Ультразвуковая обработка для лизиса клеток: разрушение клеток и экстракция
Ультразвуковой лизис клеток - широко применяемый в современных биотехнологических лабораториях метод пробоподготовки. Его основная цель - разрушить клеточные мембраны или целые клетки, чтобы высвободить внутриклеточные компоненты, такие как белки, нуклеиновые кислоты или органеллы. В повседневной лабораторной работе это означает, что соникация является стандартным методом контролируемого разрушения клеток и эффективного извлечения биомолекул. Ключевое преимущество соникаторов заключается в их способности точно модулировать критические параметры процесса, включая интенсивность ультразвука, пульсацию и контроль температуры. Такой контроль позволяет исследователям добиться надежного лизиса при минимальном термическом или механическом повреждении чувствительных биомолекул, что приводит к бережному, но высокоэффективному процессу экстракции.
Лизис клеток с помощью соникаторов
Ультразвуковой лизис клеток использует акустическую кавитацию для разрушения клеточных мембран и высвобождения внутриклеточных молекул. Hielscher Ultrasonics предлагает классические зондовые соникаторы, а также соникаторы для стерильной обработки нескольких образцов: VialTweeter для нескольких пробирок и флаконов и 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP для стандартных микропланшетов.
Hielscher Ultrasonics поставляет мощные бесконтактные ультразвуковые аппараты для подготовки образцов и клинического анализа. Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP, Виалтвитер, CupHorn и проточный соникатор GDmini2 обрабатывайте образцы в стерильных условиях.
Ультразвуковые гомогенизаторы UP100H (100 Вт) и UP400St (400 Вт): Ультразвуковая обработка для лизиса и экстракции клеток.
Ультразвуковые гомогенизаторы для лизиса и экстракции клеток
| Тип ультразвукового устройства | Прикладная направленность | Объем образца | Типичный пример использования | Преимущества | Примеры моделей |
|---|---|---|---|---|---|
| Ультразвуковые аппараты зондового типа | Соникация одной пробы | 0От .1 мл до ~1000 мл | Лизис клеток, экстракция белков, фрагментация ДНК/РНК | Точный контроль энергии; различные сонотроды; оптимально для малых и средних образцов | УП100Ч, УП200Ст, УП400Ст |
| VialTweeter / CupHorn | Параллельная обработка нескольких запечатанных флаконов | 8-10 флаконов (~1-20 мл каждый) | Стандартизированный лизис нескольких клеточных суспензий | Равномерное сонирование; исключение перекрестного загрязнения; воспроизводимые результаты | VialTweeter, горн |
| Звуковой аппарат для 96-луночных планшетов | Сонирование многолуночных и микротитровальных планшетов | Формат микропланшета | Высокопроизводительный скрининг, протеомика, клеточные анализы | Одновременное, равномерное сонирование в лунках; идеально подходит для работы с несколькими образцами | UIP400MTP |
| реакторы с проточной ячейкой | Непрерывное сонирование для больших объемов | >1 л, масштабируемый | Промышленное разрушение клеток, производство экстрактов | Непрерывная обработка; масштабируемость; полный контроль процесса (амплитуда, давление, температура) | УИП1000HDT, УИП2000HDT + проточная кювета |
| Стерильные / непрямые системы соникации | Обработка образцов без загрязнения | Зависимость от флакона/пробирки/микропланшета | Чувствительные образцы, стерильные среды, нормативные требования | Отсутствие контакта с зондом; исключение переноса; минимальные усилия по очистке | VialTweeter, горн, UIP400MTP |
Преимущества использования ультразвуковой обработки для лизиса клеток
По сравнению с другими методами лизиса и экстракции клеток, ультразвуковой лизис клеток имеет ряд преимуществ:
- Скорость: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток — это быстрый метод, который может вскрыть клетки за считанные секунды. Это намного быстрее, чем при других методах, таких как гомогенизация, замораживание-размораживание или измельчение бисера.
- Эффективность: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток могут использоваться для обработки маленьких, больших или нескольких образцов одновременно, что делает его более эффективным, чем другие методы, требующие индивидуальной обработки небольших образцов.
- Без химикатов: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток является неинвазивным методом, который не требует использования агрессивных химикатов или ферментов. Это делает его идеальным для применений, где необходимо поддерживать целостность содержимого клеток. Можно избежать нежелательного загрязнения образцов.
- Высокая урожайность: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток позволяют получить большое количество клеточного содержимого, включая ДНК, РНК и белки. Это связано с тем, что высокочастотные звуковые волны разрушают стенки клеток и высвобождают содержимое в окружающий раствор.
