Ultraskaņas apstrāde līzei: šūnu darbības traucējumi un ekstrakcija

Šūnu sadalīšanās vai līze ir izplatīta ikdienas paraugu sagatavošanas sastāvdaļa biotehnoloģiju laboratorijās. Līzes mērķis ir izjaukt šūnu sienas daļas vai visu šūnu, lai atbrīvotu bioloģiskās molekulas. Ultraskaņas homogenizatori tiek plaši izmantoti veiksmīgai šūnu līzei. Sarežģītu ultrasonikatoru galvenā priekšrocība ir precīza procesa parametru, piemēram, intensitātes un temperatūras, kontrole, kas ļauj veikt maigu, bet ļoti efektīvu šūnu darbības traucējumus un ekstrakciju.

Šūnu līze, izmantojot ultraskaņu

Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir metode, ko izmanto, lai izjauktu atvērtās šūnas un iegūtu saturu, izmantojot augstfrekvences skaņas viļņus, t.i. ultraskaņu. Ultraskaņa ir līzes tehnika, ko plaši izmanto kā vispāratzītu un uzticamu šūnu traucējumu un intracelulārā materiāla ekstrakcijas metodi. Ultraskaņas līze ir uzticama metode, lai sagatavotu lizāta saturošu, piemēram, plazmīdu, receptoru testus, olbaltumvielas, DNS, RNS utt. Tā kā ultraskaņas intensitāti var izlīdzināt, pielāgojot procesa parametrus, optimālo ultraskaņas apstrādes intensitāti no ļoti mīkstas līdz intensīvai var iestatīt individuāli katrai vielai un videi, lai izpildītu īpašas lietošanas prasības. Pēc līzes soļiem ir frakcionēšana, organellu izolācija vai / un olbaltumvielu ekstrakcija un attīrīšana. Ekstrahētais materiāls (= lizāts) ir jāatdala, un to turpina pētīt vai izmantot, piemēram, proteomikas pētījumiem.

Salīdzinot ar citām šūnu līzes un ekstrakcijas metodēm, ultraskaņas šūnu līzei ir vairākas priekšrocības:

1. Ātrums: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra metode, kas dažu sekunžu laikā var izjaukt atvērtās šūnas. Tas ir daudz ātrāk nekā citas metodes, piemēram, homogenizācija, sasaldēšana-atkausēšana vai lodīšu malšana.
2. Efektivitāti: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai vienlaikus apstrādātu mazus, lielus vai vairākus paraugus, padarot to efektīvāku nekā citas metodes, kas prasa mazu paraugu individuālu apstrādi.
3. Bez ķīmiskām vielām: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir neinvazīva metode, kurai nav nepieciešamas skarbas ķimikālijas vai fermenti. Tas padara to ideāli piemērotu lietojumprogrammām, kurās jāsaglabā šūnu satura integritāte. Var izvairīties no nevēlama paraugu piesārņojuma.
4. Augsta raža: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija var iegūt augstu šūnu saturu, ieskaitot DNS, RNS un proteīnus. Tas ir tāpēc, ka augstfrekvences skaņas viļņi atver šūnu sienas un atbrīvo saturu apkārtējā šķīdumā.
5. Temperatūras kontrole: Izsmalcināti ultrasonciatori ļauj precīzi kontrolēt parauga temperatūru. Hielscher digitālā ultraskaņa ir aprīkota ar pievienojamu temperatūras sensoru un temperatūras uzraudzības programmatūru.
6. Atkārtojamam: Ultraskaņas šūnu līzes protokolus var viegli reproducēt un pat saskaņot ar dažādiem lielākiem vai mazākiem paraugu apjomiem ar vienkāršu lineāru mērogošanu.
7. Daudzpusīga: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai iegūtu plašu šūnu tipu klāstu, ieskaitot baktērijas, raugu, sēnītes, augu un zīdītāju šūnas. To var izmantot arī, lai iegūtu dažāda veida molekulas, tostarp olbaltumvielas, DNS, RNS un lipīdus.
8. Vienlaicīga daudzu paraugu sagatavošana: Hielscher Ultrasonics piedāvā vairākus risinājumus, lai ērti apstrādātu daudzus paraugus tieši tādos pašos procesa apstākļos. Tas padara parauga sagatavošanas posmu līzi un ekstrakciju ļoti efektīvu un laika taupīšanu.
9. Viegli lietojams: Ultraskaņas šūnu līzes un ekstrakcijas iekārtas ir viegli lietojamas un prasa minimālu apmācību. Iekārta ir arī ekonomiska, jo tā ir viena investīcija bez prasības atsavināšanas atkārtotai pirkšanai. Tas padara to pievilcīgu plašam pētnieku un laboratoriju lokam.

