Sonikacia na lyzu buniek: Narušenie a extrakcia buniek
Ultrazvuková lýza buniek je široko používanou technikou prípravy vzoriek v moderných biotechnologických laboratóriách. Jej hlavným cieľom je narušiť bunkové membrány alebo celé bunky, aby sa uvoľnili vnútrobunkové zložky, ako sú proteíny, nukleové kyseliny alebo organely. V každodennej laboratórnej práci to znamená, že sonikácia je štandardnou metódou na kontrolované narušenie buniek a účinnú extrakciu biomolekúl. Kľúčová výhoda sonikátorov spočíva v ich schopnosti presne modulovať kritické parametre procesu vrátane intenzity ultrazvuku, pulzácie a regulácie teploty. Táto kontrola umožňuje výskumníkom dosiahnuť spoľahlivú lýzu pri minimalizácii tepelného alebo mechanického poškodenia citlivých biomolekúl, čo vedie k šetrnému, ale vysoko účinnému procesu extrakcie.
Lýza buniek pomocou sonikátorov
Ultrazvuková lýza buniek využíva akustickú kavitáciu na narušenie bunkových membrán a uvoľnenie vnútrobunkových molekúl. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka klasický sonický sonikátor typu sondy, ako aj sonikátory s viacerými vzorkami na sterilné spracovanie: sonikátor VialTweeter pre viaceré skúmavky a fľaštičky a sonikátor 96-jamkových platní UIP400MTP pre štandardné mikroplatne.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics dodáva výkonné bezkontaktné ultrazvukové prístroje na prípravu vzoriek a klinickú analýzu. Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn a prietokový sonikátor GDmini2 spracovávať vzorky za sterilných podmienok.
Ultrazvukové homogenizátory UP100H (100 wattov) a UP400St (400 wattov): Sonikácia na lýzu a extrakciu buniek.
Ultrazvukové homogenizátory na lýzu a extrakciu buniek
| Typ ultrazvukového zariadenia | Zameranie aplikácie | Objem vzorky | Typický prípad použitia | Výhody | Príklady modelov |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonikátory sondového typu | Sonikácia jednej vzorky | 0.1 ml až ~1000 ml | Lýza buniek, extrakcia proteínov, fragmentácia DNA/RNA | Presné riadenie energie; rôzne sonotródy; optimálne pre malé až stredne veľké vzorky | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Paralelné spracovanie viacerých zapečatených injekčných liekoviek | 8-10 injekčných liekoviek (každá ~1-20 ml) | Štandardizovaná lýza suspenzií viacerých buniek | Rovnomerná sonikácia; zabraňuje krížovej kontaminácii; reprodukovateľné výsledky | VialTweeter, Cuphorn |
| Sonikátor na 96-jamkové platne | Sonikácia viacjadrových a mikrotitračných platní | Formát mikrotitračnej platne | Vysoko výkonný skríning, proteomika, bunkové testy | Súčasná, rovnomerná sonikácia v jamkách; ideálna pre pracovné postupy s viacerými vzorkami | UIP400MTP |
| Reaktory s prietokovými bunkami | Kontinuálna sonikácia pre väčšie objemy | >1 L, škálovateľný | Narušenie buniek v priemyselnom meradle, výroba extraktu | Kontinuálne spracovanie; škálovateľné; úplná kontrola procesu (amplitúda, tlak, teplota) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + prietokový článok |
| Sterilné / nepriame sonikačné systémy | Spracovanie vzoriek bez kontaminácie | Závislosť od fľaštičky/skúmavky/mikrotéky | Citlivé vzorky, sterilné prostredie, regulačné prostredie | Žiadny kontakt so sondou; zabraňuje prenosu; minimálna námaha pri čistení | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Výhody použitia sonikácie na lýzu buniek
V porovnaní s inými metódami lýzy a extrakcie buniek má ultrazvuková lýza buniek niekoľko výhod:
- Rýchlosť: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je rýchla metóda, ktorá dokáže rozbiť bunky v priebehu niekoľkých sekúnd. Je to oveľa rýchlejšie ako iné metódy, ako je homogenizácia, zmrazovanie a rozmrazovanie alebo frézovanie guľôčok.
