Ультразвуковые приложения в MonkeyPox Virus
Ультразвук является важным методом обработки для выделения вируса оспы обезьян (MPXV) из аналитических образцов, для фрагментации ДНК вируса, а также для производства вакцины против оспы обезьян. Для пробоподготовки перед диагностикой и анализом (ПЦР, ИФА и др.) ультразвуковая обработка используется для лизирования клеток с целью высвобождения вируса оспы обезьян изнутри клетки и/или фрагмента ДНК. В производстве вакцин применение варьируется от получения вирусных частиц / ДНК, инкапсуляции в носителях лекарств и формулирования инокулы.
Ниже вы можете найти подробную информацию об ультразвуковой подготовке образца вируса оспы обезьян, а также о производстве вакцины против MPXV с ультразвуковой помощью.
Что вы найдете на этой странице:
- Ультразвуковой лизис для экстракции вируса оспы обезьян
- Ультразвуковая фрагментация ДНК вируса оспы обезьян
- Ультразвуковое применение в производстве вакцин MPXV
Эта система из 2 ультразвуковых аппаратов мощностью 1 кВт для непрерывной работы установлена на предприятии по производству вакцин.
Ультразвуковой лизис и фрагментация ДНК перед полимеразной цепной реакцией (ПЦР)
Вирусная инфекция оспы обезьян обнаруживается с помощью тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) с использованием цепной реакции в реальном времени или обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения уникальных последовательностей вирусной ДНК. Образец (например, из носоглоточного обмена или биопсии кожи) содержит вирус в клетках.
Для анализа вирус должен быть выпущен из клеток, а вирусная ДНК должна быть фрагментирована для ПЦР.
Ультразвуковой лизис:
Ультразвуковое разрушение клеток / лизис является надежным и эффективным методом выделения вирусов из образцов клеток и, следовательно, предпочтительным методом по сравнению с химическими агентами, такими как лизоцим, протеиназа К и различные моющие средства, которые альтернативно используются для достижения лизиса клеток и высвобождения ДНК.
Однако использование таких химических реагентов требует трудоемкой пробоподготовки в несколько этапов перед ПЦР-анализом, чтобы предотвратить ингибирование реакции ПЦР. Поскольку ингибиторы ПЦР влияют на эффективность амплификации, небольшие вариации количества ингибиторов, которые не удаляются, могут привести к большим вариациям в амплификации продукта ПЦР (Diaco, 1995).
Преимущество ультразвука для лизиса заключается в том, что желательно полное разрушение клеточных структур и высвобождение ДНК без необходимости лизирования реагентов и трудоемкой пробоподготовки. (см. Fykse et al., 2003)
Ультразвуковая фрагментация ДНК:
Ультразвуковая фрагментация ДНК проста и надежна, так как производит фрагменты ДНК, настраиваемые по длине (пары оснований, bp). Используя ультразвук, ДНК может быть эффективно фрагментирована до целевой длины ДНК. Точный контроль ультразвуковых параметров и сложные варианты охлаждения предотвращают деградацию ДНК.
Узнайте больше об ультразвуковой фрагментации ДНК!
Ультразвуковое применение в вакцине против вируса оспы обезьян
Вакцины, используемые против вируса оспы обезьян, в настоящее время являются живыми вирусными вакцинами. Недавно разработанные вакцины могут использовать другие платформы, такие как днк на основе В настоящее время содержит модифицированный Vaccinia Ankara viurs, ослабленный, невоспроизводящийся ортопоксвирус. Он также содержит трис (трис-аминометан) и хлорид натрия. Вакцина может также содержать небольшое количество ДНК и белка из клеток фибробластов куриного эмбриона, которые используются для выращивания вакцинного вируса, бензоназы и антибиотических соединений, таких как гентамицин и ципрофлоксацин.
Ультразвуковая гомогенизация используется в производстве живых аттенуированных вирусных вакцин, ДНК-вакцин, мультивалентных ДНК-коктейлей, мРНК-вакцин, рекомбинантных белковых вакцин, вирусоподобных вакцин с частицами и др.
- дисперсия вирусных частиц и агентов
- эмульгирование
- инактивация вирусов
- препарат-носитель (NLC, SLN)
- инкапсуляция
- растворение агентов
- подготовка адъювантов
- Дегазация / Де-Аэрация
Протокол ультразвуковой изоляции вируса оспы обезьян
Исследовательская группа Stittelaar (2005) использовала ультразвуковой лизис для высвобождения вируса оспы обезьян из культуры клеток-хозяев роста, а также из клеток, полученных с помощью замен горла от инфицированных приматов.