Kopumā ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra, efektīva, precīzi kontrolējama un daudzpusīga metode šūnu satura ekstrakcijai. Tās priekšrocības salīdzinājumā ar alternatīvām metodēm padara to par pievilcīgu izvēli plašam pētniecības un rūpniecības lietojumu klāstam.

Ultraskaņas šūnu līzes darba princips

Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija izmanto augstfrekvences skaņas viļņus, lai izjauktu šūnas un iegūtu to saturu. Skaņas viļņi rada spiediena izmaiņas apkārtējā šķidrumā, izraisot nelielu burbuļu veidošanos un sabrukumu procesā, kas pazīstams kā kavitācija. Šie burbuļi rada lokalizētus ļoti intensīvus mehāniskos spēkus, kas var salauzt atvērtās šūnas un atbrīvot to saturu apkārtējā šķīdumā.

Šūnu līze, izmantojot ultrasonikatoru, parasti ietver šādas darbības:

• Paraugu ievieto mēģenē vai traukā ar šķidruma buferšķīdumu.
• Paraugā tiek ievietota ultraskaņas zonde, un tiek izmantoti augstfrekvences skaņas viļņi ar aptuveni 20-30 kHz.
• Ultraskaņas viļņi izraisa svārstības un kavitāciju apkārtējā šķidrumā, radot lokalizētus spēkus, kas izjauc atvērtās šūnas un atbrīvo to saturu.
• Paraugu centrifugē vai filtrē, lai atdalītu šūnu atliekas, un ekstrahēto saturu savāc pakārtotai analīzei.

Spēcīgi ultraskaņas viļņi izjauc bioloģisko struktūru šūnu matricu un atbrīvo bioaktīvos savienojumus. Pastiprina masas pārnesi starp augu materiālu un šķīdinātāju (piemēram, buferšķīdumu). (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Parasto līzes metožu trūkumi

Strādājot laboratorijās, jūs, iespējams, jau esat piedzīvojis šūnu līzes problēmu, izmantojot tradicionālos mehāniskos vai ķīmiskos līzes protokolus.

