Hielscher Ultrazvukové technológie

Sonikácia rozpadu: narušenie buniek & ťažba

Dezintegrácia buniek alebo lýza je bežnou súčasťou dennej prípravy vzoriek v biotechnologických laboratóriách. Cieľom rozpadu je narušiť časti bunkovej steny alebo kompletnú bunku na uvoľnenie biologických molekúl. Takzvaný lysát môže pozostávať napríklad z plazmidu, receptora, proteínov, DNA, RNA atď. Nasledujúce kroky rozpadu sú Frakcionácia, organelle izolácie alebo/a proteín extrakcie a čistenia. Extrahovaný materiál (= lysate) musí byť oddelený a podlieha ďalším vyšetrovaniam alebo žiadostiam, napríklad pre proteomický výskum. Ultrazvukové homogenizers sú spoločným nástrojom pre úspešnú bunkovú lýzu. Vzhľadom k to, Ultrazvukový intenzita môže byť vyrovnaná úpravou parametrov procesu, optimálna intenzita ultrazvukom z veľmi mäkké až veľmi ťažké možno nastaviť jednotlivo pre každú látku a médium, aby spĺňali špecifické požiadavky na aplikáciu.

Štruktúra buniek

Bunky sú chránené polopriepustnou plazmatickou membránou, ktorá sa skladá z fosho-lipidov dvojvrstvou (tiež proteín-lipidov dvojvrstvou; tvorené hydrofóbnych lipidov a hydrofilných fosforu molekuly s vloženými proteínmi molekúl) a vytvára bariéru medzi bunkového interiéru (cytoplazmy) a extracelulárneho prostredia. Rastlinné bunky a Prokaryotické bunky sú obklopené bunkovou stenou. Vzhľadom na viac vrstiev hustej bunkovej steny celulózy, rastlinné bunky sú ťažšie Lyse ako živočíšne bunky. Interiér bunky, ako sú organely, jadro, mitochondrion, je stabilizovaný cytoskeletu.
Tým, že rozkladový bunky, je zameraná na ťažbu a oddeľovanie organely, bielkoviny, DNA, mRNA alebo iné biomolekúl.

Sonikácia sa bežne používa na prípravu vzorky bunkovej hmoty.

Obr. 1: Ultrazvukový extrakcia z buniek: mikroskopické priečnej časti (TS) z apikálnej stonky mäty (Mentha piperita) ukazuje mechanizmus činnosti počas extrakcie ultrazvuku z buniek (zväčšenie 2000x) [Zdroj: Vilkhu et al. 2011]

Metódy

Existuje niekoľko metód na lysate bunky, ktoré môžu byť rozdelené do mechanických a chemických metód, ktoré zahŕňajú použitie detergentov alebo rozpúšťadiel, použitie vysokého tlaku, alebo použitie korálek mlyna alebo francúzskej tlače. Najproblematickejšou nevýhodou týchto metód je ťažká kontrola a úprava parametrov procesu, a tým aj vplyv.
Hlavnými nevýhodami spoločných metód rozpadu:

Rôzne techniky rozpadu

Tabuľka: konvenčné metódy rozpadu buniek majú veľké nevýhody

Naopak, ultrazvukom je veľmi efektívny a spoľahlivý nástroj pre bunkovú rozpad, ktorý umožňuje úplnú kontrolu nad parametrami sonikácie. Tým sa zaistí vysoká selektivita na uvoľňovanie materiálov a čistotu výrobku. [Balasundaram et al. 2009] Je vhodný pre všetky typy buniek a ľahko použiteľné v malom a veľkom meradle. Ultrasonicators sa ľahko čistí. Ultrazvukový homogenizátor vždy obsahuje Clean-in-Place (CIP) a sterilizovať-in-Place (SIP) funkcie. Sonotrode spočíva v masívnom titánovom rohu, ktorý môže byť vymazaný alebo vyprázdnený vo vode alebo rozpúšťadle (v závislosti na pracovnom médiu). Údržba ultrasonicators je vzhľadom na ich robustnosť takmer zanedbateľný.

