Обработка ультразвуком для лизиса: разрушение и экстракция клеток

Распад или лизис клеток является распространенной частью ежедневной пробоподготовки в биотехнологических лабораториях. Целью лизиса является разрушение частей клеточной стенки или всей клетки для высвобождения биологических молекул. Ультразвуковые гомогенизаторы широко используются для успешного лизиса клеток. Основным преимуществом сложных ультразвуковых аппаратов является точный контроль параметров процесса, таких как интенсивность и температура, что позволяет обеспечить мягкое, но высокоэффективное разрушение и извлечение клеток.

Лизис клеток с помощью ультразвука

Ультразвуковой лизис и экстракция клеток - это метод, используемый для разрушения открытых клеток и извлечения содержимого с использованием высокочастотных звуковых волн, то есть ультразвука. Обработка ультразвуком – это метод лизиса, который широко используется в качестве устоявшегося и надежного метода разрушения клеток и извлечения внутриклеточного материала. Ультразвуковой лизис является надежным методом получения содержания лизата, например, плазмиды, рецепторных анализов, белков, ДНК, РНК и т. Д. Поскольку интенсивность ультразвука может быть выровнена путем регулировки параметров процесса, оптимальная интенсивность ультразвука от очень мягкой до интенсивной может быть установлена индивидуально для каждого вещества и среды в соответствии с конкретными требованиями применения. Следующими этапами лизиса являются фракционирование, выделение органелл и/или экстракция и очистка белка. Извлеченный материал (= лизат) должен быть отделен и подлежит дальнейшим исследованиям или приложениям, например, для протеомных исследований.

По сравнению с другими методами лизиса и экстракции клеток, ультразвуковой лизис клеток имеет ряд преимуществ:

1. Скорость: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток - это быстрый метод, который может сломать клетки за считанные секунды. Это намного быстрее, чем другие методы, такие как гомогенизация, фриз-размораживание или измельчение бисера.
2. Эффективность: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток могут использоваться для обработки небольших, больших или нескольких образцов одновременно, что делает его более эффективным, чем другие методы, требующие индивидуальной обработки небольших образцов.
3. Без химикатов: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток является неинвазивным методом, который не требует использования агрессивных химических веществ или ферментов. Это делает его идеальным для приложений, где необходимо поддерживать целостность содержимого ячейки. Можно избежать нежелательного загрязнения образцов.
4. Высокая урожайность: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток могут извлекать высокий выход клеточного содержимого, включая ДНК, РНК и белки. Это связано с тем, что высокочастотные звуковые волны разрывают клеточные стенки и выпускают содержимое в окружающий раствор.
5. Контроль температуры: Сложные ультрасонциаторы позволяют точно контролировать температуру образца. Цифровые ультразвуковые hielscher оснащены подключаемым датчиком температуры и программным обеспечением для контроля температуры.
6. Воспроизводимый: Протоколы для ультразвукового лизиса клеток могут быть легко воспроизведены и даже сопоставлены с различными большими или меньшими объемами образцов простым линейным масштабированием.
7. Разносторонний: Ультразвуковой лизис и экстракция клеток могут быть использованы для извлечения широкого спектра типов клеток, включая бактерии, дрожжи, грибы, клетки растений и млекопитающих. Он также может быть использован для извлечения различных типов молекул, включая белки, ДНК, РНК и липиды.
8. Одновременная подготовка многочисленных образцов: Hielscher Ultrasonics предлагает несколько решений для комфортной обработки многочисленных образцов в точно таких же условиях процесса. Это делает этап подготовки образцов лизиса и экстракции высокоэффективным и экономящим время.
9. Простота в использовании: Оборудование для ультразвукового лизиса и экстракции клеток простое в использовании и требует минимальной подготовки. Оборудование также экономично, так как это единичная инвестиция без необходимости повторной покупки утилизации. Это делает его привлекательным для широкого круга исследователей и лабораторий.

В целом, ультразвуковой лизис и экстракция клеток является быстрым, эффективным, точно контролируемым и универсальным методом извлечения клеточного содержимого. Его преимущества перед альтернативными методами делают его привлекательным выбором для широкого спектра исследовательских и промышленных применений.

