Formação de fibrilhas amilóides utilizando o Sonicador de Microplacas UIP400MTP

As fibrilas amilóides, tal como os cristais, formam-se através de um processo de nucleação e subsequente crescimento. No entanto, devido à elevada barreira de energia livre da nucleação, a formação espontânea de fibrilas amilóides só ocorre após uma fase de atraso prolongada. Ultrasonication surgiu como uma ferramenta poderosa para induzir a nucleação amiloide, acelerando assim significativamente a formação de fibrilas. Quando combinada com um leitor de microplacas que utiliza a fluorescência da tioflavina T (ThT), a ultrassonografia permite a deteção de alto rendimento de fibrilas amilóides em várias amostras simultaneamente.

Formação de fibrilas amilóides induzida por ultra-sons com o Sonicador de Microplacas UIP400MTP

Com o sonicador de placas multipoços UIP400MTP, é possível sintetizar rapidamente fibrilhas amilóides da mesma qualidade em grandes quantidades para fins de investigação. Esta abordagem eficiente permite estudar a amiloidogenicidade das proteínas. Esta técnica facilita a fibrilhação amiloide rápida e reprodutível, como demonstrado com a β2-microglobulina (β2-m), uma proteína amiloidogénica associada à amiloidose relacionada com a diálise.

Abordagem experimental simples: Fibrilação Amiloide Induzida por Ultra-sons

Para induzir a formação de fibrilas, uma microplaca de 96 poços foi colocada no centro do sonicador de placa multipoços UIP400MTP, o que garante uma exposição ultra-sónica uniforme em todos os poços. As condições experimentais foram as seguintes:

1. Cada poço continha 0,2 ml de solução de β2-microglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplementada com 5 μM ThT.
2. A placa foi submetida a ciclos de ultra-sons, tais como 1 minuto de ultra-sons seguido de 9 minutos de pausa.
3. Após a sonicação, a fluorescência do ThT foi medida utilizando um leitor de microplacas.

(cf. So et al., 2011)

Comparação com a agitação convencional

Em comparação com os métodos tradicionais de agitação, a ultrassonografia reduziu drasticamente a fase de atraso da formação de fibrilas. Sob condições convencionais de agitação de microplacas, apenas 1 de 10 poços exibiu aumento da fluorescência ThT após 20 horas. Em contraste, usando ultra-sons ciclados (15 minutos de sonicação seguido por 5 minutos de quiescência), um aumento significativo da fluorescência ThT foi detectado imediatamente após o primeiro tratamento de sonicação.

Aceleração rápida da cinética da fibrilhação

Os resultados obtidos a partir de So et al. (2011) demonstraram que a formação espontânea de fibrilas de β2-microglobulina a pH 2,5 pode ser acelerada de várias horas para apenas 10-15 minutos com ultrassom.
As imagens de microscopia de força atómica (AFM) confirmaram que as fibrilas geradas através de ultra-sons de 10 minutos a cada 15 minutos eram morfologicamente indistinguíveis das formadas utilizando ultra-sons de 1 minuto a cada 10 minutos. Isto destaca a reprodutibilidade e robustez da fibrilação amiloide induzida por ultra-sons.

Imagens AFM de fibrilas amilóides produzidas por ultra-sons de 1 minuto a cada 10 min (i), por sonicação de 10 minutos a cada 15 min (ii), e pela reação de sementeira sem ultra-sons (iii). A barra de escala branca representa 1 μm.
Estudo e imagens: ©So et al., 2011

Fibrilação em condições de pH neutro

Mesmo em condições de pH neutro, a formação de fibrilas foi conseguida após um tempo de atraso de 1,5 horas, demonstrando que a ultrassonografia reduz significativamente a barreira energética à nucleação e ao crescimento. Isto apoia ainda mais a hipótese de que a fibrilhação amiloide é principalmente uma reação física, em grande parte limitada pela barreira de energia de nucleação, que a ultra-sons reduz eficazmente.

Impacto na investigação das doenças relacionadas com a amiloide

A formação fácil e fiável de fibrilhas amilóides utilizando o sonicador de microplacas UIP400MTP tem implicações significativas na investigação da doença de Alzheimer (DA) e de outras perturbações relacionadas com amilóides, como a doença de Parkinson, a diabetes de tipo II e as amiloidoses sistémicas. Na DA, a agregação amiloide-β (Aβ) é uma caraterística patológica fundamental, mas o estudo da cinética da sua fibrilhação continua a ser um desafio devido às longas fases de atraso e à variabilidade dos métodos convencionais. A formação de fibrilas conduzida por ultrassom acelera a nucleação, garantindo alta reprodutibilidade e variabilidade reduzida, o que é crucial para a triagem de potenciais inibidores e a compreensão dos mecanismos amiloidogênicos. Para além disso, a capacidade de alto rendimento do UIP400MTP permite investigações em grande escala sobre o desdobramento e agregação de proteínas, facilitando a descoberta de agentes terapêuticos que podem modular a formação de fibrilhas e potencialmente mitigar a progressão neurodegenerativa.

Este estudo estabelece ultrassom usando o sonicador de placa multi-well UIP400MTP como um método altamente eficiente para acelerar a formação de fibrilas amilóides. As principais vantagens desta abordagem incluem:

• Redução drástica do tempo de atraso da fibrilhação.
• Exposição uniforme aos ultra-sons em todos os poços, permitindo a formação reprodutível de fibrilas.
• Capacidade de rastreio de elevado rendimento, o que o torna adequado para pesquisas de amiloidogenicidade de proteínas em todo o genoma.

Ao integrar a ultrassonografia com a deteção de fluorescência ThT, este método fornece uma plataforma rápida, escalável e fiável para o estudo da fibrilhação amiloide. Dada a sua eficiência e potencial de alto rendimento, esta abordagem pode facilitar a síntese fácil de fibrilas amilóides para investigação biofísica e farmacêutica, oferecendo uma ferramenta promissora para estudos relacionados com amilóides e rastreio de fármacos.