Sonikacja w celu usprawnienia rozbijania komórek glonów i ekstrakcji

Glony, zarówno makroglony, jak i mikroglony, zawierają wiele cennych związków wykorzystywanych jako żywność o wartości odżywczej, dodatki do żywności, paliwo lub surowiec do produkcji paliw. Aby uwolnić docelowe substancje z komórki glonu, potrzebna jest skuteczna i wydajna technika rozbijania komórek. Ekstraktory ultradźwiękowe są wysoce wydajne i niezawodne w ekstrakcji związków bioaktywnych z surowców roślinnych, glonów i grzybów. Dostępne w skali laboratoryjnej, stołowej i przemysłowej ekstraktory ultradźwiękowe Hielscher są sprawdzonym rozwiązaniem do produkcji ekstraktów pochodzenia komórkowego w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i produkcji biopaliw.

Glony jako cenny surowiec do celów żywieniowych i produkcji paliw

Komórki glonów są wszechstronnym źródłem związków bioaktywnych i bogatych w energię, takich jak białka, węglowodany, lipidy i inne substancje bioaktywne, a także alkany. Dzięki temu glony stanowią źródło żywności i związków odżywczych, a także paliw.
Mikroglony są cenionym źródłem lipidów, które wykorzystuje się do celów żywieniowych oraz jako surowiec do produkcji biopaliw (np. biodiesla). Szczepy morskiego fitoplanktonu Dicrateria, takie jak Dicrateria rotunda, są znane jako glony wytwarzające benzynę, które mogą syntetyzować szereg węglowodorów nasyconych (n-alkanów) od C₁₀H₂₂ do C₃₈H₇₈, klasyfikowanych jako benzyna (C10–C15), oleje napędowe (C16–C20) i oleje opałowe (C21–C38).
Ze względu na swoją wartość odżywczą glony są wykorzystywane jako „żywność funkcjonalna” lub „nutraceutyki”. Do ważnych mikroskładników odżywczych pozyskiwanych z glonów należą karotenoidy: astaksantyna, fukoksantyna i zeaksantyna, a także fukoidan, laminari i inne glukany, które wraz z licznymi innymi substancjami bioaktywnymi są wykorzystywane jako suplementy diety i środki farmaceutyczne. Karagen, alginian i inne hydrokoloidy są stosowane jako dodatki do żywności. Lipidy glonów są wykorzystywane jako wegańskie źródło kwasów omega-3, a także jako paliwo lub surowiec do produkcji biodiesla.

Rozbijanie komórek glonów i ekstrakcja za pomocą ultradźwięków dużej mocy

Ekstraktory ultradźwiękowe, zwane też po prostu sonikatorami, są wykorzystywane do ekstrakcji cennych związków z małych próbek w laboratorium, a także do produkcji na dużą skalę komercyjną.
Komórki glonów są chronione przez złożone macierze ścian komórkowych, składające się z lipidów, celulozy, białek, glikoprotein i polisacharydów. Podstawę większości ścian komórkowych glonów stanowi sieć mikrofibrylarna w żelopodobnej macierzy białkowej; jednak niektóre mikroglony mają sztywną ścianę nieorganiczną zbudowaną z pancerzyków z krzemionki opalowej lub węglanu wapnia. Aby uzyskać związki bioaktywne z biomasy glonów, niezbędna jest wydajna technika rozbijania komórek. Oprócz technologicznych czynników ekstrakcji (tj. metody ekstrakcji i wyposażenia) na wydajność rozbijania komórek glonów i ekstrakcji silnie wpływają również różne czynniki zależne od glonów, takie jak skład ściany komórkowej, położenie docelowej biomolekuły w komórkach mikroglonów oraz faza wzrostu mikroglonów w momencie zbioru.

Jak działa ultradźwiękowe rozbijanie komórek glonów i ekstrakcja?