Принцип работы ультразвукового лизиса клеток

Ультразвуковой лизис и экстракция клеток использует высокочастотные звуковые волны для разрушения клеток и извлечения их содержимого. Звуковые волны создают изменения давления в окружающей жидкости, заставляя небольшие пузырьки образовываться и разрушаться в процессе, известном как кавитация. Эти пузырьки генерируют локализованные высокоинтенсивные механические силы, которые могут разрушать клетки и высвобождать их содержимое в окружающий раствор.

Лизис клеток с использованием ультразвукового аппарата обычно включает в себя следующие этапы:

• Образец помещают в пробирку или контейнер с жидким буфером.
• В образец вставляется ультразвуковой зонд и подаются высокочастотные звуковые волны с частотой около 20-30 кГц.
• Ультразвуковые волны вызывают колебания и кавитацию в окружающей жидкости, генерируя локализованные силы, которые разрывают клетки и высвобождают их содержимое.
• Образец центрифугируется или фильтруется для удаления любого клеточного мусора, а извлеченное содержимое собирается для последующего анализа.

Мощные ультразвуковые волны разрушают клеточный матрикс биологических структур и высвобождают биологически активные соединения. Массоперенос между растительным материалом и растворителем (например, буфером) усиливается. (иллюстрация: ©Вилху и др., 2006)

Недостатки распространенных методов лизиса

Во время работы в лабораториях вы, возможно, уже испытывали хлопоты клеточного лизиса с использованием традиционных протоколов механического или химического лизиса.

• Механический лизис: Методы механического лизиса, такие как измельчение раствором и пестиком или гомогенизация с использованием френч-пресса, бисерной мельницы или роторно-статорной системы, часто не имеют опций контроля и регулировки. Это означает, что использование измельчения и измельчения может быстро генерировать тепло и сдвиговые силы, которые могут повредить образец и денатурировать белки. Они также могут занимать много времени и требовать большого количества исходного материала.
• Химический лизис: Методы химического лизиса, такие как лизис на основе моющих средств, могут повредить образец, нарушая липидный бислой и денатурируя белки. Они также могут потребовать нескольких шагов и могут оставлять остаточные загрязняющие вещества, которые мешают последующим приложениям. Поиск оптимальной дозировки моющего средства является дополнительной проблемой.
• Циклы замораживания-оттаивания: Циклы замораживания-оттаивания могут привести к разрыву клеточных мембран, но повторные циклы также могут вызвать денатурацию и деградацию белка. Этот метод также может потребовать нескольких циклов, что может занять много времени и часто приводит к снижению урожайности.
• Ферментативный лизис: Методы ферментативного лизиса могут быть специфичными для определенных типов клеток и требуют нескольких этапов, что делает их трудоемкими. Они также генерируют отходы и требуют тщательной оптимизации, чтобы избежать деградации образца. Наборы ферментативного лизиса часто стоят дорого. Если ваша текущая процедура ферментативного лизиса дает недостаточные результаты, обработка ультразвуком как синергетический метод может быть применена для усиления разрушения клеток.

В отличие от обычных механических и химических методов лизиса клеток, обработка ультразвуком является очень эффективным и надежным инструментом для распада клеток, который позволяет полностью контролировать параметры ультразвука. Это обеспечивает высокую селективность по выпуску материалов и чистоте продукта. [см. Баласундарам и др., 2009]
Он подходит для всех типов клеток и легко применяется в малых и больших масштабах – всегда в контролируемых условиях. Ультразвуковые аппараты легко чистятся. Ультразвуковой гомогенизатор всегда оснащен функцией «чистый на месте» (CIP) и «стерилизовать на месте» (SIP). Сонотрод состоит из массивного титанового рога, который можно протирать или промывать водой или растворителем (в зависимости от рабочей среды). Обслуживание ультразвуковых аппаратов обусловлено их надежностью практически пренебрежительной.