• Mehāniskā līze: Mehāniskās līzes metodēm, piemēram, slīpēšanai ar javu un piestu vai homogenizācijai, izmantojot franču presi, lodīšu dzirnavas vai rotora-statora sistēmu, bieži trūkst precizitātes kontroles un regulēšanas iespēju. Tas nozīmē, ka frēzēšanas un slīpēšanas izmantošana var ātri radīt siltuma un bīdes spēkus, kas var sabojāt paraugu un denaturēt olbaltumvielas. Tie var būt arī laikietilpīgi un prasa lielu daudzumu izejmateriālu.
• Ķīmiskā līze: Ķīmiskās līzes metodes, piemēram, uz mazgāšanas līdzekļiem balstīta līze, var sabojāt paraugu, izjaucot lipīdu divslāni un denaturējot proteīnus. Tiem var būt nepieciešami arī vairāki soļi, un tie var atstāt atlikušos piesārņotājus, kas traucē pakārtotajiem lietojumiem. Papildu izaicinājums ir atrast optimālu mazgāšanas līdzekļa devu.
• Sasalšanas-atkausēšanas cikli: Sasalšanas-atkausēšanas cikli var izraisīt šūnu membrānu plīsumu, bet atkārtoti cikli var izraisīt arī olbaltumvielu denaturāciju un noārdīšanos. Šai metodei var būt nepieciešami arī vairāki cikli, kas var būt laikietilpīgi un bieži vien rada zemāku ražu.
• Fermentatīvā līze: Fermentatīvās līzes metodes var būt specifiskas noteiktiem šūnu tipiem un prasa vairākas darbības, padarot tās laikietilpīgas. Tie arī rada atkritumus un prasa rūpīgu optimizāciju, lai izvairītos no parauga degradācijas. Fermentatīvās līzes komplekti bieži ir dārgi. Ja jūsu pašreizējā fermentatīvās līzes procedūra nedod pietiekamus rezultātus, šūnu darbības traucējumu pastiprināšanai var izmantot ultraskaņu kā sinerģisku metodi.

Atšķirībā no parastajām mehāniskajām un ķīmiskajām šūnu līzes metodēm, ultraskaņas apstrāde ir ļoti efektīvs un uzticams līdzeklis šūnu sadalīšanai, kas ļauj pilnībā kontrolēt ultraskaņas apstrādes parametrus. Tas nodrošina augstu selektivitāti attiecībā uz materiālu izlaišanu un produktu tīrību. [sal. ar Balasundaram et al., 2009]
Tas ir piemērots visiem šūnu tipiem un viegli pielietojams mazos un lielos mērogos – vienmēr kontrolētos apstākļos. Ultrasonikatori ir viegli tīrāmi. Ultraskaņas homogenizatoram vienmēr ir tīra vietā (CIP) un sterilizēšanas vietā (SIP) funkcija. Sonotrods sastāv no masīva titāna raga, kuru var noslaucīt vai izskalot ūdenī vai šķīdinātājā (atkarībā no darba vides). Ultrasonikatoru uzturēšana ir saistīta ar to izturību, kas ir gandrīz nevērīga.

Ultraskaņas līze un šūnu traucējumi

Parasti paraugu līze laboratorijā prasīs no 15 sekundēm līdz 2 minūtēm. Kā ultraskaņas apstrādes intensitāte ir ļoti viegli regulēt ar amplitūdu, nosakot ultraskaņas laiku, kā arī izvēloties pareizo aprīkojumu, ir iespējams sagraut šūnu membrānas ļoti maigi vai ļoti pēkšņi, atkarībā no šūnu struktūras un par mērķi līzes ( piem., DNS ekstrakcijai nepieciešama mīkstāka ultraskaņas apstrāde, pilnīga baktēriju ekstrakcija prasa intensīvāku ultraskaņas apstrādi). Procesa laikā temperatūru var monitorēt ar integrētu temperatūras sensoru, un to var viegli kontrolēt ar dzesēšanas (ledus vanna vai plūsmas elementi ar dzesēšanas jakām) vai ar ultraskaņu impulsa režīmā. Laikā impulsa režīmā ultraskaņu, īss ultraskaņu eksplozijas cikli 1-15 sekundes ilgums ļauj siltuma izkliedi un dzesēšanu ilgākā intermitējošs periodos.
Visi ultraskaņas orientētu procesi ir pilnīgi reproducjami un lineārā mērogojams.

Ultraskaņas homogenizatori šūnu līzei un ekstrakcijai

Dažādi ultraskaņas ierīču veidi ļauj saskaņot parauga sagatavošanas mērķi un nodrošināt lietotājdraudzīgumu un darbības komfortu. Zondes tipa ultrasonikatori ir visizplatītākās ierīces laboratorijā. Tie ir vispiemērotākie mazu un vidēju paraugu sagatavošanai ar tilpumu 0,1 ml līdz 1000 ml. Dažādi jaudas izmēri un sonotrodes ļauj pielāgot ultrasonikatoru parauga tilpumam un traukam, lai iegūtu visefektīvākos un efektīvākos ultraskaņas apstrādes rezultātus. Ultraskaņas zondes ierīce ir labākā izvēle, ja jāsagatavo atsevišķi paraugi.

