkov buniek, sú najvhodnejšie kontinuálne ultrazvukové systémy s reaktorom prietokového buniek. Nepretržitý a rovnomerný tok spracovaného materiálu zaisťuje rovnomerné ultrazvukom. Všetky parametre ultrazvukového procesu dezintegrácie môžu byť optimalizované a upravené podľa požiadaviek aplikácie a konkrétneho bunkového materiálu.
 
 
Príkladná procedúra pre ultrazvukové rozkladový bakteriálnych buniek:

  • Príprava bunkovej suspenzie: bunkové pelety musia byť úplne zavesené v tlmivom roztoku homogenizovaním (vyberte si tlmivý roztok kompatibilný s nasledujúc analýzou, napr. špecifická Chromatografická metóda). V prípade potreby pridajte lyzozymes a/alebo iné prídavné látky (musia byť tiež kompatibilné s prostriedkami separácie/čistenia). Zmiešajte/homogenizujte roztok jemne pod miernou sonikáciou, až kým sa nedosiahne úplná suspenzia.
  • Ultrazvukový rozpadu: umiestnite vzorku do ľadového kúpeľa. Pre prerušenie buniek, Sonikujte pozastavenie na 60-90 sekundy praskne (pomocou ultrazvukového režimu pulzný režim).
  • Separácia: odstreďte lysát (napr. 10 min. pri 10 000 x g; pri 4degC). Opatrne oddeľte supernatant od bunky pelety. Supernatant je celková bunka lysate. Po filtrácii supernatantu získate objasnený tekutinu rozpustného bunkového proteínu.

 

Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných multi-well dosiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikácie UIP400MTP zahŕňajú bunkovú lýzu, DNA, RNA a strihanie chromatínu, ako aj extrakciu bielkovín.

Ultrasonicator UIP400MTP pre multi-well dosky ultrazvukom

Miniatúra videa

 
Najbežnejšie aplikácie pre ultrasonicators v biológii a biotechnológiách sú:

  • Prípravok na extrakciu buniek
  • Narušenie kvasiniek, baktérií, rastlinných buniek, mäkkých alebo tvrdých bunkových tkanív, nukleového materiálu
  • Extrakcia bielkovín
  • Príprava a izolácia enzýmov
  • Výroba antigénov
  • Extrakcia DNA a/alebo cielená fragmentácia
  • lipozómový prípravok
Narušenie buniek, lýza a extrakcia ultrazvukom je efektívnou metódou prípravy vzoriek v laboratóriách.

Narušenie buniek ultrasonicatorom sondového typu je efektívna metóda prípravy vzorky.

Nižšie uvedená tabuľka vám poskytuje prehľad o našich ultrazvukových prístrojoch na narušenie a extrakciu buniek. Kliknutím na typ zariadenia získate viac informácií o každom ultrazvukovom homogenizátore. Náš dobre vyškolený a dlhoročný technický personál vám rád pomôže vybrať najvhodnejší ultrasonicator pre vaše vzorky!
 

Objem šaržeprietokOdporúčané Devices
až 10 injekčných liekoviek alebo skúmaviekneuvVialTweeter
multiwell / mikrotiterové platneneuvUIP400MTP (UIP400MTP)
viac rúrok / nádobneuvCupHorn
1 až 500mL10 až 200mL/minUP100H
10 až 1000 ml20 až 200 ml/minUP200Ht, UP200St
10 až 2000mL20 až 400mL/minUP400St

Kontaktujte nás / požiadajte o ďalšie informácie

Porozprávajte sa s nami o vašej lýze a procese extrakcie buniek. Odporučíme vám najvhodnejšie ultrazvukové a spracovateľské parametre pre narušenie buniek.





Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,


 

Pre hodnotenie a optimalizáciu aplikácií zákazníkov, Hielscher Ultrasonics ponúka plne vybavené ultrazvukové procesné laboratórium. Prosím, kontaktujte nás pre viac informácií!
Toto video ukazuje 100 wattov ultrazvukový homogenizátor UP100H na extrakciu rastlinných látok.

Ultrazvuková extrakcia bioaktívnych zlúčenín

Miniatúra videa



Rozmanité aplikácie ultrazvukových pobočiek v odvetviach biotechnológie, bioinžinierstva, mikrobiológie, molekulárnej biológie, biochémie, imunológie, bakteriológia, virology, proteomiky, genetiky, fyziológie, bunkovej biológie, hematológie, a Botany.

Lýza: Prelomenie bunkových štruktúr

Bunky sú chránené polopriepustnou plazmatickou membránou, ktorá sa skladá z fosho-lipidov dvojvrstvou (tiež proteín-lipidov dvojvrstvou; tvorené hydrofóbnych lipidov a hydrofilných fosforu molekuly s vloženými proteínmi molekúl) a vytvára bariéru medzi bunkového interiéru (cytoplazmy) a extracelulárneho prostredia. Rastlinné bunky a Prokaryotické bunky sú obklopené bunkovou stenou. Vzhľadom na viac vrstiev hustej bunkovej steny celulózy, rastlinné bunky sú ťažšie Lyse ako živočíšne bunky. Interiér bunky, ako sú organely, jadro, mitochondrion, je stabilizovaný cytoskeletu.
Tým, že rozkladový bunky, je zameraná na ťažbu a oddeľovanie organely, bielkoviny, DNA, mRNA alebo iné biomolekúl.

Konvenčné metódy lýzy buniek a ich nevýhody

Existuje niekoľko metód na lysate bunky, ktoré môžu byť rozdelené do mechanických a chemických metód, ktoré zahŕňajú použitie detergentov alebo rozpúšťadiel, použitie vysokého tlaku, alebo použitie korálek mlyna alebo francúzskej tlače. Najproblematickejšou nevýhodou týchto metód je ťažká kontrola a úprava parametrov procesu, a tým aj vplyv.
Nasledujúca tabuľka zobrazuje hlavné nevýhody bežných metód lýzy:

V tabuľke sú uvedené konvenčné metódy bunkového prerušenia a lýzy a hlavné nevýhody každej metódy.

Tabuľka: konvenčné metódy rozpadu buniek majú veľké nevýhody

 

Postup lýzy

Lýza je citlivý proces. Počas rozpadu sa ochrana bunkovej membrány zničí, je však potrebné zabrániť inaktivácii, denaturácii a degradácii extrahovaných proteínov nefyziologickým prostredím (odchýlka od hodnoty pH). Preto sa vo všeobecnosti rozpadu vykonáva v tlmivom roztoku. Väčšina ťažkostí vznikajú pri nekontrolovanom narušení buniek, čo vedie k necielenej uvoľneniu celého intracelulárneho materiálu alebo/a denaturácii cieľového produktu.

Literatúra / Referencie

Radi prediskutujeme váš proces.

Poďme sa skontaktovať.