PMCA para deteção de priões de elevado rendimento utilizando o Sonicador UIP400MTP

O sonicador de placas multipoços UIP400MTP oferece uma solução poderosa para a preparação de amostras de alto rendimento na amplificação cíclica de desdobramento de proteínas (PMCA). Ao fornecer uma distribuição uniforme de energia em vários poços e ao manter parâmetros de sonicação precisos, este sistema permite o processamento simultâneo de várias amostras com uma reprodutibilidade excecional. Estas capacidades são essenciais para otimizar a PMCA para detetar priões a baixas concentrações em amostras biológicas difíceis, como a saliva, onde os inibidores do ensaio podem obscurecer os resultados.

As doenças de priões, como a doença emaciante crónica (CWD) nos cervídeos e a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) nos humanos, são doenças neurodegenerativas causadas por proteínas de priões mal dobradas (PrP^Sc). Estas doenças envolvem frequentemente níveis baixos de priões infecciosos nos fluidos corporais, como a saliva, o sangue e a urina, o que complica o diagnóstico e a investigação. A transmissão horizontal da CWD através de priões libertados em matrizes ambientais tem implicações particularmente significativas para a gestão da vida selvagem e a saúde ecológica. Do mesmo modo, em doenças como a doença de Creutzfeldt-Jakob, a amplificação fiável de proteínas de priões mal dobradas a partir de amostras humanas é crucial para o avanço do diagnóstico e para a compreensão da progressão da doença.

A aplicação de um protocolo PMCA modificado permite contornar os inibidores comuns do ensaio (por exemplo, mucinas na saliva) e alcançar uma elevada sensibilidade na deteção de priões que, de outra forma, seriam indetectáveis ou ambíguos utilizando técnicas como a conversão induzida por tremor em tempo real (RT-QuIC). Estes avanços melhoram a deteção de priões em várias doenças, tornando a PMCA uma ferramenta indispensável para a investigação e diagnóstico de priões. O sonicador de placas de múltiplos poços UIP400MTP facilita a sonicação PMCA de alto rendimento de numerosas amostras em microplacas (por exemplo, placas de 6, 24 ou 96 poços) ou frascos num suporte de tubos.

Protocolo para amplificação cíclica de desdobramento de proteínas (PMCA) de elevado rendimento

O protocolo seguinte permite o processamento eficiente de um elevado número de amostras exatamente nas mesmas condições para obter resultados de investigação sólidos.

Preparação da amostra

Material de base:
Preparar as amostras:

• Ressuspensão dos sedimentos de extração de sarkosil em substrato PMCA.
• A inoculação direta de homogenatos cerebrais ou amostras de sangue com sementes de priões.

Substrato:

• Utilizar um homogenato de cérebro a 10% (wt/vol) preparado a partir de ratinhos transgénicos com sobre-expressão de PrP^C (por exemplo, ratinhos Tg).
• Homogeneizar o tecido cerebral em:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% de Triton X-100.
• Armazenar o substrato a -80ºC até à sua utilização.

Preparação de amostras em microplacas ou tubos:
Tubos:

• Adicionar 90 μL de substrato de homogenato de cérebro e semear com 10 μL de amostra (por exemplo, sangue, homogenato de cérebro ou pellet de sarkosil).
• Colocar 3 esferas de Teflon (1,59 mm ou 2,38 mm de diâmetro) em cada tubo de 0,2 ml.
• Montar os tubos num suporte compatível com o sonicador UIP400MTP.

Microplaca de 6 poços:

• Adicionar 5 ml de substrato de homogenato de cérebro e semear com 500 μL de amostra por poço.
• Adicionar 3 pérolas de Teflon a cada poço.

Procedimento PMCA

Colocação:
Colocar o suporte para tubos ou a microplaca de 6 poços no sonicador UIP400MTP de acordo com as instruções do fabricante.

Programa de ciclismo:
Efetuar 144 ciclos PMCA da seguinte forma:

• Incubação: 29 minutos e 30 segundos a 37°C.
• Sonicação: 30 segundos a 60% de amplitude.
• Monitorizar a temperatura: Utilize o sensor de temperatura conectável para monitorizar a temperatura da amostra e programe o UIP400MTP para uma temperatura máxima de 48-50°C.

Rondas subsequentes:
Após completar a primeira ronda de 144 ciclos, transferir uma alíquota do material amplificado:

• Diluir 10 vezes em substrato fresco de homogenato de cérebro de rato transgénico.
• Efetuar 96 ciclos de PMCA para as rondas subsequentes, mantendo os mesmos parâmetros de sonicação.
• Continue durante o número de rondas desejado (normalmente até 5).

Deteção de PrP^Sc

1. Proteinase K Digestão:
   – Tratar as amostras com Proteinase K (50 μg/mL) a 37°C durante 1 hora.
   – Terminar a digestão adicionando tampão de amostra SDS e fervendo durante 10 minutos.
2. Análise Western Blot:
   – Analisar as amostras digeridas utilizando:
   – 6H4 ou anticorpos anti-PrP PRC1.
   – Efetuar SDS-PAGE e transferir para membranas PVDF para deteção.

 

 

Processar mais amostras para obter resultados mais robustos

O sonicador de placas de múltiplos poços UIP400MTP aumenta significativamente a eficiência e a escalabilidade da amplificação cíclica de desdobramento de proteínas (PMCA), abordando a natureza tradicionalmente demorada do procedimento. Ao permitir o processamento simultâneo de até 96 amostras numa placa de 96 poços, o sistema simplifica os fluxos de trabalho da PMCA, mantendo condições de sonicação precisas e uniformes em todos os poços. Esta capacidade de alto rendimento minimiza o manuseamento manual, reduz os passos de trabalho intensivo e assegura a reprodutibilidade, tornando-o uma ferramenta indispensável para a investigação de priões. Quer se trate de investigar a doença crónica debilitante ou a doença de Creutzfeldt-Jakob, o UIP400MTP facilita estudos em grande escala com maior eficiência, permitindo aos investigadores satisfazer as exigências das aplicações científicas e de diagnóstico modernas.

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Literatura / Referências

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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