- Účinnosť: Ultrazvukovú lýzu a extrakciu buniek možno použiť na ošetrenie malých, veľkých alebo viacerých vzoriek naraz, vďaka čomu je efektívnejšia ako iné metódy, ktoré vyžadujú individuálne spracovanie malých vzoriek.
- Bez chemikálií: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je neinvazívna metóda, ktorá nevyžaduje použitie agresívnych chemikálií alebo enzýmov. Vďaka tomu je ideálny pre aplikácie, kde je potrebné zachovať integritu obsahu buniek. Dá sa zabrániť nežiaducej kontaminácii vzoriek.
- Vysoký výnos: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek môže extrahovať vysoký výťažok bunkového obsahu vrátane DNA, RNA a proteínov. Je to preto, že vysokofrekvenčné zvukové vlny rozbíjajú bunkové steny a uvoľňujú obsah do okolitého roztoku.
- Regulácia teploty: Sofistikované ultrazvukové prístroje umožňujú presnú reguláciu teploty vzorky. Digitálne sonikátory Hielscher sú vybavené zásuvným snímačom teploty a softvérom na monitorovanie teploty.
- Reprodukovateľné: Protokoly pre ultrazvukovú lýzu buniek je možné ľahko reprodukovať a dokonca priradiť k rôznym väčším alebo menším objemom vzoriek jednoduchým lineárnym zväčšením.
- Všestranný: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek sa môže použiť na extrakciu širokej škály typov buniek vrátane baktérií, kvasiniek, húb, buniek rastlín a cicavcov. Môže sa tiež použiť na extrakciu rôznych typov molekúl vrátane proteínov, DNA, RNA a lipidov.
- Súčasná príprava mnohých vzoriek: Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka niekoľko riešení na pohodlné spracovanie mnohých vzoriek za presne rovnakých procesných podmienok. Vďaka tomu je krok prípravy vzorky lýzy a extrakcie vysoko efektívny a časovo úsporný.
- Jednoduché použitie: Ultrazvukové zariadenie na lýzu a extrakciu buniek sa ľahko používa a vyžaduje minimálne školenie. Zariadenie je tiež ekonomické, pretože ide o jednorazovú investíciu bez potreby opätovného odkúpenia likvidácie. Vďaka tomu je atraktívny pre širokú škálu výskumníkov a laboratórií.
Celkovo je ultrazvuková lýza a extrakcia buniek rýchla, efektívna, presne kontrolovateľná a všestranná metóda extrakcie bunkového obsahu. Vďaka svojim výhodám oproti alternatívnym metódam je atraktívnou voľbou pre širokú škálu výskumných a priemyselných aplikácií.
Princíp činnosti ultrazvukovej lýzy buniek
Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek využíva vysokofrekvenčné zvukové vlny na narušenie buniek a extrakciu ich obsahu. Zvukové vlny vytvárajú zmeny tlaku v okolitej kvapaline, čo spôsobuje tvorbu malých bublín a kolaps v procese známom ako kavitácia. Tieto bubliny vytvárajú lokalizované vysoko intenzívne mechanické sily, ktoré môžu rozbiť otvorené bunky a uvoľniť ich obsah do okolitého roztoku.
Lýza buniek pomocou ultrazvuku zvyčajne zahŕňa nasledujúce kroky:
- Vzorka sa umiestni do skúmavky alebo nádoby s kvapalným tlmivým roztokom.
- Do vzorky sa vloží ultrazvuková sonda a aplikujú sa vysokofrekvenčné zvukové vlny s cca. 20-30 kHz.
- Ultrazvukové vlny spôsobujú osciláciu a kavitáciu v okolitej kvapaline, čím vytvárajú lokalizované sily, ktoré rozbíjajú bunky a uvoľňujú ich obsah.
- Vzorka sa odstredí alebo prefiltruje, aby sa odstránili všetky bunkové zvyšky, a extrahovaný obsah sa zozbiera na následnú analýzu.
Nevýhody bežných metód lýzy
Počas práce v laboratóriách ste už možno zažili problémy s lýzou buniek pomocou tradičných protokolov mechanickej alebo chemickej lýzy.
