Formação de fibrilas amiloides com o sonicador de microplacas UIP400MTP

As fibrilas amiloides, tal como os cristais, formam-se através de um processo de nucleação e crescimento subsequente. No entanto, devido à elevada barreira de energia livre da nucleação, a formação espontânea de fibrilas amiloides ocorre apenas após uma fase de latência prolongada. A ultrassonicação surgiu como uma ferramenta poderosa para induzir a nucleação amiloide, acelerando assim significativamente a formação de fibrilas. Quando combinada com um leitor de microplacas que utiliza a fluorescência da tioflavina T (ThT), a ultrassonicação permite a deteção de fibrilas amiloides em múltiplas amostras simultaneamente, com elevada capacidade de processamento.

Formação de fibrilas amiloides induzida por ultrassons com o sonicador de microplacas UIP400MTP

Com o sonicador de placas multipoços UIP400MTP, é possível sintetizar rapidamente grandes quantidades de fibrilas amiloides com a mesma qualidade para fins de investigação. Esta abordagem eficiente permite estudar a amiloidogenicidade das proteínas. Esta técnica facilita a fibrilação amiloide rápida e reprodutível, conforme demonstrado com a β2-microglobulina (β2-m), uma proteína amiloidogénica associada à amiloidose relacionada com a diálise.

Abordagem experimental simples: fibrilação amiloide induzida por ultrassons

Para induzir a formação de fibrilas, colocou-se uma microplaca de 96 poços no centro do sonicador de placas multipoços UIP400MTP, que assegura uma exposição uniforme aos ultrassons em todos os poços. As condições experimentais foram as seguintes:

1. Cada poço continha 0,2 ml de solução de β2-microglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplementada com 5 μM de ThT.
2. A placa foi submetida a ciclos de ultrassonicação, como 1 minuto de ultrassonicação seguido de 9 minutos de pausa.
3. Após a sonicação, mediu-se a fluorescência da ThT com um leitor de microplacas.

(cf. So et al., 2011)

Comparação com a agitação convencional

Em comparação com os métodos tradicionais de agitação, a ultrassonicação reduziu drasticamente a fase de latência da formação de fibrilas. Em condições convencionais de agitação de microplacas, apenas 1 em cada 10 poços apresentou um aumento da fluorescência da ThT após 20 horas. Em contrapartida, com a ultrassonicação cíclica (15 minutos de sonicação seguidos de 5 minutos de repouso), detetou-se um aumento significativo da fluorescência da ThT imediatamente após o primeiro tratamento de sonicação.

Aceleração rápida da cinética de fibrilação

Os resultados obtidos por So et al. (2011) demonstraram que a formação espontânea de fibrilas de β2-microglobulina a pH 2,5 pode ser acelerada de várias horas para apenas 10–15 minutos com a ultrassonicação.
As imagens de microscopia de força atómica (AFM) confirmaram que as fibrilas geradas por ultrassonicação de 10 minutos a cada 15 minutos eram morfologicamente indistinguíveis das formadas por ultrassonicação de 1 minuto a cada 10 minutos. Isto evidencia a reprodutibilidade e a robustez da fibrilação amiloide induzida por ultrassons.

Imagens de AFM de fibrilas amiloides produzidas por ultrassonicação de 1 min a cada 10 min (i), por sonicação de 10 min a cada 15 min (ii) e pela reação de sementeira sem ultrassonicação (iii). A barra de escala branca representa 1 μm.
Estudo e imagens: ©So et al., 2011

Fibrilação em condições de pH neutro

Mesmo em condições de pH neutro, conseguiu-se a formação de fibrilas após um período de latência de 1,5 horas, demonstrando que a ultrassonicação reduz significativamente a barreira energética à nucleação e ao crescimento. Isto reforça a hipótese de que a fibrilação amiloide é sobretudo uma reação física, em grande medida limitada pela barreira energética da nucleação, que a ultrassonicação reduz eficazmente.

Impacto na investigação de doenças relacionadas com amiloides

A formação fácil e fiável de fibrilas amiloides com o sonicador de microplacas UIP400MTP tem implicações significativas para a investigação da doença de Alzheimer (AD) e de outras doenças relacionadas com amiloides, como a doença de Parkinson, a diabetes tipo II e as amiloidoses sistémicas. Na AD, a agregação de amiloide-β (Aβ) é uma característica patológica fundamental, mas o estudo da sua cinética de fibrilação continua a ser um desafio devido às longas fases de latência e à variabilidade dos métodos convencionais. A formação de fibrilas promovida pela ultrassonicação acelera a nucleação, assegurando uma elevada reprodutibilidade e uma variabilidade reduzida, o que é crucial para o rastreio de potenciais inibidores e para a compreensão dos mecanismos amiloidogénicos. Além disso, a elevada capacidade de processamento do UIP400MTP permite investigações em grande escala sobre o enovelamento incorreto e a agregação de proteínas, facilitando a descoberta de agentes terapêuticos que podem modular a formação de fibrilas e potencialmente atenuar a progressão neurodegenerativa.

Este estudo estabelece a ultrassonicação com o sonicador de placas multipoços UIP400MTP como um método altamente eficiente para acelerar a formação de fibrilas amiloides. As principais vantagens desta abordagem incluem:

• Redução drástica do período de latência da fibrilação.
• Exposição uniforme aos ultrassons em todos os poços, permitindo uma formação reprodutível de fibrilas.
• Capacidade de rastreio de elevado rendimento, tornando esta abordagem adequada para pesquisas da amiloidogenicidade das proteínas à escala de todo o genoma.

Ao integrar a ultrassonicação com a deteção da fluorescência da ThT, este método proporciona uma plataforma rápida, escalável e fiável para estudar a fibrilação amiloide. Dada a sua eficiência e o seu potencial de elevada capacidade de processamento, esta abordagem pode facilitar a síntese simples de fibrilas amiloides para investigação biofísica e farmacêutica, oferecendo uma ferramenta promissora para estudos relacionados com amiloides e para o rastreio de fármacos.