Sonikácia pre lýzu: narušenie a extrakcia buniek

Rozpad alebo lýza buniek je bežnou súčasťou každodennej prípravy vzoriek v biotechnologických laboratóriách. Cieľom lýzy je narušiť časti bunkovej steny alebo celej bunky na uvoľnenie biologických molekúl. Ultrazvukové homogenizátory sú široko používané na úspešnú lýzu buniek. Hlavnou výhodou sofistikovaných ultrazvukových prístrojov je presná kontrola parametrov procesu, ako je intenzita a teplota, čo umožňuje jemné, ale vysoko účinné narušenie a extrakciu buniek.

Lýza buniek pomocou ultrazvuku

Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je metóda používaná na rozbitie otvorených buniek a extrahovanie obsahu pomocou vysokofrekvenčných zvukových vĺn, t.j. ultrazvuku. Sonikácia je lýzna technika, ktorá sa široko používa ako zavedená a spoľahlivá metóda narušenia buniek a extrakcie intracelulárneho materiálu. Ultrazvuková lýza je spoľahlivá technika na prípravu lyzátu obsahujúceho napr. plazmid, receptorové testy, proteíny, DNA, RNA atď. Pretože ultrazvuková intenzita môže byť vyrovnaná úpravou parametrov procesu, optimálna intenzita sonikácie od veľmi mäkkej po intenzívnu môže byť nastavená individuálne pre každú látku a médium, aby spĺňala špecifické požiadavky na aplikáciu. Nasledujú kroky lýzy frakcionácia, izolácia organel alebo / a extrakcia a čistenie proteínov. Extrahovaný materiál (= lyzát) sa musí oddeliť a je predmetom ďalšieho skúmania alebo aplikácie, napr. na proteomický výskum.

V porovnaní s inými metódami lýzy a extrakcie buniek má ultrazvuková lýza buniek niekoľko výhod:

1. Rýchlosť: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je rýchla metóda, ktorá dokáže rozbiť otvorené bunky v priebehu niekoľkých sekúnd. To je oveľa rýchlejšie ako iné metódy, ako je homogenizácia, mrazenie alebo mletie guľôčok.
2. Účinnosť: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek sa môže použiť na ošetrenie malých, veľkých alebo viacerých vzoriek naraz, čo je efektívnejšie ako iné metódy, ktoré vyžadujú individuálne spracovanie malých vzoriek.
3. Bez chemikálií: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek je neinvazívna metóda, ktorá nevyžaduje použitie drsných chemikálií alebo enzýmov. Vďaka tomu je ideálny pre aplikácie, kde je potrebné zachovať integritu obsahu buniek. Je možné zabrániť nežiaducej kontaminácii vzoriek.
4. Vysoký výťažok: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek môže extrahovať vysoký výťažok bunkového obsahu, vrátane DNA, RNA a proteínov. Je to preto, že vysokofrekvenčné zvukové vlny rozbíjajú bunkové steny a uvoľňujú obsah do okolitého roztoku.
5. Regulácia teploty: Sofistikované ultrasonciátory umožňujú presnú reguláciu teploty vzorky. Hielscher digitálny ultrazvuk sú vybavené pripojiteľným snímačom teploty a softvérom na monitorovanie teploty.
6. Reprodukovateľné: Protokoly pre ultrazvukovú lýzu buniek je možné ľahko reprodukovať a dokonca prispôsobiť rôznym väčším alebo menším objemom vzoriek jednoduchým lineárnym zväčšením.
7. Všestranný: Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek sa môže použiť na extrakciu širokej škály typov buniek, vrátane baktérií, kvasiniek, húb, rastlinných buniek a buniek cicavcov. Môže sa tiež použiť na extrakciu rôznych typov molekúl, vrátane proteínov, DNA, RNA a lipidov.
8. Súčasná príprava mnohých vzoriek: Hielscher Ultrasonics ponúka niekoľko riešení na pohodlné spracovanie mnohých vzoriek za presne rovnakých procesných podmienok. Vďaka tomu je krok prípravy vzorky lýzy a extrakcie vysoko efektívny a časovo úsporný.
9. Jednoduché použitie: Ultrazvukové zariadenie na lýzu a extrakciu buniek sa ľahko používa a vyžaduje minimálny tréning. Zariadenie je tiež ekonomické, pretože ide o jedinú investíciu bez požiadavky na spätný nákup likvidácie. Vďaka tomu je atraktívny pre širokú škálu výskumníkov a laboratórií.

Celkovo je ultrazvuková lýza a extrakcia buniek rýchla, efektívna, presne kontrolovateľná a všestranná metóda extrakcie bunkového obsahu. Jeho výhody oproti alternatívnym metódam z neho robia atraktívnu voľbu pre širokú škálu výskumných a priemyselných aplikácií.