- Mechanická lýza: Metódy mechanickej lýzy, ako je mletie mažiarom a tĺčikom alebo homogenizácia pomocou francúzskeho lisu, guľôčkového mlyna alebo systému rotor-stator, často chýbajú presné možnosti kontroly a nastavenia. To znamená, že použitie frézovania a mletia môže rýchlo generovať tepelné a šmykové sily, ktoré môžu poškodiť vzorku a denaturovať proteíny. Môžu byť tiež časovo náročné a vyžadujú veľké množstvo východiskového materiálu.
- Chemická lýza: Metódy chemickej lýzy, ako je lýza na báze detergentu, môžu poškodiť vzorku narušením lipidovej dvojvrstvy a denaturáciou proteínov. Môžu tiež vyžadovať viacero krokov a môžu zanechávať zvyškové kontaminanty, ktoré zasahujú do následných aplikácií. Nájdenie optimálneho dávkovania pracieho prostriedku je ďalšou výzvou.
- Cykly zmrazovania a rozmrazovania: Cykly zmrazovania a rozmrazovania môžu spôsobiť prasknutie bunkových membrán, ale opakované cykly môžu tiež spôsobiť denaturáciu a degradáciu bielkovín. Táto metóda môže tiež vyžadovať viacero cyklov, čo môže byť časovo náročné a často vedie k nižším výnosom.
- Enzymatická lýza: Metódy enzymatickej lýzy môžu byť špecifické pre určité typy buniek a vyžadujú si viacero krokov, čo ich robí časovo náročnými. Vytvárajú tiež odpad a vyžadujú starostlivú optimalizáciu, aby sa zabránilo degradácii vzorky. Súpravy na enzymatickú lýzu sú často drahé. Ak váš súčasný postup enzymatickej lýzy neposkytuje dostatočné výsledky, na zintenzívnenie narušenia buniek je možné použiť sonikáciu ako synergickú metódu.
Na rozdiel od konvenčných mechanických a chemických metód lýzy buniek je sonikácia veľmi účinným a spoľahlivým nástrojom na rozpad buniek, ktorý umožňuje úplnú kontrolu nad parametrami sonikácie. To zaisťuje vysokú selektivitu pri uvoľňovaní materiálov a čistote produktu. [porovnaj Balasundaram a kol., 2009]
Je vhodný pre všetky typy buniek a ľahko použiteľný v malom aj veľkom meradle – vždy za kontrolovaných podmienok. Ultrazvukové prístroje sa ľahko čistia. Ultrazvukový homogenizátor je vždy vybavený funkciou clean-in-place (CIP) a sterilizácie na mieste (SIP). Sonotróda pozostáva z masívneho titánového rohu, ktorý je možné utrieť alebo prepláchnuť vodou alebo rozpúšťadlom (v závislosti od pracovného média). Údržba ultrazvukových prístrojov je kvôli ich robustnosti takmer zanedbateľná.
Ultrazvuková lýza a narušenie buniek
Vo všeobecnosti bude lýza vzoriek v laboratóriu trvať 15 sekúnd až 2 minúty. Keďže intenzita sonikácie sa dá veľmi ľahko nastaviť nastavením amplitúdy času sonikácie, ako aj výberom správneho zariadenia, je možné veľmi jemne alebo veľmi náhle narušiť bunkové membrány v závislosti od bunkovej štruktúry a účelu lýzy (napr. extrakcia DNA vyžaduje mäkšiu sonikaciu, úplná extrakcia proteínov baktérií vyžaduje intenzívnejšie ultrazvukové ošetrenie). Teplotu počas procesu je možné monitorovať pomocou integrovaného teplotného senzora a možno ju ľahko regulovať chladením (ľadový kúpeľ alebo prietokové články s chladiacimi plášťami) alebo sonikáciou v pulznom režime. Počas sonikácie v pulznom režime umožňujú krátke cykly sonikácie v trvaní 1-15 sekúnd odvod tepla a ochladenie počas dlhších prerušovaných období.
Všetky procesy riadené ultrazvukom sú úplne reprodukovateľné a lineárne škálovateľné.
The VialTweeter je ultrazvukový homogenizátor na súčasnú, rovnomernú a rýchlu sterilnú prípravu mnohých vzoriek.
