Ультразвуковая технология Хильшера

Соникация Lysis: Сотовый срыв & экстракция

Дезинтеграция или лизис клеток является общей частью ежедневной подготовки проб в биотехнических лабораториях. Целью лизиса является разрушение частей клеточной стенки или полной клетки для высвобождения биологических молекул. Так называемый лизат может состоять, например, из плазмид, рецепторных анализов, белков, ДНК, РНК и т. Д. Следующими стадиями лизиса являются фракционирование, выделение органелл и / или экстракция и очистка белка. Выделенный материал (= лизат) должен быть отделен и подвергнут дальнейшим исследованиям или применениям, например, для протеомических исследований. Ультразвуковые гомогенизаторы являются обычным инструментом для успешного лизиса клеток. Поскольку интенсивность ультразвука может быть выровнена путем настройки параметров процесса, оптимальная интенсивность ультразвука от очень мягкого до очень жесткого может быть установлена ​​индивидуально для каждого вещества и среды, чтобы соответствовать конкретному требованию к применению.

Структура ячейки

Клетки защищены полупроницаемой плазматической мембраной, которая состоит из фосфолипидного бислоя (также белково-липидного бислоя, образованного гидрофобными липидами и молекулами гидрофильного фосфора со встроенными молекулами белка) и создает барьер между внутренними клетками (цитоплазмой) и внеклеточная среда. Растительные клетки и прокариотические клетки окружены клеточной стенкой. Из-за многослойной толстой клеточной стенки целлюлозы растительные клетки труднее лизировать, чем клетки животных. Внутренняя часть клетки, такая как органеллы, ядро, митохондрия, стабилизируется цитоскелетом.
Лизируя клетки, он направлен на извлечение и отделение органелл, белков, ДНК, мРНК или других биомолекул.

Соникация обычно используется для подготовки образца клеточной материи.

Рисунок 1: Ультразвуковая экстракция из клеток: микроскопическая поперечная секция (TS) апикального ствола мяты (Mentha piperita) показывает механизм действий при ультразвуковой экстракции из клеток (увеличение 2000x) [ресурс: Vilkhu et al. 2011]

методы

Существует несколько способов лизиса клеток, которые можно разделить на механические и химические методы, которые включают использование детергентов или растворителей, применение высокого давления или использование шаровой мельницы или французского пресса. Наиболее проблематичным недостатком этих методов является сложный контроль и регулировка параметров процесса и, тем самым, воздействие.
Основные недостатки общих методов лизиса:

Различные методы лизиса

Таблица. Обычные методы клеточного лизиса имеют серьезные недостатки.

Напротив, обработка ультразвуком - очень эффективный и надежный инструмент для дезинтеграции клеток, который позволяет полностью контролировать параметры ультразвуковой обработки. Это обеспечивает высокую селективность при выпуске материалов и чистоте продукта. [Balasundaram et al. 2009] Он подходит для всех типов клеток и легко применим в малых и больших масштабах. Ультразвуковые приборы легко очищаются. Ультразвуковой гомогенизатор всегда имеет функцию чистого на месте (CIP) и стерилизацию на месте (SIP). Сонотрод состоит из массивного титанового рожка, который можно протирать или промыть водой или растворителем (в зависимости от рабочей среды). Техническое обслуживание ультразвуковых аппаратов объясняется тем, что их устойчивость почти не учитывается.

лизис

Лизис является чувствительным процессом. Во время лизиса защита клеточной мембраны разрушается, однако необходимо предотвратить инактивацию, денатурацию и деградацию экстрагированных белков нефизической средой (отклонение от значения рН). Поэтому в общем случае лизис проводят в буферном растворе. Большинство трудностей возникают из-за неконтролируемого разрушения клеток, приводящего к нецелевому высвобождению всего внутриклеточного материала или / и денатурации целевого продукта.

Ультразвуковой лизис клеток можно использовать для подготовки проб в лаборатории и для производства больших объемов. Нажмите, чтобы увеличить!

Рисунок 1: мощный ультразвуковой гомогенизатор мощностью 200 Вт Uf200 ः т с цифровым управлением и автоматической записью данных для надежного и воспроизводимого клеточного лизиса.

Ультразвуковой лизис

Как правило, лизис образцов в лаборатории занимает от 15 секунд до 2 минут. Поскольку интенсивность ультразвуковой обработки очень легко регулировать по амплитуде, устанавливающей время обработки ультразвуком, а также путем выбора правильного оборудования, можно очень быстро или очень резко разрушить клеточные мембраны в зависимости от структуры клетки и с целью лизиса ( например, экстракция ДНК требует более мягкой ультразвуковой обработки, полная белковая экстракция бактерий требует более интенсивной ультразвуковой обработки). Температура во время процесса может контролироваться встроенным температурным датчиком и может легко регулироваться охлаждением (ледяная ванна или проточные ячейки с охлаждающими рубашками) или ультразвуком в импульсном режиме. Во время импульсно-ультразвуковой обработки короткие короткие импульсы ультразвуковой обработки продолжительностью 1-15 секунд позволяют рассеивать и охлаждать тепло в течение более продолжительных периодов времени.
Все процессы, управляемые ультразвуком, полностью воспроизводимы и линейно масштабируемы.