Препарат вакцины против оспы обезьян:
Вирусы оспы обезьян были выращены на клетках фибробластов куриного эмбриона без специфических патогенов. После инкубации в течение 1-2 дней суспензию вирусных клеток собирали одним раундом замораживания-оттаивания, а затем концентрировали центрифугированием. Гранулу повторно суспендировали и подвергли нескольким раундам ультразвуковой гомогенизации.
Выделение вируса оспы обезьян у вакцинированных макак:
Образцы трижды замораживали-размораживали и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковом CupHorn. Два разведения (1:10 и 1:100) в транспортной среде, дополненной 1% фетальной бычьей сывороткой, использовали для инокуляции монослоев клеток Vero в шестилуночных пластинах. После 1 ч инкубации при 37°С инокулы удаляли и заменяли питательной средой, дополненной 1% фетальной бычьей сывороткой. Монослои культивировали в течение 5 дней при 37°C и окрашивали кристаллическим фиолетовым раствором.
(см. Stittelaar et al., 2005)
Ультразвуковые аппараты для анализа вирусов и производства вакцин
Широкий ассортимент продукции Hielscher Ultrasonics предлагает идеальный ультразвуковой аппарат для исследовательских и аналитических лабораторий, а также для промышленного производства вакцин.
Hielscher Ultrasonics специализируется на разработке, производстве и распространении высокоэффективных ультразвуковых аппаратов и соно-биореакторов для использования в исследовательских и аналитических лабораториях, а также для внедрения в промышленное производство вакцин (например, вакцины, Api).
Обработка ультразвуком может применяться к открытым сосудам, закрытым реакторам с непрерывным перемешиванием и реакторам с непрерывным потоком. Все части ультразвуковых систем, которые контактируют с жидкой средой, изготовлены из нержавеющей стали, титана или стекла. Автоклавируемые детали и сантехническая арматура обеспечивают производство под фармацевтические условия.
Автоматическая запись данных: Интеллектуальное программное обеспечение автоматически записывает параметры процесса соники на интегрированной карте памяти SD. Точный контроль всех параметров процесса обеспечивает Воспроизводимость, стандартизация производства, и способствует соблюдению стандартов безопасности фармацевтической продукции.
Hielscher Ультразвук’ Ультразвуковые процессоры отличаются высокой надежностью и могут точно управляться. Все промышленные ультразвуковые аппараты могут регулироваться для обеспечения полного диапазона от более низких до очень высоких амплитуд. Надежность ультразвуковых систем Hielscher позволяет работать в режиме 24/7 в тяжелых условиях и в сложных условиях.
В приведенной ниже таблице приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых аппаратов:
| Объем партии | Скорость потока | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| многолуночные / микротитрные пластины | н/д | UIP400MTP |
| От 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл / мин | UP100H |
| От 10 до 2000 мл | От 20 до 400 мл / мин | Uf200 ः т, UP400St |
| 0.1 до 20L | 0.2 до 4L / мин | UIP2000hdT |
| От 10 до 100 литров | От 2 до 10 л / мин | UIP4000hdT |
| н/д | От 10 до 100 л / мин | UIP16000 |
| н/д | больше | кластер UIP16000 |
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
Ультразвуковая резка ДНК
Адаптировано из Jkwchui под CC-BY-SA.03
Литература / Ссылки
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidovudine in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Полезные сведения
Вирус оспы обезьян
Оспа обезьян (MPV, MPXV или hMPXV) является разновидностью двухцепочечного ДНК-вируса, который вызывает вирусное зоонозное заболевание. Это заболевание известно как инфекция оспы обезьян и может возникать у людей и животных. Относится к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae. Вирус оспы обезьян является одним из ортопоксвирусов человека наряду с вирусами оспы (VARV), коровьей оспы (CPX) и вакцинии (VACV). Ортопоксвирусы характеризуются крупными кирпичообразными вирусными частицами, содержащими двухцепочечный геном ДНК примерно 200 000 bp.
ИФА-анализ
ИФА расшифровывается как Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay и представляет собой меченый иммуноанализ, который считается золотым стандартом иммуноанализа. ИФА является иммунологическим тестом, ценимым за его высокую диагностическую чувствительность, используется для обнаружения и количественной оценки молекул, включая антитела, антигены, белки, гликопротеины и гормоны. Принцип ИФА основан на взаимодействии антиген-антитело. Посредством этого взаимодействия антиген-антитело специфические антитела связываются с его антигеном-мишенью. Только когда происходит взаимодействие, субстрат может связываться с ферментом и можно наблюдать последующую конверсию субстрата, что означает получение положительного результата.
Hielscher Ultrasonics производит высокую производительность ультразвуковых гомогенизаторов из лаборатория в промышленного размера.