- Príprava bunkovej suspenzie: Bunkové pelety musia byť úplne suspendované v tlmivom roztoku homogenizáciou (vyberte tlmivý roztok kompatibilný s nasledujúcou analýzou, napr. špecifickou chromatografickou metódou). V prípade potreby pridajte lyzozýmy a/alebo iné prísady (musia byť kompatibilné aj s separačnými/čistiacimi prostriedkami). Roztok jemne premiešajte/homogenizujte pri miernej sonikácii, kým sa nedosiahne úplná suspenzia.
Prečítajte si viac o synergii lyzozýmov v kombinácii so sonikáciou! - Ultrazvuková lýza: Vložte vzorku do ľadového kúpeľa. Pri narušení buniek sonikujte suspenziu pri 60-90 sekundových dávkach (pomocou pulzného režimu vášho sonikátora).
- Separácia: Odstredte lyzát (napr. 10 min. pri 10 000 x g; pri 4 °C). Opatrne oddeľte supernatant od bunkovej pelety. Supernatant je celkový bunkový lyzát. Po filtrácii supernatantu získate vyčírenú tekutinu rozpustného bunkového proteínu.
Najbežnejšie aplikácie ultrazvukových prístrojov v biológii a biotechnológii sú:
- Príprava bunkového extraktu
- Narušenie kvasiniek, baktérií, rastlinných buniek, mäkkých alebo tvrdých bunkových tkanív, nukleového materiálu
- extrakcia bielkovín
- Príprava a izolácia enzýmov
- Produkcia antigénov
- Extrakcia DNA a/alebo cielená fragmentácia
- Príprava lipozómov
Narušenie buniek pomocou ultrazvuku typu sondy je účinná metóda prípravy vzoriek.
Rozmanité aplikácie ultrazvuku sa rozvetvujú v sektoroch biotechnológie, bioinžinierstva, mikrobiológie, molekulárnej biológie, biochémie, imunológie, bakteriológie, virológie, proteomiky, genetiky, fyziológie, bunkovej biológie, hematológie a botaniky.
Lýza: Rozbitie bunkových štruktúr
Bunky sú chránené polopriepustnou plazmatickou membránou, ktorá pozostáva z fosfolipidovej dvojvrstvy (tiež proteínovo-lipidovej dvojvrstvy; tvorenej hydrofóbnymi lipidmi a hydrofilnými molekulami fosforu so zabudovanými proteínových molekulami) a vytvára bariéru medzi vnútrom bunky (cytoplazma) a extracelulárnym prostredím. Rastlinné bunky a prokaryotické bunky sú obklopené bunkovou stenou. Vďaka viacvrstvovej hrúbke bunkovej steny celulózy sa rastlinné bunky lyzujú ťažšie ako živočíšne bunky. Vnútro bunky, ako sú organely, jadro, mitochondria, je stabilizované cytoskeletom.
Lýzou buniek je zameraný na extrakciu a separáciu organel, proteínov, DNA, mRNA alebo iných biomolekúl.
Konvenčné metódy lýzy buniek a ich nevýhody
Existuje niekoľko metód lyzázy buniek, ktoré možno rozdeliť na mechanické a chemické metódy, ktoré zahŕňajú použitie čistiacich prostriedkov alebo rozpúšťadiel, aplikáciu vysokého tlaku alebo použitie guľôčkového mlyna alebo francúzskeho lisu. Najproblematickejšou nevýhodou týchto metód je náročná kontrola a úprava parametrov procesu, a tým aj dopad.
V nasledujúcej tabuľke sú uvedené hlavné nevýhody bežných metód lýzy:
Tabuľka: Konvenčné metódy lyzy buniek majú veľké nevýhody
Procedúra lýzy
Lýza je citlivý proces. Počas lýzy dochádza k zničeniu ochrany bunkovej membrány, je však potrebné zabrániť inaktivácii, denaturácii a degradácii extrahovaných proteínov nefyziologickým prostredím (odchýlka od hodnoty pH). Preto sa vo všeobecnosti lýza uskutočňuje v tlmivom roztoku. Väčšina ťažkostí vyplýva z nekontrolovaného narušenia buniek, čo vedie k necielenému uvoľňovaniu všetkého intracelulárneho materiálu alebo denaturácii cieľového produktu.
