Обработка ультразвуком для лизиса клеток: разрушение клеток и экстракция

Ультразвуковой лизис клеток – широко применяемый метод подготовки образцов в современных биотехнологических лабораториях. Его основная цель – разрушение клеточных мембран или целых клеток для высвобождения внутриклеточных компонентов, таких как белки, нуклеиновые кислоты или органеллы. В повседневной лабораторной работе это означает, что обработка ультразвуком является стандартным методом контролируемого разрушения клеток и эффективной экстракции биомолекул. Ключевое преимущество ультразвуковых аппаратов заключается в возможности точно регулировать важнейшие параметры процесса, включая интенсивность ультразвука, пульсацию и контроль температуры. Такой контроль позволяет исследователям добиваться надежного лизиса, сводя к минимуму термическое или механическое повреждение чувствительных биомолекул, что обеспечивает щадящий и при этом высокоэффективный процесс экстракции.

Лизис клеток с помощью ультразвуковых аппаратов

Ультразвуковой лизис клеток использует акустическую кавитацию для разрушения клеточных мембран и высвобождения внутриклеточных молекул. Hielscher Ultrasonics предлагает как классический ультразвуковой аппарат зондового типа, так и ультразвуковые аппараты для стерильной обработки нескольких образцов: VialTweeter для нескольких пробирок и флаконов и ультразвуковой аппарат UIP400MTP для 96-луночных планшетов, предназначенный для стандартных микропланшетов.

Hielscher Ultrasonics поставляет мощные бесконтактные ультразвуковые аппараты для подготовки образцов и клинического анализа. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов, VialTweeter, CupHorn и проточный ультразвуковой аппарат GDmini2 обрабатывают образцы в стерильных условиях.

Обработка ультразвуком с помощью лабораторных дезинтеграторов UP100H и UP400St для подготовки образцов. (гомогенизация, лизис клеток, экстракция)

Ультразвуковые гомогенизаторы UP100H (100 ватт) и UP400St (400 ватт): обработка ультразвуком для лизиса клеток и экстракции.

Ультразвуковые гомогенизаторы для лизиса клеток и экстракции

Тип ультразвукового устройства	Основная область применения	Объем образца	Типичный вариант применения	Преимущества	Примеры моделей
Ультразвуковые аппараты зондового типа	Обработка ультразвуком одного образца	От 0,1 mL до ~1000 mL	Лизис клеток, экстракция белков, фрагментация ДНК/РНК	Точный контроль энергии; различные сонотроды; оптимальны для образцов малого и среднего объема	UP100H, UP200St, UP400St
VialTweeter / CupHorn	Параллельная обработка нескольких герметично закрытых флаконов	8–10 флаконов (~1–20 mL каждый)	Стандартизированный лизис нескольких клеточных суспензий	Равномерная обработка ультразвуком; предотвращает перекрестное загрязнение; воспроизводимые результаты	VialTweeter, CupHorn
Ультразвуковой аппарат для 96-луночных планшетов	Обработка ультразвуком многолуночных и микротитрационных планшетов	Формат микропланшета	Высокопроизводительный скрининг, протеомика, клеточные анализы	Одновременная равномерная обработка ультразвуком во всех лунках; идеально подходит для рабочих процессов с несколькими образцами	UIP400MTP
Реакторы с проточными ячейками	Непрерывная обработка ультразвуком больших объемов	>1 L, с возможностью масштабирования	Разрушение клеток в промышленном масштабе, производство экстрактов	Непрерывная обработка; возможность масштабирования; полный контроль процесса (амплитуда, давление, температура)	UIP1000hdT, UIP2000hdT + проточная ячейка
Системы стерильной / непрямой обработки ультразвуком	Обработка образцов без загрязнения	Зависит от флакона/пробирки/микропланшета	Чувствительные образцы, стерильные условия, работа в условиях нормативного регулирования	Без контакта с зондом; предотвращает перенос загрязнений между образцами; минимальные затраты усилий на очистку	VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP

Преимущества применения обработки ультразвуком для лизиса клеток

По сравнению с другими методами лизиса клеток и экстракции ультразвуковой лизис клеток имеет ряд преимуществ:

Скорость: Ультразвуковой лизис клеток и экстракция – быстрый метод, который позволяет разрушать клетки за считанные секунды. Это значительно быстрее, чем другие методы, такие как гомогенизация, замораживание и оттаивание или измельчение в бисерной мельнице.
Эффективность: Ультразвуковой лизис клеток и экстракцию можно применять для обработки малых, больших или нескольких образцов одновременно, что делает этот метод более эффективным, чем другие методы, требующие индивидуальной обработки малых образцов.
Без химических реагентов: Ультразвуковой лизис клеток и экстракция – неинвазивный метод, не требующий применения агрессивных химических реагентов или ферментов. Это делает его идеальным для применений, в которых необходимо сохранить целостность содержимого клеток. Нежелательного загрязнения образцов можно избежать.
Высокий выход: Ультразвуковой лизис клеток и экстракция позволяют получать высокий выход содержимого клеток, включая ДНК, РНК и белки. Это происходит потому, что высокочастотные звуковые волны разрушают клеточные стенки и высвобождают содержимое в окружающий раствор.
Контроль температуры: Современные ультразвуковые аппараты позволяют точно контролировать температуру образца. Цифровые ультразвуковые аппараты Hielscher оснащены подключаемым датчиком температуры и программным обеспечением для мониторинга температуры.
Воспроизводимость: Протоколы ультразвукового лизиса клеток можно легко воспроизводить и даже адаптировать к различным большим или меньшим объемам образцов посредством простого линейного увеличения масштаба.
Универсальность: Ультразвуковой лизис клеток и экстракцию можно применять для экстракции широкого спектра типов клеток, включая бактерии, дрожжи, грибы, растительные клетки и клетки млекопитающих. Этот метод также можно использовать для экстракции различных типов молекул, включая белки, ДНК, РНК и липиды.
Одновременная подготовка множества образцов: Hielscher Ultrasonics предлагает несколько решений для удобной обработки множества образцов в совершенно одинаковых условиях процесса. Это делает этап подготовки образцов посредством лизиса и экстракции высокоэффективным и позволяет экономить время.
Простота использования: Оборудование для ультразвукового лизиса клеток и экстракции просто в использовании и требует минимального обучения. Оборудование также экономично, поскольку требует однократного вложения средств без необходимости повторной закупки одноразовых расходных материалов. Это делает его привлекательным для широкого круга исследователей и лабораторий.

В целом ультразвуковой лизис клеток и экстракция – быстрый, эффективный, точно управляемый и универсальный метод извлечения содержимого клеток. Его преимущества перед альтернативными методами делают его привлекательным выбором для широкого спектра исследовательских и промышленных применений.

В этом руководстве объясняется, какой тип ультразвукового гомогенизатора лучше всего подходит для ваших задач пробоподготовки, таких как лизис, разрушение клеток, выделение белков, фрагментация ДНК и РНК в лабораторной, аналитической и исследовательской работе. Выберите оптимальный тип ультразвукового гомогенизатора с учётом вашей задачи, объёма и количества образцов, а также требуемой производительности. У Hielscher Ultrasonics есть идеальный ультразвуковой гомогенизатор для вас!

Принцип действия ультразвукового лизиса клеток

Ультразвуковой лизис клеток и экстракция используют высокочастотные звуковые волны для разрушения клеток и извлечения их содержимого. Звуковые волны создают изменения давления в окружающей жидкости, вызывая образование и схлопывание небольших пузырьков в процессе, известном как кавитация. Эти пузырьки создают локальные механические силы очень высокой интенсивности, которые могут разрушать клетки и высвобождать их содержимое в окружающий раствор.

Лизис клеток с помощью ультразвукового аппарата обычно включает следующие этапы:

Образец помещают в пробирку или емкость с жидким буферным раствором.
В образец вводят ультразвуковой зонд и воздействуют высокочастотными звуковыми волнами с частотой приблизительно 20–30 kHz.
Ультразвуковые волны вызывают колебания и кавитацию в окружающей жидкости, создавая локальные силы, которые разрушают клетки и высвобождают их содержимое.
Образец центрифугируют или фильтруют для удаления клеточных остатков, а извлеченное содержимое собирают для последующего анализа.