Ja ir jāsagatavo vairāk paraugu, piemēram, 8-10 šūnu šķīduma flakoni, intensīva netieša ultraskaņas apstrāde ar ultraskaņas sistēmām, piemēram, VialTweeter vai ultraskaņas cuphorn, ir vispiemērotākā homogenizācijas metode efektīvai līzei. Vairāki flakoni tiek apstrādāti ar ultraskaņu vienlaicīgi, tādā pašā intensitātē. Tas ietaupa ne tikai laiku, bet arī nodrošina vienādu attieksmi pret visiem paraugiem, kas padara paraugu rezultātus ticamus un salīdzināmus. Turklāt netiešas ultraskaņas apstrādes laikā tiek novērsta šķērskontaminācija, iegremdējot ultraskaņas sonotrode (pazīstams arī kā ultraskaņas zonde, rags, gals vai pirksts). Tā kā tiek izmantoti atsevišķi parauga izmēram atbilstoši flakoni, tiek izlaista laikietilpīga attīrīšana un parauga zudums trauku dekantēšanas dēļ. Multiwell vai mikrotitru plākšņu vienmērīgai apstrādei ar ultraskaņu Hielscher piedāvā UIP400MTP.
Lielākiem apjomiem, piemēram, šūnu ekstraktu komerciālai ražošanai, vispiemērotākās ir ultraskaņas sistēmas ar plūsmas šūnu reaktoru. Nepārtrauktā un vienmērīga apstrādātā materiāla plūsma nodrošina vienmērīgu ultraskaņu. Visus ultraskaņas sabrukšanas procesa parametrus var optimizēt un pielāgot pieteikuma un konkrētā šūnu materiāla prasībām.
 
 
Paraugu ultraskaņas procedūra bakteriālu šūnu izlīšanai:

• Šūnu suspensijas pagatavošana: šūnu granulas pilnībā jāaptur buferšķīdumā, to homogenizējot (izvēlieties buferšķīdumu, kas ir saderīgs ar šādu analīzi, piemēram, īpašu hromatogrāfijas metodi). Pievienot lysozymes un/vai citas piedevas, ja nepieciešams (tiem jābūt arī saderīgiem ar atdalīšanas/attīrīšanas līdzekļiem). Samaisa/homogenizē šķīdumu maigi ar vieglu ultraskaņas apstrādei, līdz tiek sasniegta pilnīga suspensija.
• Ultraskaņas līze: ievieto paraugu ledus vannā. Šūnu traucējumus, īsu apturēšanu pie 60-90 sekunžu pārrāvumi (izmantojot ultrasonicator impulsu režīmā).
• Atdalīšana: izē lizātu (piem., 10 min. pie 10 000 × g; pie 4degC). Uzmanīgi atdaliet centrifugātu no šūnas Granulāta. Centrifugātu ir kopējais šūnu lizāts. Pēc centrifugāta filtrācijas jūs iegūstat dzidru šķidrumu no šķīstošā šūnu proteīna.

 
 
Visbiežāk lietojumi ultraskaņas aparāti bioloģijā un biotehnoloģijā ir:

• Šūnu ekstrakta sagatavošana
• Rauga, baktēriju, augu šūnu, mīksto vai cieto šūnu audu, nukleīna materiāla traucējumi
• Olbaltumvielu ieguve
• Fermentu sagatavošana un izolācija
• Antigēnu ražošana
• DNS ekstrakcija un/vai mērķtiecīga sadrumstalotība
• liposomu preparāts