Často kladené otázky o sonikácii a lýze buniek
- Môžete lyzovať bunky sonikáciou? Áno, sonikácia účinne lyzuje bunky pomocou vysokofrekvenčných ultrazvukových vĺn, ktoré vyvolávajú kavitáciu, jav, pri ktorom sa tvoria drobné bubliny pary, ktoré sa prudko zrútia v bunkovej suspenzii. Výsledné mechanické sily narúšajú bunkové membrány a uľahčujú uvoľňovanie intracelulárnych zložiek do kvapaliny.
- Ako používať sonikátor na lýzu buniek? Použitie sonikátora na lýzu buniek zahŕňa ponorenie sondy sonikátora do bunkovej suspenzie a úpravu parametrov, ako je amplitúda a trvanie impulzu. Proces by sa mal pozorne monitorovať, aby sa optimalizovalo narušenie buniek a zároveň sa minimalizovala denaturácia proteínov a inaktivácia enzýmov.
- Aký je princíp sonikácie pri lýze buniek? Sonikácia funguje na princípe akustickej kavitácie. Ultrazvuková energia sa prenáša do kvapalného média, čo spôsobuje rýchle kolísanie tlaku, ktoré vedie k tvorbe a implózii mikrobublín. Tieto implózie vytvárajú intenzívne šmykové sily a lokalizované vysoké teploty, narúšajú bunkové štruktúry a zvyšujú homogenitu lyzátu.
- Ako dlho trvá sonikácia rozpadom buniek? Trvanie sonikácie na lýzu buniek sa môže výrazne líšiť v závislosti od faktorov, ako je typ bunky, hustota buniek, výkon sonikátora a konkrétny použitý protokol. Typické postupy sa môžu pohybovať od niekoľkých sekúnd do niekoľkých minút, často sa vykonávajú v cykloch na riadenie tvorby tepla a zabezpečenie rovnomerného narušenia buniek.
- Aký je účel sonikácie pri extrakcii bielkovín? Pri extrakcii proteínov slúži sonikácia na efektívne prasknutie bunkových membrán a rozpustenie proteínov. Táto metóda je obzvlášť užitočná na uvoľňovanie proteínov z bunkových kompartmentov, vďaka čomu je nevyhnutná na prípravu lyzátov, z ktorých sa majú proteíny čistiť alebo analyzovať.
- Prečo sa na extrakciu používa sonikácia? Sonikácia je uprednostňovaná na extrakciu vďaka svojmu rýchlemu pôsobeniu a schopnosti aplikovať cielenú energiu, rozbíjať bunkové štruktúry a uvoľňovať bioaktívne molekuly bez použitia drsných chemických úprav, čím sa zachováva funkčná integrita extrahovaných zlúčenín.
- Narušuje sonikácia interakcie proteín-proteín? Zatiaľ čo sonikácia môže účinne narušiť bunkové membrány, môže tiež narušiť interakcie proteín-proteín. Úroveň narušenia závisí od intenzity sonikácie a trvania expozície, čo môže viesť k denaturácii alebo disociácii proteínových komplexov, čo môže ovplyvniť následné analytické alebo funkčné štúdie.
- Môže sa sonikácia použiť na lýzu E. coli? Hielscherove sonikátory sú obzvlášť účinné pri lýze bakteriálnych buniek, ako je E. coli, ktoré majú robustné bunkové steny. Táto technika poskytuje fyzikálnu metódu na strihanie bunkovej steny a membrány, čo z nej robí preferovanú metódu na prípravu bakteriálnych lyzátov v laboratóriách molekulárnej biológie a biochémie.
- Aké sú následné procesy po sonikácii?
Následné kroky po ultrazvukovej lýze zvyčajne zahŕňajú frakcionáciu lyzátu, cielenú izoláciu organel a ďalšiu extrakciu alebo purifikáciu proteínov.
Spracovaný lyzát sa potom oddelí a pripraví na analytické alebo funkčné aplikácie, ako je proteomika s vysokým rozlíšením, transkriptomika alebo štúdie väzby receptorov.
Literatúra/Referencie
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.