- Контроль температуры: Современные ультразвуковые аппараты позволяют точно контролировать температуру образца. Цифровые ультразвуковики Hielscher оснащены подключаемым датчиком температуры и программным обеспечением для мониторинга температуры.
- Воспроизводимый: Протоколы ультразвукового лизиса клеток могут быть легко воспроизведены и даже согласованы с различными большими или меньшими объемами образцов с помощью простого линейного масштабирования.
- Разносторонний: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток могут использоваться для извлечения широкого спектра типов клеток, включая бактерии, дрожжи, грибы, клетки растений и млекопитающих. Его также можно использовать для извлечения различных типов молекул, включая белки, ДНК, РНК и липиды.
- Одновременная подготовка многочисленных образцов: Hielscher Ultrasonics предлагает несколько решений для комфортной обработки большого количества образцов в одних и тех же технологических условиях. Это делает этап подготовки образцов лизиса и экстракции очень эффективным и экономящим время.
- Простота в использовании: Ультразвуковое оборудование для лизиса и экстракции клеток простое в использовании и требует минимальной подготовки. Оборудование также экономично, так как это единовременная инвестиция без необходимости повторного выкупа отходов. Это делает его привлекательным для широкого круга исследователей и лабораторий.
В целом, ультразвуковой лизис и экстракция клеток является быстрым, эффективным, точно контролируемым и универсальным методом экстракции клеточного содержимого. Его преимущества перед альтернативными методами делают его привлекательным выбором для широкого спектра исследовательских и промышленных применений.
Принцип работы ультразвукового лизиса клеток
При ультразвуковом лизисе и экстракции клеток используются высокочастотные звуковые волны для разрушения клеток и извлечения их содержимого. Звуковые волны создают изменения давления в окружающей жидкости, вызывая образование и схлопывание небольших пузырьков в процессе, известном как кавитация. Эти пузырьки генерируют локализованные высокоинтенсивные механические силы, которые могут разрушить ячейки и высвободить их содержимое в окружающий раствор.
Лизис клеток с помощью ультразвукового аппарата обычно включает в себя следующие этапы:
- Образец помещают в пробирку или контейнер с буфером для жидкости.
- В образец вводится ультразвуковой зонд, и подаются высокочастотные звуковые волны с частотой ок. 20-30 кГц.
- Ультразвуковые волны вызывают колебания и кавитацию в окружающей жидкости, создавая локализованные силы, которые разрушают клетки и высвобождают их содержимое.
- Образец центрифугируется или фильтруется для удаления клеточного мусора, а извлеченное содержимое собирается для последующего анализа.
Недостатки распространенных методов лизиса
Во время работы в лабораториях вы, возможно, уже сталкивались с трудностями лизиса клеток с использованием традиционных протоколов механического или химического лизиса.
- Механический лизис: Методы механического лизиса, такие как измельчение ступкой и пестиком или гомогенизация с помощью френч-пресса, бисерной мельницы или роторно-статорной системы, часто не имеют возможности точного контроля и регулировки. Это означает, что при использовании фрезерования и шлифования можно быстро выделять тепло и силы сдвига, которые могут повредить образец и привести к денатурации белков. Они также могут отнимать много времени и требовать большого количества исходного материала.
- Химический лизис: Методы химического лизиса, такие как лизис на основе детергента, могут повредить образец, разрушая липидный бислой и денатурирующие белки. Они также могут требовать нескольких этапов и оставлять остаточные загрязняющие вещества, которые мешают последующему применению. Поиск оптимальной дозировки моющего средства является дополнительной проблемой.
- Циклы замораживания-оттаивания: Циклы замораживания-размораживания могут привести к разрыву клеточных мембран, но повторные циклы также могут вызвать денатурацию и деградацию белка. Этот метод также может потребовать нескольких циклов, что может занять много времени и часто приводит к снижению урожайности.
- Ферментативный лизис: Методы ферментативного лизиса могут быть специфичными для определенных типов клеток и требовать нескольких этапов, что делает их трудоемкими. Они также приводят к образованию отходов и требуют тщательной оптимизации, чтобы избежать деградации образца. Наборы для ферментативного лизиса часто стоят дорого. Если ваша текущая процедура ферментативного лизиса не дает достаточных результатов, ультразвук в качестве синергетического метода может быть применен для усиления разрушения клеток.