Недостатки распространенных методов лизиса

Работая в лабораториях, вы, возможно, уже сталкивались с трудностями лизиса клеток при использовании традиционных протоколов механического или химического лизиса.

Механический лизис: Методы механического лизиса, такие как растирание в ступке пестиком или гомогенизация с помощью пресса Френча, бисерной мельницы либо роторно-статорной системы, часто не обеспечивают возможности точного контроля и регулирования. Это означает, что измельчение и растирание могут быстро приводить к выделению тепла и возникновению сил сдвига, которые могут повредить образец и вызвать денатурацию белков. Эти методы также могут требовать много времени и большого количества исходного материала.
Химический лизис: Методы химического лизиса, такие как лизис с использованием детергентов, могут повреждать образец, разрушая липидный бислой и вызывая денатурацию белков. Они также могут требовать нескольких этапов и оставлять остаточные загрязняющие вещества, которые мешают последующему применению. Поиск оптимальной дозировки детергента представляет собой дополнительную трудность.
Циклы замораживания и оттаивания: Циклы замораживания и оттаивания могут вызывать разрыв клеточных мембран, однако повторные циклы также могут приводить к денатурации и деградации белков. Этот метод также может требовать нескольких циклов, что может занимать много времени и часто приводит к снижению выхода.
Ферментативный лизис: Методы ферментативного лизиса могут быть специфичны для определенных типов клеток и требовать нескольких этапов, что делает их длительными. Они также приводят к образованию отходов и требуют тщательной оптимизации, чтобы избежать деградации образца. Наборы для ферментативного лизиса часто стоят дорого. Если ваша текущая процедура ферментативного лизиса дает недостаточные результаты, для усиления разрушения клеток можно применить обработку ультразвуком как синергетический метод.

В отличие от традиционных механических и химических методов лизиса клеток, обработка ультразвуком является очень эффективным и надежным средством разрушения клеток, позволяющим полностью контролировать параметры обработки ультразвуком. Это обеспечивает высокую избирательность высвобождения веществ и чистоту продукта. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Она подходит для всех типов клеток и легко применяется в малом и большом масштабе – всегда в контролируемых условиях. Ультразвуковые аппараты легко очищать. Ультразвуковой гомогенизатор всегда имеет функции очистки на месте (CIP) и стерилизации на месте (SIP). Сонотрод представляет собой массивный титановый рупор, который можно протирать или промывать водой либо растворителем (в зависимости от рабочей среды). Благодаря прочности ультразвуковых аппаратов потребность в их техническом обслуживании практически ничтожна.

Ультразвуковой лизис и разрушение клеток

Обычно лизис образцов в лаборатории занимает от 15 секунд до 2 минут. Поскольку интенсивность обработки ультразвуком очень легко регулировать настройкой амплитуды и времени обработки ультразвуком, а также выбором подходящего оборудования, клеточные мембраны можно разрушать очень мягко или очень резко в зависимости от структуры клеток и цели лизиса (например, экстракция ДНК требует более мягкой обработки ультразвуком, а полная экстракция белков из бактерий требует более интенсивной обработки ультразвуком). Температуру во время процесса можно отслеживать с помощью встроенного датчика температуры и легко контролировать посредством охлаждения (ледяная баня или проточные ячейки с охлаждающими рубашками) либо обработки ультразвуком в импульсном режиме. При обработке ультразвуком в импульсном режиме короткие циклы ультразвукового воздействия длительностью 1–15 секунд позволяют рассеивать тепло и охлаждать образец в течение более продолжительных пауз.
Все процессы, осуществляемые с помощью ультразвука, полностью воспроизводимы и линейно масштабируемы.

VialTweeter – ультразвуковой аппарат для нескольких образцов, обеспечивающий надежную гомогенизацию образцов в стерильных условиях.