Pracovný princíp ultrazvukovej lýzy buniek

Ultrazvuková lýza a extrakcia buniek využíva vysokofrekvenčné zvukové vlny na narušenie buniek a extrakciu ich obsahu. Zvukové vlny vytvárajú tlakové zmeny v okolitej kvapaline, čo spôsobuje tvorbu malých bublín a kolaps v procese známom ako kavitácia. Tieto bubliny vytvárajú lokalizované vysoko intenzívne mechanické sily, ktoré môžu rozbiť otvorené bunky a uvoľniť ich obsah do okolitého roztoku.

Lýza buniek pomocou ultrasonicatora bežne zahŕňa nasledujúce kroky:

• Vzorka sa umiestni do skúmavky alebo nádoby s kvapalným tlmivým roztokom.
• Do vzorky sa vloží ultrazvuková sonda a aplikujú sa vysokofrekvenčné zvukové vlny s cca 20-30 kHz.
• Ultrazvukové vlny spôsobujú osciláciu a kavitáciu v okolitej kvapaline, čím vytvárajú lokalizované sily, ktoré rozbíjajú bunky a uvoľňujú ich obsah.
• Vzorka sa odstredí alebo prefiltruje, aby sa odstránili všetky bunkové zvyšky, a extrahovaný obsah sa odoberie na následnú analýzu.

Silné ultrazvukové vlny narúšajú bunkovú matricu biologických štruktúr a uvoľňujú bioaktívne zlúčeniny. Prenos hmoty medzi rastlinným materiálom a rozpúšťadlom (napr. tlmivý roztok) sa zintenzívňuje. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Nevýhody bežných metód lýzy

Počas vašej práce v laboratóriách ste už možno zažili problémy s lýzou buniek pomocou tradičných mechanických alebo chemických protokolov lýzy.

• Mechanická lýza: Metódy mechanickej lýzy, ako je mletie maltou a paličkou alebo homogenizácia pomocou francúzskeho lisu, mlynčeka na guľôčky alebo rotor-statorového systému, často nemajú možnosti kontroly a nastavenia preciky. To znamená, že použitie mletia a mletia môže rýchlo generovať tepelné a šmykové sily, ktoré môžu poškodiť vzorku a denaturálne proteíny. Môžu byť tiež časovo náročné a vyžadujú veľké množstvo vstupnej suroviny.
• Chemická lýza: Metódy chemickej lýzy, ako je lýza na báze detergentov, môžu poškodiť vzorku narušením lipidovej dvojvrstvy a denaturáciou proteínov. Môžu tiež vyžadovať viac krokov a môžu zanechať zvyškové kontaminanty, ktoré narúšajú následné aplikácie. Nájdenie optimálneho dávkovania čistiaceho prostriedku je ďalšou výzvou.
• Cykly zmrazovania a rozmrazovania: Cykly zmrazovania a rozmrazovania môžu spôsobiť prasknutie bunkových membrán, ale opakované cykly môžu tiež spôsobiť denaturáciu a degradáciu proteínov. Táto metóda môže tiež vyžadovať viac cyklov, čo môže byť časovo náročné a často vedie k nižším výnosom.
• Enzymatická lýza: Metódy enzymatickej lýzy môžu byť špecifické pre určité typy buniek a vyžadujú viac krokov, čo ich robí časovo náročnými. Vytvárajú tiež odpad a vyžadujú starostlivú optimalizáciu, aby sa zabránilo degradácii vzorky. Súpravy na enzymatickú lýzu sú často drahé. Ak váš súčasný postup enzymatickej lýzy neprináša dostatočné výsledky, sonikácia ako synergická metóda sa môže použiť na zintenzívnenie narušenia buniek.

Na rozdiel od konvenčných metód mechanickej a chemickej lýzy buniek je sonikácia veľmi efektívnym a spoľahlivým nástrojom na rozpad buniek, ktorý umožňuje úplnú kontrolu nad parametrami sonikácie. To zaisťuje vysokú selektivitu pri uvoľňovaní materiálov a čistote produktu. [porov. Balasundaram et al., 2009]
Je vhodný pre všetky typy buniek a ľahko použiteľný v malom aj veľkom meradle – vždy za kontrolovaných podmienok. Ultrazvukové prístroje sa ľahko čistia. Ultrazvukový homogenizátor má vždy funkciu clean-in-place (CIP) a sterilize-in-place (SIP). Sonotróda pozostáva z masívneho titánového rohu, ktorý je možné utrieť alebo prepláchnuť vodou alebo rozpúšťadlom (v závislosti od pracovného média). Údržba ultrasonicators je kvôli ich robustnosti takmer zanedbávateľná.