В отличие от традиционных механических и химических методов лизиса клеток, ультразвуковая обработка является очень эффективным и надежным инструментом для дезинтеграции клеток, позволяющим полностью контролировать параметры ультразвука. Это обеспечивает высокую селективность по выходу материалов и чистоту продукта. [см. Баласундарам и др., 2009]
Он подходит для всех типов ячеек и легко применяется в малых и больших масштабах – всегда в контролируемых условиях. Ультразвуковые аппараты легко чистятся. Ультразвуковой гомогенизатор всегда оснащен функцией безразборной мойки (CIP) и стерилизации на месте (SIP). Сонотрод состоит из массивного титанового рога, который можно протирать или промывать в воде или растворителе (в зависимости от рабочей среды). Обслуживанием ультразвуковых аппаратов из-за их надежности практически можно пренебречь.
Ультразвуковой лизис и разрушение клеток
Как правило, лизис образцов в лаборатории занимает от 15 секунд до 2 минут. Поскольку интенсивность ультразвуковой обработки очень легко регулировать с помощью амплитуды, установки времени ультразвуковой обработки, а также выбора подходящего оборудования, можно очень мягко или очень резко разрушать клеточные мембраны, в зависимости от структуры клетки и цели лизиса (например, экстракция ДНК требует более мягкой ультразвука, полная экстракция белка бактерий требует более интенсивной ультразвуковой обработки). Температура во время процесса может контролироваться встроенным датчиком температуры и может легко контролироваться с помощью охлаждения (ледяная баня или проточные ячейки с охлаждающими рубашками) или с помощью ультразвуковой обработки в импульсном режиме. Во время импульсной ультразвуковой обработки короткие циклы ультразвуковой обработки продолжительностью от 1 до 15 секунд обеспечивают рассеивание тепла и охлаждение в течение более длительных периодов времени.
Все процессы, управляемые ультразвуком, полностью воспроизводимы и линейно масштабируемы.
Виалтвитер ультразвуковой гомогенизатор для одновременной, равномерной и быстрой стерильной подготовки многочисленных образцов.
- Приготовление клеточной суспензии: Клеточные гранулы должны быть полностью суспендированы в буферном растворе путем гомогенизации (выберите буферный раствор, совместимый с последующим анализом, например, с помощью конкретного метода хроматографии). При необходимости добавьте лизоцимы и/или другие добавки (они также должны быть совместимы со средствами сепарации/очистки). Осторожно перемешайте/гомогенизируйте раствор под мягкой ультразвуком до достижения полной суспензии.
Узнайте больше о синергетическом эффекте лизоцимов в сочетании с соникацией! - Ультразвуковой лизис: поместите образец в ледяную ванну. Для разрушения клеток проводите ультразвуковую обработку суспензии с интервалом в 60-90 секунд (используя импульсный режим ультразвукового аппарата).
- Разделение: Центрифугируйте лизат (например, 10 мин. при 10 000 x g; при 4 °C). Осторожно отделите надосадочную жидкость от клеточной гранулы. Надосадочная жидкость – это общий лизат клеток. После фильтрации надосадочной жидкости вы получаете осветленную жидкость растворимого белка клетки.
Наиболее распространенными областями применения ультразвуковых аппаратов в биологии и биотехнологии являются:
- Приготовление клеточного экстракта
- Нарушение дрожжей, бактерий, растительных клеток, мягких или твердых клеточных тканей, нуклеинового материала
- Экстракция белка
- Получение и выделение ферментов
- Производство антигенов
- Экстракция ДНК и/или целенаправленная фрагментация
- Подготовка липосом,
Разрушение клеток с помощью ультразвукового аппарата зондового типа является эффективным методом пробоподготовки.
Многообразие применений ультразвука разветвляется в секторах биотехнологии, биоинженерии, микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, иммунологии, бактериологии, вирусологии, протеомики, генетики, физиологии, клеточной биологии, гематологии и ботаники.
Лизис: разрушение клеточных структур
Клетки защищены полупроницаемой плазматической мембраной, которая состоит из фосфо-липидного бислоя (также белок-липидного бислоя; образован гидрофобными липидами и гидрофильными молекулами фосфора со встроенными белковыми молекулами) и создает барьер между внутренней частью клетки (цитоплазмой) и внеклеточной средой. Растительные клетки и прокариотические клетки окружены клеточной стенкой. Из-за нескольких слоев толстой клеточной стенки целлюлозы растительные клетки труднее лизировать, чем клетки животных. Внутренняя часть клетки, такая как органеллы, ядро, митохондрия, стабилизируется цитоскелетом.
Лизируя клетки, он направлен на извлечение и разделение органелл, белков, ДНК, мРНК или других биомолекул.