Ультразвуковой гомогенизатор VialTweeter для одновременной подготовки проб до 10 пробирок. (Нажмите, чтобы увеличить!)

Ультразвуковое устройство VialTweeter допускает одновременную пробоподготовки до 10 флаконов при тех же условиях процесса.

Ультразвуковые гомогенизаторы

Различные типы Ультразвуковые приборы позволяют согласовать цель подготовки образца и обеспечить удобство и удобство в работе. Ультразвуковые ультразвуковые приборы являются наиболее распространенными устройствами в лаборатории. Они наиболее подходят для приготовления образцов малого и среднего размера с объемами 0,1 мл до 1000 мл. Различные размеры мощности и сонотроды позволяют адаптировать ультразвук к объему образца и сосуду для наиболее эффективных и эффективных результатов ультразвукового исследования. Ультразвуковое зондирующее устройство является лучшим выбором, когда должны быть подготовлены отдельные образцы.

Если необходимо подготовить больше образцов, например 8 флаконов клеточного раствора, то такие устройства, как VialTweeter или ультразвуковой чашечка, являются наиболее подходящим гомогенизатором для лизиса. Несколько флаконов обрабатывают ультразвуком одновременно с той же интенсивностью. Это экономит не только время, но и обеспечивает одинаковое обращение со всеми образцами, что делает результаты среди образцов надежными и сопоставимыми. Кроме того, предотвращается перекрестное загрязнение путем погружения ультразвукового сонотрода (также известного как ультразвуковой зонд, рупор, наконечник или палец). Так как флаконы используются, длительная очистка и потеря образца из-за декантации сосудов опущены.
Для более высоких объемов, например для коммерческого производства клеточных экстрактов, наиболее подходящими являются непрерывные ультразвуковые системы с реактором с проточной ячейкой. Непрерывный и равномерный поток обрабатываемого материала обеспечивает равномерную обработку ультразвуком. Все параметры процесса ультразвуковой дезинтеграции могут быть оптимизированы и отрегулированы с учетом требований применения и конкретного материала ячейки.

Примерная процедура ультразвукового лизинга бактериальных клеток:

  • Получение клеточной суспензии: клеточные гранулы должны быть полностью суспендированы в буферном растворе путем гомогенизации (выберите буферный раствор, совместимый со следующим анализом, например, методом специальной хроматографии). При необходимости добавьте лизоцимы и / или другие добавки (они также должны быть совместимы с средствами разделения / очистки). Смешивайте / гомогенизируйте раствор осторожно под мягкой обработкой ультразвуком до тех пор, пока не будет достигнута полная приостановка.
  • Ультразвуковой лизис: поместите образец в ледяную баню. Для разрушения клеток ультразвуком удаляют суспензию при 60-90 секундных всплесках (используя импульсный режим ультразвука).
  • Разделение: центрифуга лизата (например, 10 мин при 10000 мкг при 4 ° С). Отделите супернатант от клеточного осадка осторожно. Супернатант представляет собой полный клеточный лизат. После фильтрации надосадочной жидкости вы получаете осветленную жидкость растворимого клеточного белка.

Наиболее распространенными приложениями для ультразвуковых систем в биологии и биотехнологии являются:

  • Подготовка экстракта клеток
  • нарушение дрожжей, бактерий, растительных клеток, мягких & ткань твердой клетки, нуклеиновый материал
  • Выделение белков
  • Получение и выделение ферментов
  • Получение антигенов
  • Выделение ДНК и / или целенаправленная фрагментация
  • липосомальный препарат
Высокомощные ультразвуковые гомогенизаторы, такие как UIP1000hd, используются для разрушения и извлечения клеток в режиме периодического или непрерывного потока. (Нажмите, чтобы увеличить!)

Ультразвуковые настольные системы, такие как Uip1000hd (1 кВт) может обрабатывать большие объемы биологического материала.

Многообразные применения ультразвука выделяются в секторах биотехнологии, биоинженерии, микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, иммунологии, бактериологии, вирусологии, протеомики, генетики, физиологии, клеточной биологии, гематологии и ботаники.

Для оценки и оптимизации приложений клиентов Hielscher Ultrasonics предлагает полностью оборудованный Лаборатория ультразвуковой обработки, Пожалуйста, свяжитесь с нами, чтобы получить дополнительную информацию!

Литература / Ссылки

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, DG (2009): Достижения в стратегии выпуска продукта и влияние на дизайн биопроцесса. Тенденции в биотехнологии 27/8, 2009. С. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasseh, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Ультразвуковое восстановление и модификация пищевых ингредиентов. В: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ультразвуковые технологии для производства продуктов питания и биообработки. Нью-Йорк: Springer, 2011. С. 345-368.

Свяжитесь с нами / Спросите дополнительную информацию

Поговорите с нами о ваших требованиях к обработке. Мы порекомендуем наиболее подходящие параметры настройки и обработки для вашего проекта.





Пожалуйста, обратите внимание на наши политика конфиденциальности,