Ультразвуковой лиз и нарушение работы клеток

Как правило, лизис образцов в лаборатории занимает от 15 секунд до 2 минут. Поскольку интенсивность ультразвуковой обработки очень легко регулировать по амплитуде, устанавливающей время обработки ультразвуком, а также путем выбора правильного оборудования, можно очень быстро или очень резко разрушить клеточные мембраны в зависимости от структуры клетки и с целью лизиса ( например, экстракция ДНК требует более мягкой ультразвуковой обработки, полная белковая экстракция бактерий требует более интенсивной ультразвуковой обработки). Температура во время процесса может контролироваться встроенным температурным датчиком и может легко регулироваться охлаждением (ледяная ванна или проточные ячейки с охлаждающими рубашками) или ультразвуком в импульсном режиме. Во время импульсно-ультразвуковой обработки короткие короткие импульсы ультразвуковой обработки продолжительностью 1-15 секунд позволяют рассеивать и охлаждать тепло в течение более продолжительных периодов времени.
Все процессы, управляемые ультразвуком, полностью воспроизводимы и линейно масштабируемы.

Ультразвуковые гомогенизаторы для лизиса и экстракции клеток

Различные типы ультразвуковых устройств позволяют соответствовать цели подготовки образцов и обеспечивать удобство использования и комфорт работы. Ультразвуковые аппараты зондового типа являются наиболее распространенными устройствами в лаборатории. Они наиболее подходят для подготовки малых и средних образцов объемами от 0,1 мл до 1000 мл. Различные размеры мощности и сонотроды позволяют адаптировать ультразвуковой аппарат к объему образца и сосуду для получения наиболее эффективных и действенных результатов обработки ультразвуком. Ультразвуковое зондовое устройство является лучшим выбором, когда необходимо подготовить отдельные образцы.

Если необходимо подготовить больше образцов, например, 8-10 флаконов клеточного раствора, интенсивная непрямая обработка ультразвуком с ультразвуковыми системами, такими как VialTweeter или ультразвуковой купгорн, является наиболее подходящим методом гомогенизации для эффективного лизиса. Несколько флаконов обрабатываются ультразвуком одновременно, с одинаковой интенсивностью. Это экономит не только время, но и обеспечивает одинаковую обработку всех образцов, что делает результаты среди образцов достоверными и сопоставимыми. Кроме того, во время непрямой обработки ультразвуком избегается перекрестное загрязнение путем погружения ультразвукового сонотрода (также известного как ультразвуковой зонд, рог, кончик или палец). Поскольку по отдельности к размеру образца используются флаконы, трудоемкая очистка и потеря проб из-за декантирования сосудов опущены. Для равномерной обработки ультразвуком многолуночных или микротитров пластин Hielscher предлагает UIP400MTP.
Для более высоких объемов, например для коммерческого производства клеточных экстрактов, наиболее подходящими являются непрерывные ультразвуковые системы с реактором с проточной ячейкой. Непрерывный и равномерный поток обрабатываемого материала обеспечивает равномерную обработку ультразвуком. Все параметры процесса ультразвуковой дезинтеграции могут быть оптимизированы и отрегулированы с учетом требований применения и конкретного материала ячейки.
 
 
Примерная процедура ультразвукового лизинга бактериальных клеток:

• Получение клеточной суспензии: клеточные гранулы должны быть полностью суспендированы в буферном растворе путем гомогенизации (выберите буферный раствор, совместимый со следующим анализом, например, методом специальной хроматографии). При необходимости добавьте лизоцимы и / или другие добавки (они также должны быть совместимы с средствами разделения / очистки). Смешивайте / гомогенизируйте раствор осторожно под мягкой обработкой ультразвуком до тех пор, пока не будет достигнута полная приостановка.
• Ультразвуковой лизис: поместите образец в ледяную баню. Для разрушения клеток ультразвуком удаляют суспензию при 60-90 секундных всплесках (используя импульсный режим ультразвука).
• Разделение: центрифуга лизата (например, 10 мин при 10000 мкг при 4 ° С). Отделите супернатант от клеточного осадка осторожно. Супернатант представляет собой полный клеточный лизат. После фильтрации надосадочной жидкости вы получаете осветленную жидкость растворимого клеточного белка.

 
 
Наиболее распространенными приложениями для ультразвуковых систем в биологии и биотехнологии являются:

• Подготовка экстракта клеток
• Разрушение дрожжей, бактерий, растительных клеток, мягких или твердых клеток, нуклеинового материала
• Выделение белков
• Получение и выделение ферментов
• Получение антигенов
• Выделение ДНК и / или целенаправленная фрагментация
• липосомальный препарат