Rozpadu

Lýza je citlivý proces. Počas rozpadu sa ochrana bunkovej membrány zničí, je však potrebné zabrániť inaktivácii, denaturácii a degradácii extrahovaných proteínov nefyziologickým prostredím (odchýlka od hodnoty pH). Preto sa vo všeobecnosti rozpadu vykonáva v tlmivom roztoku. Väčšina ťažkostí vznikajú pri nekontrolovanom narušení buniek, čo vedie k necielenej uvoľneniu celého intracelulárneho materiálu alebo/a denaturácii cieľového produktu.

Ultrazvukový bunka rozpadu môže byť použitý pre prípravu vzoriek v laboratóriu a pre výrobu veľkých objemov. Kliknite pre zväčšenie!

Obr. 1:200 wattov Výkonný Ultrazvukový homogenizátor UP200Ht s digitálnym ovládaním a automatickým zaznamenávaním údajov pre spoľahlivú a reprodukovateľnú bunkovú lýzu.

Ultrazvukový rozpadu

Všeobecne platí, že lýza vzoriek v laboratóriu bude trvať 15 sekúnd až 2 minúty. Vzhľadom k tomu, intenzita ultrazvukom je veľmi ľahko prispôsobiť amplitúda nastavenie ultrazvukom čas, rovnako ako výberom správneho zariadenia, je možné narušiť bunkové membrány veľmi jemne alebo veľmi náhle, v závislosti na bunkovej štruktúre a na účely rozpadu ( napríklad extrakcia DNA vyžaduje mäkšie ultrazvukom, Úplná extrakcia bielkovín baktérií vyžaduje intenzívnejšiu ultrazvukovú liečbu). Teplota počas procesu môže byť monitorovaná integrovaným teplotným snímačom a môže byť ľahko riadená chladením (ľadová vaňa alebo prietokové bunky s chladiacimi bundy) alebo ultrazvukom v pulzovanom režime. Počas impulzný režim ultrazvukom, krátke ultrazvukom praskla cykly 1-15 sekúnd trvania umožňujú odvod tepla a chladenie počas dlhšieho občasné obdobie.
Všetky ultrazvuk-riadený procesy sú úplne reprodukovateľné a lineárne škálovateľné.

Ultrazvukový homogenizér VialTweeter pre simultánne Príprava vzorky až do 10 testovacích rúrok. (Kliknite pre zväčšenie!)

Ultrazvukové zariadenie VialTweeter umožňuje simultánne prípravu vzoriek až do 10 injekčných liekoviek za rovnakých procesných podmienok.

Ultrazvukové homogenizers

Rôzne typy Ultrazvukové zariadenia aby sa vyhovila cieľu prípravy vzorky a aby sa zabezpečila komfortná ústretovosť a komfort obsluhy. Sonda typu ultrasonicators sú najbežnejšie zariadenia v laboratóriu. Sú najvhodnejšie na prípravu malých a stredne veľké vzorky s objemom 0,1 mL až 1000mL. Rôzne veľkostných veľkostí a sonotród umožňujú prispôsobiť ultrasonicator na vzorku objemu a nádoby pre najefektívnejšie a efektívne sonicating výsledky. Ultrazvukový sonda zariadenie je najlepšou voľbou, keď jednotlivé vzorky musia byť pripravené.