VialTweeter представляет собой ультразвуковой гомогенизатор для одновременной, равномерной и быстрой стерильной подготовки множества образцов.

Пример процедуры ультразвукового лизиса бактериальных клеток:

Подготовка клеточной суспензии: клеточные осадки необходимо полностью суспендировать в буферном растворе посредством гомогенизации (выберите буферный раствор, совместимый с последующим анализом, например с конкретным методом хроматографии). При необходимости добавьте лизоцимы и/или другие добавки (они также должны быть совместимы со средствами разделения/очистки). Осторожно перемешивайте/гомогенизируйте раствор при мягкой обработке ультразвуком до полного суспендирования.
Узнайте больше о синергетическом действии лизоцимов в сочетании с обработкой ультразвуком!
Ультразвуковой лизис: поместите образец в ледяную баню. Для разрушения клеток обрабатывайте суспензию ультразвуком сериями воздействий длительностью 60–90 секунд (используя импульсный режим вашего ультразвукового аппарата).
Разделение: центрифугируйте лизат (например, 10 мин. при 10 000 x g; при 4degC). Осторожно отделите надосадочную жидкость от клеточного осадка. Надосадочная жидкость представляет собой полный клеточный лизат. После фильтрации надосадочной жидкости вы получите осветленную жидкость, содержащую растворимый клеточный белок.

В видео показана система ультразвуковой пробоподготовки UIP400MTP, которая обеспечивает надёжную подготовку образцов в любых стандартных многолуночных планшетах с помощью высокоинтенсивного ультразвука. Типичные области применения UIP400MTP включают лизис клеток, фрагментацию ДНК, РНК и хроматина, а также экстракцию белков.

Наиболее распространенные области применения ультразвуковых аппаратов в биологии и биотехнологии:

Приготовление клеточных экстрактов
Разрушение дрожжей, бактерий, растительных клеток, мягких или твердых клеточных тканей, нуклеинового материала
Экстракция белков
Получение и выделение ферментов
Производство антигенов
Экстракция ДНК и/или целенаправленная фрагментация
Приготовление липосом

Разрушение клеток, лизис и экстракция с помощью ультразвука – эффективный метод подготовки образцов в лабораториях.

Разрушение клеток ультразвуковым аппаратом зондового типа – эффективный метод подготовки образцов.

Связанные темы

Многообразные области применения ультразвука охватывают биотехнологию, биоинженерию, микробиологию, молекулярную биологию, биохимию, иммунологию, бактериологию, вирусологию, протеомику, генетику, физиологию, клеточную биологию, гематологию и ботанику.

Лизис: разрушение клеточных структур

Клетки защищены полупроницаемой плазматической мембраной, которая состоит из фосфолипидного бислоя (также белково-липидного бислоя; образован гидрофобными липидами и гидрофильными молекулами фосфора со встроенными молекулами белков) и создает барьер между внутренним содержимым клетки (цитоплазмой) и внеклеточной средой. Растительные и прокариотические клетки окружены клеточной стенкой. Из-за толстой многослойной клеточной стенки из целлюлозы растительные клетки труднее подвергать лизису, чем животные. Внутренние компоненты клетки, такие как органеллы, ядро и митохондрия, стабилизируются цитоскелетом.
Цель лизиса клеток – извлечение и разделение органелл, белков, ДНК, мРНК или других биомолекул.

Традиционные методы лизиса клеток и их недостатки

Существует несколько методов лизиса клеток, которые можно разделить на механические и химические; они включают использование детергентов или растворителей, применение высокого давления либо использование бисерной мельницы или пресса Френча. Наиболее существенный недостаток этих методов – сложность контроля и регулирования параметров процесса и, следовательно, оказываемого воздействия.
В таблице ниже приведены основные недостатки распространенных методов лизиса:

В таблице перечислены традиционные методы разрушения и лизиса клеток и показаны основные недостатки каждого метода.

