PMCA para a deteção de priões com elevada capacidade de processamento utilizando o sonicador UIP400MTP

O sonicador para placas multipoços UIP400MTP oferece uma solução potente para a preparação de amostras com elevada capacidade de processamento na amplificação cíclica do dobramento incorreto de proteínas (PMCA). Ao proporcionar uma distribuição uniforme de energia por vários poços e manter parâmetros de sonicação precisos, este sistema permite o processamento simultâneo de numerosas amostras com uma reprodutibilidade excecional. Estas capacidades são fundamentais para otimizar a PMCA de modo a detetar priões em baixas concentrações em amostras biológicas difíceis de analisar, como a saliva, nas quais os inibidores do ensaio podem dificultar a interpretação dos resultados.

As doenças priónicas, como a doença debilitante crónica (CWD) nos cervídeos e a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) nos seres humanos, são doenças neurodegenerativas causadas por proteínas priónicas com dobramento incorreto (PrP^Sc). Estas doenças envolvem frequentemente baixos níveis de priões infeciosos em fluidos corporais, como a saliva, o sangue e a urina, o que dificulta o diagnóstico e a investigação. A transmissão horizontal da CWD através de priões libertados em matrizes ambientais tem implicações particularmente significativas para a gestão da fauna selvagem e a saúde ecológica. De igual modo, em doenças como a doença de Creutzfeldt-Jakob, a amplificação fiável de proteínas priónicas com dobramento incorreto a partir de amostras humanas é fundamental para fazer avançar o diagnóstico e compreender a progressão da doença.

A aplicação de um protocolo PMCA modificado permite contornar inibidores comuns do ensaio (por exemplo, mucinas na saliva) e alcançar uma elevada sensibilidade na deteção de priões que, de outro modo, não seriam detetáveis ou cuja deteção seria ambígua utilizando técnicas como a conversão induzida por agitação em tempo real (RT-QuIC). Estes avanços melhoram a deteção de priões em várias doenças, tornando a PMCA uma ferramenta indispensável para a investigação e o diagnóstico de doenças priónicas. O sonicador para placas multipoços UIP400MTP facilita a PMCA com elevada capacidade de processamento, sonicando numerosas amostras em microplacas (por exemplo, placas de 6, 24 ou 96 poços) ou em frascos num suporte para tubos.

Protocolo de amplificação cíclica do dobramento incorreto de proteínas (PMCA) com elevada capacidade de processamento

O protocolo seguinte permite o processamento eficiente de um elevado número de amostras em condições exatamente iguais, para obter resultados de investigação robustos.

Preparação de amostras

Material de partida:
Prepare as amostras através de:

• Ressuspensão dos sedimentos de extração com sarkosyl em substrato de PMCA.
• Adição direta de sementes de priões a homogenatos cerebrais ou amostras de sangue.

Substrato:

• Utilize um homogenato cerebral a 10% (massa/volume) preparado a partir de ratinhos transgénicos que sobre-expressam PrP^C (por exemplo, ratinhos Tg).
• Homogeneíze o tecido cerebral em:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Conserve o substrato a -80ºC até à utilização.

Preparação das amostras em microplaca ou tubos:
Tubos:

• Adicione 90 μL de substrato de homogenato cerebral e inocule com 10 μL de amostra (por exemplo, sangue, homogenato cerebral ou sedimento de sarkosyl).
• Coloque 3 esferas de Teflon (com diâmetro de 1,59 mm ou 2,38 mm) em cada tubo de 0,2 mL.
• Coloque os tubos num suporte compatível com o sonicador UIP400MTP.

Microplaca de 6 poços:

• Adicione 5 mL de substrato de homogenato cerebral e inocule com 500 μL de amostra por poço.
• Adicione 3 esferas de Teflon a cada poço.

Procedimento de PMCA

Colocação:
Coloque o suporte para tubos ou a microplaca de 6 poços no sonicador UIP400MTP de acordo com as instruções do fabricante.

Programa de ciclos:
Realize 144 ciclos de PMCA da seguinte forma:

• Incubação: 29 minutos e 30 segundos a 37°C.
• Sonicação: 30 segundos a 60% de amplitude.
• Monitorize a temperatura: utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura das amostras e programe o UIP400MTP para uma temperatura máxima de 48–50°C.

Rondas subsequentes:
Após concluir a primeira ronda de 144 ciclos, transfira uma alíquota do material amplificado:

• Dilua 10 vezes em substrato fresco de homogenato cerebral de ratinho transgénico.
• Realize 96 ciclos de PMCA nas rondas subsequentes, mantendo os mesmos parâmetros de sonicação.
• Continue durante o número de rondas pretendido (normalmente até 5).

Deteção de PrP^Sc

1. Digestão com proteinase K:
   – Trate as amostras com proteinase K (50 μg/mL) a 37°C durante 1 hora.
   – Termine a digestão adicionando tampão de amostra com SDS e fervendo durante 10 minutos.
2. Análise por Western blot:
   – Analise as amostras digeridas utilizando:
   – Anticorpos anti-PrP 6H4 ou PRC1.
   – Realize SDS-PAGE e transfira para membranas de PVDF para deteção.

 

O Hielscher UIP400MTP é o sonicador mais versátil para as suas placas multipoços, placas de PCR ou tubos de amostras. Com 400 watts de potência de sonicação contínua, foi concebido para aplicações como lise celular, emulsificação, extração de proteínas, fragmentação de DNA / RNA, desaglomeração, extração de FFPE, desprendimento de células e biofilmes ou emulsificação. O UIP400MTP não é um banho ultrassónico. É um sonotrodo de copo de alta intensidade para sonicação focalizada. Este potente sonicador sem contacto proporciona uma sonicação uniforme em todos os poços da sua placa padrão. Permite controlar com precisão a amplitude, a potência e o funcionamento por impulsos. Um temporizador integrado e uma sonda de temperatura asseguram resultados consistentes. O sonicador de placas UIP400MTP arrefece as amostras através de um banho de água, com uma unidade de refrigeração externa opcional.

 

Processe mais amostras para obter resultados mais robustos

O sonicador para placas multipoços UIP400MTP melhora significativamente a eficiência e a escalabilidade da amplificação cíclica do dobramento incorreto de proteínas (PMCA), dando resposta ao caráter tradicionalmente moroso do procedimento. Ao permitir o processamento simultâneo de até 96 amostras numa placa de 96 poços, o sistema simplifica os fluxos de trabalho de PMCA, mantendo condições de sonicação precisas e uniformes em todos os poços. Esta elevada capacidade de processamento minimiza a manipulação manual, reduz as etapas que exigem muito trabalho e assegura a reprodutibilidade, tornando-o uma ferramenta indispensável para a investigação de priões. Quer se investigue a doença debilitante crónica ou a doença de Creutzfeldt-Jakob, o UIP400MTP facilita estudos em grande escala com maior eficiência, permitindo aos investigadores responder às exigências das aplicações modernas de diagnóstico e investigação científica.

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Bibliografia / Referências

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