Ak je potrebné pripraviť viac vzoriek, napríklad 8 injekčných liekoviek s bunkovým roztokom, zariadenia ako VialTweeter alebo Ultrazvukový CupHorn sú najvhodnejšie homogenizér pre lýzu. Niekoľko injekčných liekoviek sú sonicated v rovnakom čase, v rovnakej intenzite. To šetrí nielen čas, ale zaisťuje tiež rovnaké zaobchádzanie so všetkými vzorkami, čo robí výsledky medzi vzorkami spoľahlivé a porovnateľné. Okrem toho sa zabráni krížovej kontaminácii ponorením ultrazvukového sonotrode (známej tiež ako ultrazvuková sonda, roh, hrot alebo prst). Keďže sa používajú injekčné liekovky, vynechajú sa časovo náročné vyčistenie a strata vzorky v dôsledku dekantovania ciev.
Pre vyššie objemy, napríklad pre komerčnú produkciu výťažkov buniek, sú najvhodnejšie kontinuálne ultrazvukové systémy s reaktorom prietokového buniek. Nepretržitý a rovnomerný tok spracovaného materiálu zaisťuje rovnomerné ultrazvukom. Všetky parametre ultrazvukového procesu dezintegrácie môžu byť optimalizované a upravené podľa požiadaviek aplikácie a konkrétneho bunkového materiálu.

Príkladná procedúra pre ultrazvukové rozkladový bakteriálnych buniek:

  • Príprava bunkovej suspenzie: bunkové pelety musia byť úplne zavesené v tlmivom roztoku homogenizovaním (vyberte si tlmivý roztok kompatibilný s nasledujúc analýzou, napr. špecifická Chromatografická metóda). V prípade potreby pridajte lyzozymes a/alebo iné prídavné látky (musia byť tiež kompatibilné s prostriedkami separácie/čistenia). Zmiešajte/homogenizujte roztok jemne pod miernou sonikáciou, až kým sa nedosiahne úplná suspenzia.
  • Ultrazvukový rozpadu: umiestnite vzorku do ľadového kúpeľa. Pre prerušenie buniek, Sonikujte pozastavenie na 60-90 sekundy praskne (pomocou ultrazvukového režimu pulzný režim).
  • Separácia: odstreďte lysát (napr. 10 min. pri 10 000 x g; pri 4degC). Opatrne oddeľte supernatant od bunky pelety. Supernatant je celková bunka lysate. Po filtrácii supernatantu získate objasnený tekutinu rozpustného bunkového proteínu.

Najbežnejšie aplikácie pre ultrasonicators v biológii a biotechnológiách sú:

  • Prípravok na extrakciu buniek
  • Narušenie kvasiniek, baktérií, rastlinných buniek, mäkkých & tvrdé bunkové tkanivo, nukleový materiál
  • Extrakcia bielkovín
  • Príprava a izolácia enzýmov
  • Výroba antigénov
  • Extrakcia DNA a/alebo cielená fragmentácia
  • lipozómový prípravok
Vysokovýkonné ultrazvukové homogenizers ako UIP1000hd sa používajú pre bunkové narušenie a extrakcie v dávke alebo kontinuálne flow-aj keď režim. (Kliknite pre zväčšenie!)

Ultrazvukové stolové systémy, ako je Uip1000hd (1kW) môže spracovať väčšie objemy biologického materiálu.

Rozmanité aplikácie ultrazvukových pobočiek v odvetviach biotechnológie, bioinžinierstva, mikrobiológie, molekulárnej biológie, biochémie, imunológie, bakteriológia, virology, proteomiky, genetiky, fyziológie, bunkovej biológie, hematológie, a Botany.

Pre hodnotenie a optimalizáciu aplikácií zákazníkov, Hielscher Ultrasonics ponúka plne vybavené Ultrazvukový proces laboratórium. Prosím, kontaktujte nás pre ďalšie informácie!

Literatúra / Referencie

  • Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): pokrok v stratégiách uvoľňovania produktov a vplyv na dizajn bioprocesov. Trendy v biotechnológiách 27/8, 2009. PP. 477-485.
  • Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): ultrazvukové zotavenie a modifikácia potravinárskych prísad. In: Feng/Barbosa-Cánovas/Weiss (2011): Ultrazvukové technológie pre potraviny a Bioprocessing. New York: Springer, 2011. PP. 345-368.

Kontaktujte nás / požiadajte o ďalšie informácie

Porozprávajte sa s nami o vaše požiadavky na spracovanie. Odporučíme najvhodnejšie nastavenie a spracovanie parametrov pre váš projekt.





Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,