Таблица: традиционные методы лизиса клеток имеют существенные недостатки

Процедура лизиса

Лизис – процесс, требующий осторожности. Во время лизиса разрушается защита, обеспечиваемая клеточной мембраной, однако необходимо предотвращать инактивацию, денатурацию и деградацию извлеченных белков под действием нефизиологической среды (отклонение от значения pH). Поэтому лизис обычно проводят в буферном растворе. Большинство трудностей возникает из-за неконтролируемого разрушения клеток, приводящего к нецелевому высвобождению всего внутриклеточного материала и/или денатурации целевого продукта.

Часто задаваемые вопросы об обработке ультразвуком и лизисе клеток

Можно ли проводить лизис клеток с помощью обработки ультразвуком? Да, обработка ультразвуком эффективно вызывает лизис клеток посредством высокочастотных ультразвуковых волн, вызывающих кавитацию – явление, при котором в клеточной суспензии образуются крошечные пузырьки пара, которые затем резко схлопываются. Возникающие механические силы разрушают клеточные мембраны и способствуют высвобождению внутриклеточных компонентов в жидкость.
Как использовать ультразвуковой аппарат для лизиса клеток? Использование ультразвукового аппарата для лизиса клеток предполагает погружение его зонда в клеточную суспензию и регулирование таких параметров, как амплитуда и длительность импульса. Процесс следует тщательно контролировать, чтобы оптимизировать разрушение клеток, сводя к минимуму денатурацию белков и инактивацию ферментов.
На каком принципе основана обработка ультразвуком для лизиса клеток? Обработка ультразвуком основана на принципе акустической кавитации. Ультразвуковая энергия передается в жидкую среду, вызывая быстрые колебания давления, которые приводят к образованию и схлопыванию микропузырьков. Эти схлопывания создают интенсивные силы сдвига и локальные высокие температуры, разрушая клеточные структуры и повышая однородность лизата.
Сколько времени занимает обработка ультразвуком для лизиса клеток? Длительность обработки ультразвуком для лизиса клеток может существенно различаться в зависимости от таких факторов, как тип клеток, плотность клеток, мощность ультразвукового аппарата и конкретный используемый протокол. Типичные процедуры могут занимать от нескольких секунд до нескольких минут; их часто проводят циклами, чтобы контролировать выделение тепла и обеспечивать равномерное разрушение клеток.
Какова цель обработки ультразвуком при экстракции белков? При экстракции белков обработка ультразвуком служит для эффективного разрушения клеточных мембран и солюбилизации белков. Этот метод особенно полезен для высвобождения белков из внутриклеточных компартментов, что делает его необходимым для приготовления лизатов, из которых белки предстоит очищать или анализировать.
Почему для экстракции используют обработку ультразвуком? Обработку ультразвуком предпочитают для экстракции благодаря ее быстрому действию и способности направленно передавать энергию, разрушая клеточные структуры для высвобождения биоактивных молекул без применения агрессивной химической обработки и тем самым сохраняя функциональную целостность извлеченных соединений.
Нарушает ли обработка ультразвуком белок-белковые взаимодействия? Хотя обработка ультразвуком может эффективно разрушать клеточные мембраны, она также может нарушать белок-белковые взаимодействия. Степень нарушения зависит от интенсивности обработки ультразвуком и длительности воздействия, что потенциально может приводить к денатурации или диссоциации белковых комплексов и влиять на последующие аналитические или функциональные исследования.
Можно ли использовать обработку ультразвуком для лизиса E. coli? Ультразвуковые аппараты Hielscher особенно эффективны для лизиса бактериальных клеток, таких как E. coli, имеющих прочные клеточные стенки. Эта технология обеспечивает физический способ разрушения клеточной стенки и мембраны посредством сдвига, что делает ее предпочтительным методом приготовления бактериальных лизатов в лабораториях молекулярной биологии и биохимии.
Какие процессы следуют за этапом обработки ультразвуком?
Последующие этапы после ультразвукового лизиса обычно включают фракционирование лизата, целевое выделение органелл и дальнейшую экстракцию или очистку белков.
Затем обработанный лизат разделяют и подготавливают для аналитических или функциональных применений, таких как протеомика высокого разрешения, транскриптомика или исследования связывания с рецепторами.

Литература/ссылки

Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.