Традиционные методы лизиса клеток и их недостатки
Существует несколько методов лизации клеток, которые можно разделить на механические и химические, которые включают в себя использование моющих средств или растворителей, применение высокого давления или использование бисерной мельницы или френч-пресса. Наиболее проблемным недостатком этих методов является сложный контроль и регулировка параметров процесса и, следовательно, воздействия.
В таблице ниже отображены основные недостатки распространенных методов лизиса:
Таблица: Традиционные методы лизиса клеток имеют существенные недостатки
Процедура лизиса
Лизис – чувствительный процесс. Во время лизиса защита клеточной мембраны разрушается, однако необходимо предотвратить инактивацию, денатурацию и деградацию экстрагированных белков под воздействием нефизиологичной среды (отклонение от значения pH). Поэтому в общем случае лизис проводят в буферном растворе. Большинство трудностей возникает из-за неконтролируемого разрушения клеток, приводящего к нецелевому высвобождению всего внутриклеточного материала и/или денатурации целевого продукта.
Часто задаваемые вопросы о ультразвуковой обработке и лизисе клеток
- Можно ли лизировать клетки с помощью ультразвука? Да, ультразвуковая обработка эффективно лизирует клетки с помощью высокочастотных ультразвуковых волн, которые вызывают кавитацию — явление, при котором крошечные пузырьки пара формируются и сильно сжимаются внутри клеточной суспензии. Возникающие в результате механические силы разрушают клеточные мембраны и способствуют высвобождению внутриклеточных компонентов в жидкость.
- Как использовать ультразвуковую аппарат для лизиса клеток? Использование ультразвукового аппарата для лизиса клеток включает в себя погружение ультразвукового зонда в клеточную суспензию и регулировку таких параметров, как амплитуда и продолжительность импульса. Этот процесс следует тщательно контролировать, чтобы оптимизировать разрушение клеток при минимизации денатурации белка и инактивации ферментов.
- По какому принципу используется ультразвуковая обработка для лизиса клеток? Ультразвуковая обработка работает по принципу акустической кавитации. Ультразвуковая энергия передается в жидкую среду, вызывая быстрые колебания давления, которые приводят к образованию и схлопыванию микропузырьков. Эти имплозии генерируют интенсивные силы сдвига и локализованные высокие температуры, разрушая клеточные структуры и повышая однородность лизата.
- Сколько времени занимает ультразвуковая обработка лизисом клеток? Продолжительность ультразвуковой обработки для лизиса клеток может значительно варьироваться в зависимости от таких факторов, как тип клетки, плотность клеток, мощность ультразвукового аппарата и конкретный используемый протокол. Типичные процедуры могут длиться от нескольких секунд до нескольких минут, часто выполняются циклами для управления выделением тепла и обеспечения равномерного разрушения клеток.
- Какова цель ультразвуковой обработки при экстракции белка? При экстракции белка ультразвуковая обработка служит для эффективного разрыва клеточных мембран и солюбилизации белков. Этот метод особенно полезен для высвобождения белков из клеточных компартментов, что делает его необходимым для получения лизатов, из которых белки должны быть очищены или проанализированы.
- Почему ультразвуковая обработка используется для экстракции? Ультразвуковая обработка предпочтительна для экстракции благодаря своему быстрому действию и способности прикладывать целевую энергию, разрушая клеточные структуры для высвобождения биоактивных молекул без использования жестких химических обработок, тем самым сохраняя функциональную целостность экстрагированных соединений.
- Нарушает ли ультразвуковая обработка белок-белковые взаимодействия? В то время как ультразвук может эффективно разрушать клеточные мембраны, он также может нарушать белок-белковые взаимодействия. Уровень разрушения зависит от интенсивности ультразвуковой обработки и продолжительности воздействия, что потенциально может привести к денатурации или диссоциации белковых комплексов, что может повлиять на последующие аналитические или функциональные исследования.
- Можно ли использовать ультразвук для лизиса кишечной палочки? Ультразвуковые аппараты Hielscher особенно эффективны для лизирования бактериальных клеток, таких как кишечная палочка, которые имеют прочные клеточные стенки. Этот метод обеспечивает физический метод сдвига клеточной стенки и мембраны, что делает его предпочтительным методом получения бактериальных лизатов в лабораториях молекулярной биологии и биохимии.
- Какие процессы следуют за этапом соникации?
После ультразвукового лизиса обычно проводится фракционирование лизата, целевое выделение органелл и дальнейшая экстракция или очистка белков.
Затем обработанный лизат разделяют и подготавливают для аналитических или функциональных приложений, таких как протеомика высокого разрешения, транскриптомика или исследования связывания рецепторов.
Литература/Литература
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.