Применение ультразвука при вирусе оспы обезьян
Ультразвуковое исследование является важным методом обработки для выделения вируса оспы обезьян (MPXV) из аналитических образцов, для фрагментации ДНК вируса, а также для производства вакцин против оспы обезьян. Для подготовки образцов перед диагностикой и анализом (ПЦР, ИФА и т.д.) ультразвуковое исследование используется для лизирования клеток с целью высвобождения вируса оспы обезьян из внутренней части клетки и/или фрагментации ДНК. В производстве вакцин используются такие сферы, как получение вирусных частиц / ДНК, инкапсуляция в носители лекарств и разработка инокуляции.
Ниже приведена подробная информация об ультразвуковой подготовке образцов вируса оспы обезьян, а также о производстве вакцины MPXV с помощью ультразвука.
Что вы найдете на этой странице:
- Ультразвуковой лизис для экстракции вируса оспы обезьян
- Ультразвуковая фрагментация ДНК вируса оспы обезьян
- Применение ультразвука в производстве вакцин MPXV
Эта система из 2 ультразвуковых аппаратов мощностью 1 кВт для непрерывной работы устанавливается на предприятии по производству вакцин.
Ультразвуковой лизис и фрагментация ДНК перед полимеразной цепной реакцией (ПЦР)
Вирусная инфекция оспы обезьян выявляется с помощью тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени или обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения уникальных последовательностей вирусной ДНК. Образец (например, из подкачки носоглотки или биопсии кожи) содержит вирус в клетках.
Для проведения анализа вирус должен быть высвобожден из клеток, а вирусная ДНК должна быть фрагментирована для проведения ПЦР.
Ультразвуковой лизис:
Ультразвуковое разрушение / лизис клеток является надежным и эффективным методом выделения вирусов из образцов клеток и, следовательно, предпочтительным методом по сравнению с химическими агентами, такими как лизоцим, протеиназа К и различные детергенты, которые в качестве альтернативы используются для достижения лизиса клеток и высвобождения ДНК.
Однако использование таких химических реагентов требует трудоемкой подготовки образца в несколько этапов перед ПЦР-анализом, чтобы предотвратить торможение ПЦР-реакции. Поскольку ингибиторы ПЦР влияют на эффективность амплификации, небольшие вариации количества ингибиторов, которые не удаляются, могут привести к большим вариациям амплификации продукта ПЦР (Diaco, 1995).
Преимущество ультразвукового исследования для лизиса заключается в том, что желательно полное разрушение клеточных структур и высвобождение ДНК без необходимости лизирования реагентов и трудоемкой пробоподготовки. (см. Fykse et al., 2003)
Ультразвуковая фрагментация ДНК:
Ультразвуковая фрагментация ДНК проста и надежна, так как позволяет получить фрагменты ДНК, перестраиваемые по длине (пары оснований,.н.). С помощью ультразвука ДНК может быть эффективно фрагментирована до целевой длины ДНК. Точный контроль ультразвуковых параметров и продуманные варианты охлаждения предотвращают деградацию ДНК.
Узнайте больше об ультразвуковой фрагментации ДНК!
Применение ультразвука в вакцине против вируса оспы обезьян
Вакцины, используемые против вируса оспы обезьян, в настоящее время являются живыми вирусными вакцинами. Недавно разработанные вакцины могут использовать другие платформы, такие как на основе ДНК. В настоящее время содержит модифицированный Vaccinia Ankara viurs, аттенуированный, нереплицирующийся ортопоксвирус. Он также содержит трис (трис-аминометан) и хлорид натрия. Вакцина также может содержать небольшое количество ДНК и белка из клеток фибробластов куриного эмбриона, которые используются для выращивания вакцинного вируса, бензоназы и антибиотических соединений, таких как гентамицин и ципрофлоксацин.
Ультразвуковая гомогенизация используется в производстве вакцин с живым аттенуированным вирусом, ДНК-вакцин, поливалентных ДНК-коктейлей, мРНК-вакцин, рекомбинантных белковых вакцин, вирусоподобных вакцин и т.д.
- диспергирование вирусных частиц и агентов
- эмульгирование
- Инактивация вирусов
- лекарственный носитель (NLC, SLN)
- инкапсуляция
- растворение реагентов
- Приготовление адъювантов
- Дегазация / Деаэрация
Протокол ультразвуковой изоляции вируса оспы обезьян
Исследовательская группа Stittelaar (2005) использовала ультразвуковой лизис для высвобождения вируса оспы обезьян из культуры клеток роста-хозяина, а также из клеток, полученных путем обмена горлом у инфицированных приматов.