Gdy fale ultradźwiękowe o wysokim natężeniu są wprowadzane do cieczy lub zawiesiny za pośrednictwem sondy ultradźwiękowej (zwanej również sonotrodą), fale dźwiękowe rozchodzą się w cieczy, wytwarzając naprzemienne cykle wysokiego i niskiego ciśnienia. Podczas tych cykli wysokiego i niskiego ciśnienia powstają maleńkie pęcherzyki próżniowe lub kawerny. Pęcherzyki kawitacyjne powstają, gdy lokalne ciśnienie podczas cykli niskiego ciśnienia spada dostatecznie poniżej ciśnienia pary nasyconej, którego wartość jest określona przez wytrzymałość cieczy na rozciąganie w danej temperaturze. Pęcherzyki te rosną przez kilka cykli. Gdy osiągają wielkość, przy której nie mogą już pochłaniać więcej energii, gwałtownie implodują podczas cyklu wysokiego ciśnienia. Implozja pęcherzyków kawitacyjnych jest gwałtownym procesem o dużej gęstości energii, który generuje intensywne fale uderzeniowe, turbulencje i mikrostrumienie w płynie. Ponadto lokalnie powstają bardzo wysokie ciśnienia i bardzo wysokie temperatury. Te ekstremalne warunki z łatwością umożliwiają rozbijanie ścian i błon komórkowych oraz skuteczne, wydajne i szybkie uwalnianie związków wewnątrzkomórkowych. Dzięki temu związki wewnątrzkomórkowe, takie jak białka, polisacharydy, lipidy, witaminy, minerały i przeciwutleniacze, można skutecznie ekstrahować za pomocą ultradźwięków dużej mocy.

Kawitacja ultradźwiękowa do rozbijania komórek i ekstrakcji

Pod wpływem intensywnej energii ultradźwiękowej ściana lub błona komórki dowolnego rodzaju (w tym roślinnej, ssaczej, glonowej, grzybowej, bakteryjnej itd.) zostaje rozbita, a komórka jest rozrywana na mniejsze fragmenty przez siły mechaniczne kawitacji ultradźwiękowej o dużej gęstości energii. Po rozbiciu ściany komórkowej metabolity komórkowe, takie jak białka, lipidy, kwasy nukleinowe i chlorofil, są uwalniane z macierzy ściany komórkowej oraz z wnętrza komórki i przenoszone do otaczającego podłoża hodowlanego lub rozpuszczalnika.
Opisany powyżej mechanizm kawitacji ultradźwiękowej / akustycznej silnie rozbija całe komórki glonów lub wakuole gazowe i płynowe wewnątrz komórek. Kawitacja ultradźwiękowa, drgania, turbulencje i mikroprzepływy wspomagają transport masy między wnętrzem komórki a otaczającym rozpuszczalnikiem, dzięki czemu biomolekuły (tj. metabolity) są wydajnie i szybko uwalniane. Wynika to z faktu, że sonikacja jest procesem czysto mechanicznym, który nie wymaga agresywnych, toksycznych i/lub drogich substancji chemicznych.
Ultradźwięki o wysokim natężeniu i niskiej częstotliwości wytwarzają ekstremalne warunki o dużej gęstości energii, charakteryzujące się wysokimi ciśnieniami, temperaturami i dużymi siłami ścinania. Te siły fizyczne wspomagają rozbijanie struktur komórkowych w celu uwolnienia związków wewnątrzkomórkowych do otaczającego ośrodka. Dlatego ultradźwięki o niskiej częstotliwości są szeroko stosowane do ekstrakcji substancji bioaktywnych i paliw z glonów. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami ekstrakcji, takimi jak ekstrakcja rozpuszczalnikowa, mielenie w młynie kulkowym lub homogenizacja wysokociśnieniowa, ekstrakcja ultradźwiękowa wyróżnia się uwalnianiem większości związków bioaktywnych (takich jak lipidy, białka, polisacharydy i mikroskładniki odżywcze) z komórki poddanej sonoporacji i rozbitej. Przy zastosowaniu odpowiednich warunków procesu ekstrakcja ultradźwiękowa zapewnia wyższe uzyski ekstrakcji w bardzo krótkim czasie. Na przykład wysokowydajne ekstraktory ultradźwiękowe wykazują doskonałą wydajność ekstrakcji z glonów przy zastosowaniu odpowiedniego rozpuszczalnika. W środowisku kwaśnym lub zasadowym ściana komórkowa glonu staje się porowata i pomarszczona, co prowadzi do zwiększonych uzysków w niskiej temperaturze (poniżej 60°C) przy krótkim czasie sonikacji (poniżej 3 godzin). Krótki czas ekstrakcji w łagodnych temperaturach zapobiega degradacji fukoidanu, dzięki czemu uzyskuje się polisacharyd o wysokiej aktywności biologicznej.
Sonikacja jest również metodą przekształcania fukoidanu o dużej masie cząsteczkowej w fukoidan o małej masie cząsteczkowej, który jest znacznie bardziej bioaktywny dzięki swojej strukturze pozbawionej rozgałęzień. Ze względu na wysoką aktywność biologiczną i biodostępność fukoidan o małej masie cząsteczkowej jest interesującym związkiem do zastosowania w środkach farmaceutycznych i systemach dostarczania leków.