Ultrazvukový lysis a bunkové narušenie

Všeobecne platí, že lýza vzoriek v laboratóriu bude trvať 15 sekúnd až 2 minúty. Vzhľadom k tomu, intenzita ultrazvukom je veľmi ľahko prispôsobiť amplitúda nastavenie ultrazvukom čas, rovnako ako výberom správneho zariadenia, je možné narušiť bunkové membrány veľmi jemne alebo veľmi náhle, v závislosti na bunkovej štruktúre a na účely rozpadu ( napríklad extrakcia DNA vyžaduje mäkšie ultrazvukom, Úplná extrakcia bielkovín baktérií vyžaduje intenzívnejšiu ultrazvukovú liečbu). Teplota počas procesu môže byť monitorovaná integrovaným teplotným snímačom a môže byť ľahko riadená chladením (ľadová vaňa alebo prietokové bunky s chladiacimi bundy) alebo ultrazvukom v pulzovanom režime. Počas impulzný režim ultrazvukom, krátke ultrazvukom praskla cykly 1-15 sekúnd trvania umožňujú odvod tepla a chladenie počas dlhšieho občasné obdobie.
Všetky ultrazvuk-riadený procesy sú úplne reprodukovateľné a lineárne škálovateľné.

Ultrazvukové homogenizátory na lýzu a extrakciu buniek

Rôzne typy ultrazvukových zariadení umožňujú zhodu s cieľom prípravy vzorky a zabezpečiť užívateľskú prívetivosť a komfort obsluhy. Ultrazvukové prístroje sondového typu sú najbežnejšími zariadeniami v laboratóriu. Sú najvhodnejšie na prípravu malých a stredne veľkých vzoriek s objemom 0,1 ml do 1000 ml. Rôzne veľkosti výkonu a sonotródy umožňujú prispôsobiť ultrasonicator objemu vzorky a nádobe pre najúčinnejšie a najúčinnejšie výsledky sonikácie. Zariadenie ultrazvukovej sondy je najlepšou voľbou, keď je potrebné pripraviť jednotlivé vzorky.

Ak je potrebné pripraviť viac vzoriek, napr. 8-10 injekčných liekoviek bunkového roztoku, intenzívna nepriama ultrazvukom s ultrazvukovými systémami, ako je VialTweeter alebo ultrazvukový cuphorn, sú najvhodnejšou homogenizačnou metódou pre efektívnu lýzu. Niekoľko injekčných liekoviek je sonikovaných súčasne, s rovnakou intenzitou. To šetrí nielen čas, ale zabezpečuje aj rovnaké spracovanie všetkých vzoriek, vďaka čomu sú výsledky medzi vzorkami spoľahlivé a porovnateľné. Okrem toho sa počas nepriamej ultrazvukom zabráni krížovej kontaminácii ponorením ultrazvukovej sonotródy (tiež známy ako ultrazvuková sonda, roh, špička alebo prst). Keďže sa používajú injekčné liekovky prispôsobené veľkosti vzorky jednotlivo podľa veľkosti vzorky, vynecháva sa časovo náročné čistenie a strata vzorky v dôsledku dekantácie nádob. Pre jednotnú sonikáciu multiwell alebo mikrotitračných dosiek, Hielscher ponúka UIP400MTP.
Pre vyššie objemy, napríklad pre komerčnú produkciu výťažkov buniek, sú najvhodnejšie kontinuálne ultrazvukové systémy s reaktorom prietokového buniek. Nepretržitý a rovnomerný tok spracovaného materiálu zaisťuje rovnomerné ultrazvukom. Všetky parametre ultrazvukového procesu dezintegrácie môžu byť optimalizované a upravené podľa požiadaviek aplikácie a konkrétneho bunkového materiálu.
 
 
Príkladná procedúra pre ultrazvukové rozkladový bakteriálnych buniek:

• Príprava bunkovej suspenzie: bunkové pelety musia byť úplne zavesené v tlmivom roztoku homogenizovaním (vyberte si tlmivý roztok kompatibilný s nasledujúc analýzou, napr. špecifická Chromatografická metóda). V prípade potreby pridajte lyzozymes a/alebo iné prídavné látky (musia byť tiež kompatibilné s prostriedkami separácie/čistenia). Zmiešajte/homogenizujte roztok jemne pod miernou sonikáciou, až kým sa nedosiahne úplná suspenzia.
• Ultrazvukový rozpadu: umiestnite vzorku do ľadového kúpeľa. Pre prerušenie buniek, Sonikujte pozastavenie na 60-90 sekundy praskne (pomocou ultrazvukového režimu pulzný režim).
• Separácia: odstreďte lysát (napr. 10 min. pri 10 000 x g; pri 4degC). Opatrne oddeľte supernatant od bunky pelety. Supernatant je celková bunka lysate. Po filtrácii supernatantu získate objasnený tekutinu rozpustného bunkového proteínu.

 
 
Najbežnejšie aplikácie pre ultrasonicators v biológii a biotechnológiách sú:

• Prípravok na extrakciu buniek
• Narušenie kvasiniek, baktérií, rastlinných buniek, mäkkých alebo tvrdých bunkových tkanív, nukleového materiálu
• Extrakcia bielkovín
• Príprava a izolácia enzýmov
• Výroba antigénov
• Extrakcia DNA a/alebo cielená fragmentácia
• lipozómový prípravok