Подготовка вакцины против оспы обезьян:
Вирусы оспы обезьян выращивали на клетках фибробластов куриных эмбрионов, не содержащих специфических патогенов. После инкубации в течение 1-2 дней суспензию вирусных клеток собирали путем одного раунда замораживания-размораживания, а затем концентрировали центрифугированием. Гранула была ресуспендирована и подвергнута нескольким раундам ультразвуковой гомогенизации.
Выделение вируса оспы обезьян от вакцинированных макак:
Образцы были трижды заморожены, разморожены и обработаны ультразвуком в ультразвуковом CupHorn. Два разведения (1:10 и 1:100) в транспортной среде с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки использовали для инокуляции монослоев клеток Vero в шестилуночные планшеты. Через 1 ч инкубации при 37°С посевной материал удаляли и заменяли питательной средой с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки. Монослои культивировали в течение 5 дней при 37°С и окрашивали кристаллическим фиолетовым раствором.
(ср. Stittelaar et al., 2005)
Ультразвуковые аппараты для анализа вирусов и производства вакцин
Широкий ассортимент продукции Hielscher Ultrasonics предлагает идеальный ультразвуковой аппарат для исследовательских и аналитических лабораторий, а также для промышленного производства вакцин.
Hielscher Ultrasonics специализируется на разработке, производстве и распространении высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов и сонобиореакторов для использования в исследовательских и аналитических лабораториях, а также для внедрения в промышленное производство вакцин (например, Вакцины, Пчела).
Ультразвуковая обработка может применяться в открытых резервуарах, закрытых реакторах с непрерывным перемешиванием и проточных реакторах непрерывного действия. Все части ультразвуковых систем, которые контактируют с жидкой средой, изготовлены из нержавеющей стали, титана или стекла. Автоклавируемые детали и санитарная арматура обеспечивают производство при Условия фармацевтического класса.
Автоматическая запись данных: Интеллектуальное программное обеспечение автоматически записывает параметры процесса ультразвуковой обработки на встроенную карту памяти SD. Точный контроль всех параметров процесса обеспечивает воспроизводимость, Стандартизация производства, а также способствует выполнению стандартов безопасности фармацевтической продукции.
Hielscher Ultrasonics’ Ультразвуковые процессоры отличаются высокой надежностью и точным управлением. Все промышленные ультразвуковые аппараты могут быть отрегулированы для работы во всем диапазоне амплитуд от низких до очень высоких. Надежность ультразвуковых систем Hielscher позволяет работать в режиме 24/7 в тяжелых условиях и в сложных условиях.
В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов:
| Объем партии | Расход | Рекомендуемые устройства |
|---|---|---|
| Многолуночные / микротитровальные планшеты | н/д | UIP400MTP |
| от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин | УП100Ч |
| от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
| 0.1 до 20 л | 0от 0,2 до 4 л/мин | УИП2000HDT |
| От 10 до 100 л | От 2 до 10 л/мин | УИП4000HDT |
| н/д | От 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
| н/д | больше | Кластер UIP16000 |
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
Ультразвуковой сдвиг ДНК
Адаптировано из Jkwchui под лицензией CC-BY-SA.03
Литература / Литература
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Факты, которые стоит знать
Вирус оспы обезьян
Оспа обезьян (MPV, MPXV или hMPXV) — это разновидность вируса двухцепочечной ДНК, вызывающая вирусное зоонозное заболевание. Это заболевание известно как инфекция оспы обезьян и может возникать у людей и животных. Он принадлежит к роду Orthopoxvirus в семействе Poxviridae. Вирус оспы обезьян является одним из ортопоксвирусов человека наряду с вирусами натуральной оспы (VARV), коровьей оспы (CPX) и коровьей оспы (VACV). Ортопоксвирусы характеризуются крупными вирусными частицами в форме кирпича, содержащими двухцепочечный геном ДНК размером около 200 000.н.
Анализ методом ИФА
ИФА расшифровывается как Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay и представляет собой меченый иммуноферментный анализ, который считается золотым стандартом иммунологических анализов. ИФА — это иммунологический тест, ценимый за высокую диагностическую чувствительность, используемый для обнаружения и количественного определения молекул, включая антитела, антигены, белки, гликопротеины и гормоны. Принцип проведения ИФА основан на взаимодействии антиген-антитело. Благодаря этому взаимодействию антиген-антитело специфические антитела связываются со своим целевым антигеном. Только когда происходит взаимодействие, субстрат может связываться с ферментом и может наблюдаться последующая конверсия субстрата, что означает получение положительного результата.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.