Studia przypadków: ultradźwiękowa ekstrakcja związków z glonów

Wydajność ekstrakcji ultradźwiękowej i optymalizacja jej parametrów były szeroko badane. Poniżej przedstawiono przykładowe wyniki ekstrakcji za pomocą sonikacji z różnych gatunków glonów.

Ekstrakcja białek ze spiruliny za pomocą manotermosonikacji

Grupa badawcza prof. Chemat (Uniwersytet w Awinionie) badała wpływ manotermosonikacji (MTS) na ekstrakcję białek (takich jak fikocyjanina) z suchych sinic Arthrospira platensis (znanych również jako spirulina). Manotermosonikacja (MTS) polega na zastosowaniu ultradźwięków w połączeniu z podwyższonym ciśnieniem i temperaturą w celu intensyfikacji procesu ekstrakcji ultradźwiękowej.
„Zgodnie z wynikami doświadczeń MTS wspomagała transport masy (wysoki efektywny współczynnik dyfuzji, De) i umożliwiła uzyskanie o 229% więcej białek (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) niż konwencjonalny proces bez ultradźwięków (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). Przy zawartości 28,42 g białek w ekstrakcie na 100 g suchej biomasy spiruliny uzyskano odzysk białka na poziomie 50% w ciągu 6 efektywnych minut ciągłego procesu MTS. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że kawitacja akustyczna oddziaływała na nici spiruliny poprzez różne mechanizmy, takie jak fragmentacja, sonoporacja i niszczenie struktury. Te różnorodne zjawiska ułatwiają ekstrakcję, uwalnianie i solubilizację związków bioaktywnych spiruliny.” [Vernès et al., 2019]

Obrazy z mikroskopii optycznej całych nici spiruliny poddawanych obróbce MTS w kolejnych punktach czasowych. Podziałka (obraz A) = 50 μm dla wszystkich obrazów.
ilustracja i badanie: ©Vernès et al. 2019

Ultradźwiękowa ekstrakcja fukoidanu i glukanów z Laminaria digitata

Grupa badawcza dr. Tiwari z TEAGASC badała ekstrakcję polisacharydów, tj. fukoidanu, laminaryny i glukanów ogółem, z makroglonu Laminaria digitata za pomocą sonikatora UIP500hdT. Badane parametry ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami (UAE) wykazały istotny wpływ na poziomy fukozy, FRAP i DPPH. W zoptymalizowanych warunkach temperatury (76◦C), czasu (10 min) i amplitudy ultradźwięków (100%), przy zastosowaniu 0,1 M HCl jako rozpuszczalnika, uzyskano wartości 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde i 11,02% odpowiednio dla fukozy, glukanów ogółem, FRAP i DPPH. Opisane warunki UAE zastosowano następnie z powodzeniem do innych makroglonów brunatnych o znaczeniu gospodarczym (L. hyperborea i A. nodosum), uzyskując ekstrakty bogate w polisacharydy. Badanie to wykazuje możliwość zastosowania UAE do usprawnienia ekstrakcji bioaktywnych polisacharydów z różnych gatunków makroglonów.

Ultradźwiękowa ekstrakcja związków fitochemicznych z F. vesiculosus i P. canaliculata

Zespół badawczy García-Vaquero porównał różne nowatorskie techniki ekstrakcji, w tym wysokowydajną ekstrakcję ultradźwiękową, ekstrakcję ultradźwiękowo-mikrofalową, ekstrakcję mikrofalową, ekstrakcję wspomaganą hydrotermalnie i ekstrakcję wspomaganą wysokim ciśnieniem, aby ocenić wydajność ekstrakcji z gatunków mikroglonów brunatnych Fucus vesiculosus i Pelvetia canaliculata. Do sonikacji wykorzystano ekstraktor ultradźwiękowy Hielscher UIP500hdT. Analiza uzysków ekstrakcji wykazała, że ekstrakcja ultradźwiękowa zapewniła najwyższe uzyski większości związków fitochemicznych z obu F. vesiculosus. Oznacza to, że najwyższe uzyski związków ekstrahowanych z F. vesiculosus za pomocą ekstraktora ultradźwiękowego UIP500hdT wynosiły: całkowita zawartość związków fenolowych (445,0 ± 4,6 mg równoważników kwasu galusowego/g), całkowita zawartość florotanin (362,9 ± 3,7 mg równoważników floroglucyny/g), całkowita zawartość flawonoidów (286,3 ± 7,8 mg równoważników kwercetyny/g) i całkowita zawartość tanin (189,1 ± 4,4 mg równoważników katechiny/g).
W swoim badaniu zespół stwierdził, że zastosowanie ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami „w połączeniu z 50% roztworem etanolu jako rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym mogłoby stanowić obiecującą strategię ukierunkowaną na ekstrakcję TPC, TPhC, TFC i TTC przy jednoczesnym ograniczeniu współekstrakcji niepożądanych węglowodanów zarówno z F. vesiculosus, jak i P. canaliculata, z obiecującymi zastosowaniami tych związków jako środków farmaceutycznych, nutraceutyków i kosmeceutyków.” [García-Vaquero et al., 2021]

Zwiększanie skali manotermosonikacji na Uniwersytecie w Awinionie z wykorzystaniem sonikatorów Hielscher: od urządzenia laboratoryjnego UIP1000hdT (A) do urządzenia w skali pilotażowej UIP4000hdT (B, C i D). Na ilustracji D przedstawiono schemat przekroju poprzecznego ultradźwiękowej komory przepływowej FC100K.
ilustracja i badanie: ©Vernès et al. 2019

Wysokowydajne ekstraktory ultradźwiękowe do rozbijania komórek glonów

Najnowocześniejsze urządzenia ultradźwiękowe Hielscher umożliwiają pełną kontrolę parametrów procesu, takich jak amplituda, temperatura, ciśnienie i doprowadzana energia.
W ekstrakcji ultradźwiękowej parametry takie jak wielkość cząstek surowca, rodzaj rozpuszczalnika, stosunek ilości substancji stałej do rozpuszczalnika i czas ekstrakcji można zmieniać oraz optymalizować w celu uzyskania najlepszych wyników.
Ponieważ ekstrakcja ultradźwiękowa jest nietermiczną metodą ekstrakcji, unika się degradacji termicznej składników bioaktywnych obecnych w surowcu, takim jak glony.
Ogólnie rzecz biorąc, zalety takie jak wysoki uzysk, krótki czas ekstrakcji, niska temperatura ekstrakcji i niewielkie ilości rozpuszczalnika sprawiają, że sonikacja jest lepszą metodą ekstrakcji.

Ekstrakcja ultradźwiękowa: sprawdzona w laboratorium i przemyśle

Ekstrakcja ultradźwiękowa jest szeroko stosowana do ekstrakcji wszelkiego rodzaju związków bioaktywnych z surowców roślinnych, glonów, bakterii i komórek ssaków. Ekstrakcja ultradźwiękowa jest sprawdzoną, prostą, opłacalną i wysoce wydajną metodą, która przewyższa inne tradycyjne techniki ekstrakcji dzięki wyższym uzyskom ekstrakcji i krótszemu czasowi przetwarzania.
Dzięki łatwej dostępności laboratoryjnych, stołowych i w pełni przemysłowych systemów ultradźwiękowych ekstrakcja ultradźwiękowa jest obecnie dobrze ugruntowaną i godną zaufania technologią. Ekstraktory ultradźwiękowe Hielscher są instalowane na całym świecie w przemysłowych zakładach przetwórczych wytwarzających związki bioaktywne o jakości spożywczej i farmaceutycznej.

Standaryzacja procesu z Hielscher Ultrasonics

Ekstrakty z glonów wykorzystywane w żywności, środkach farmaceutycznych lub kosmetykach muszą być produkowane zgodnie z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP) i według ustandaryzowanych specyfikacji procesu. Cyfrowe systemy ekstrakcyjne Hielscher Ultrasonics są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, które ułatwia precyzyjne ustawianie i kontrolowanie procesu sonikacji. Automatyczna rejestracja danych zapisuje wszystkie parametry procesu ultradźwiękowego, takie jak energia ultradźwiękowa (energia całkowita i netto), amplituda, temperatura i ciśnienie (gdy zamontowane są czujniki temperatury i ciśnienia), wraz ze znacznikiem daty i czasu na wbudowanej karcie SD. Umożliwia to weryfikację każdej partii poddanej obróbce ultradźwiękowej. Jednocześnie zapewniona jest powtarzalność i stale wysoka jakość produktu.

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów: