Ultraskaņas apstrāde šūnu līzei: šūnu darbības traucējumi un ekstrakcija

Ultraskaņas šūnu līze ir paraugu sagatavošanas procedūra biotehnoloģiju laboratorijās. Mērķis ir izjaukt šūnu sienas vai veselas šūnas, lai atbrīvotu bioloģiskās molekulas. Ultraskaņas apstrādi parasti izmanto šūnu līzei, šūnu darbības traucējumiem un ekstrakcijai. Galvenā ultraskaņas aparātu priekšrocība šūnu līzei ir precīza procesa parametru, piemēram, intensitātes un temperatūras, kontrole, ļaujot maigi, bet efektīvi pārtraukt šūnu darbību un ekstrakciju.

Šūnu līze, izmantojot ultraskaņu

Ultraskaņas šūnu līze izmanto augstas frekvences skaņas viļņus, lai izjauktu atvērtas šūnas un iegūtu to saturu. Ultraskaņas apstrāde ir izveidota un uzticama šūnu darbības traucējumiem un intracelulārā materiāla, piemēram, plazmīdu, receptoru testu, proteīnu, DNS un RNS, ekstrakcijai. Pielāgojot procesa parametrus, ultraskaņas intensitāti var precīzi noregulēt, lai tā atbilstu īpašām pielietojuma prasībām, sākot no maigas līdz intensīvai ultraskaņas apstrādei. Soļi pēc līzes ietver frakcionēšanu, organellu izolēšanu un olbaltumvielu ekstrakciju un attīrīšanu. Iegūtais lizāts ir jāatdala turpmākiem pētījumiem vai lietojumiem, piemēram, proteomikas pētījumiem.

Ja vēlaties uzzināt vairāk par ultraskaņas apstrādi līzei, šūnu darbības traucējumiem un ekstrakcijai, lūdzu, sazinieties ar mums. Mūsu tehniskā komanda ar prieku strādās kopā ar jums pie jūsu šūnu līzes projekta.

Ultraskaņas izmantošanas priekšrocības šūnu līzei

Salīdzinot ar citām šūnu līzes un ekstrakcijas metodēm, ultraskaņas šūnu līzei ir vairākas priekšrocības:

1. Ātrums: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra metode, kas dažu sekunžu laikā var izjaukt atvērtas šūnas. Tas ir daudz ātrāk nekā citas metodes, piemēram, homogenizācija, sasaldēšana-atkausēšana vai lodīšu frēzēšana.
2. Efektivitāte: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai vienlaikus apstrādātu mazus, lielus vai vairākus paraugus, padarot to efektīvāku nekā citas metodes, kas prasa individuālu mazu paraugu apstrādi.
3. Nesatur ķīmiskas vielas: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir neinvazīva metode, kurai nav nepieciešams izmantot skarbas ķīmiskas vielas vai fermentus. Tas padara to ideāli piemērotu lietojumprogrammām, kurās jāsaglabā šūnu satura integritāte. Var izvairīties no nevēlamas paraugu piesārņošanas.
4. Augsta raža: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija var iegūt augstu šūnu satura ražu, ieskaitot DNS, RNS un proteīnus. Tas ir tāpēc, ka augstfrekvences skaņas viļņi atver šūnu sienas un atbrīvo saturu apkārtējā šķīdumā.
5. Temperatūras kontrole: Izsmalcināti ultrasonciatori ļauj precīzi kontrolēt parauga temperatūru. Hielscher digitālie sonikatori ir aprīkoti ar pievienojamu temperatūras sensoru un temperatūras uzraudzības programmatūru.
6. Atkārtojamam: Ultraskaņas šūnu līzes protokolus var viegli reproducēt un pat saskaņot ar dažādiem lielākiem vai mazākiem paraugu apjomiem ar vienkāršu lineāru mērogošanu.
7. Daudzpusīga: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai iegūtu plašu šūnu tipu klāstu, tostarp baktērijas, raugu, sēnītes, augu un zīdītāju šūnas. To var izmantot arī dažādu veidu molekulu ekstrakcijai, ieskaitot olbaltumvielas, DNS, RNS un lipīdus.
8. Vienlaicīga daudzu paraugu sagatavošana: Hielscher Ultrasonics piedāvā vairākus risinājumus, lai ērti apstrādātu daudzus paraugus tieši tādos pašos procesa apstākļos. Tas padara parauga sagatavošanas līzes un ekstrakcijas posmu ļoti efektīvu un ietaupa laiku.
9. Viegli lietojams: Ultraskaņas šūnu līzes un ekstrakcijas iekārtas ir viegli lietojamas un prasa minimālu apmācību. Aprīkojums ir arī ekonomisks, jo tas ir viens ieguldījums bez prasības par atsavināšanas atkārtotu pirkšanu. Tas padara to pievilcīgu plašam pētnieku un laboratoriju lokam.

Kopumā ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra, efektīva, precīzi kontrolējama un daudzpusīga metode šūnu satura ieguvei. Tās priekšrocības salīdzinājumā ar alternatīvām metodēm padara to par pievilcīgu izvēli plašam pētniecības un rūpniecības lietojumu klāstam.

Ultraskaņas šūnu līzes darba princips

Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija izmanto augstas frekvences skaņas viļņus, lai izjauktu šūnas un ekstrahētu to saturu. Skaņas viļņi rada spiediena izmaiņas apkārtējā šķidrumā, izraisot mazu burbuļu veidošanos un sabrukumu procesā, kas pazīstams kā kavitācija. Šie burbuļi rada lokalizētus ļoti intensīvus mehāniskus spēkus, kas var salauzt atvērtas šūnas un atbrīvot to saturu apkārtējā šķīdumā.

Šūnu līze, izmantojot ultrasonikatoru, parasti ietver šādas darbības:

• Paraugu ievieto mēģenē vai traukā ar šķidruma buferšķīdumu.
• Paraugā tiek ievietota ultraskaņas zonde, un tiek izmantoti augstfrekvences skaņas viļņi ar aptuveni 20-30 kHz.
• Ultraskaņas viļņi izraisa svārstības un kavitāciju apkārtējā šķidrumā, radot lokalizētus spēkus, kas izjauc atvērtās šūnas un atbrīvo to saturu.
• Paraugu centrifugē vai filtrē, lai atdalītu šūnu atliekas, un ekstrahēto saturu savāc pakārtotai analīzei.

Spēcīgi ultraskaņas viļņi traucē bioloģisko struktūru šūnu matricu un atbrīvo bioaktīvos savienojumus. Pastiprina masas pārnesi starp augu materiālu un šķīdinātāju (piemēram, buferšķīdumu). (attēls: ©Vilkhu et al., 2006)

Parasto līzes metožu trūkumi

Strādājot laboratorijās, jūs, iespējams, jau esat piedzīvojis šūnu līzes grūtības, izmantojot tradicionālos mehāniskos vai ķīmiskos līzes protokolus.

• Mehāniskā līze: Mehāniskās līzes metodēm, piemēram, slīpēšanai ar javu un piestu vai homogenizācijai, izmantojot franču presi, lodīšu dzirnavas vai rotora statora sistēmu, bieži trūkst precizitātes kontroles un regulēšanas iespēju. Tas nozīmē, ka malšanas un slīpēšanas izmantošana var ātri radīt siltuma un bīdes spēkus, kas var sabojāt paraugu un denaturēt proteīnus. Tie var būt arī laikietilpīgi un prasa lielu daudzumu izejmateriālu.
• Ķīmiskā līze: Ķīmiskās līzes metodes, piemēram, līze uz mazgāšanas līdzekļu bāzes, var sabojāt paraugu, izjaucot lipīdu divslāņu un denaturot proteīnus. Tiem var būt nepieciešami arī vairāki soļi, un tie var atstāt piesārņotāju atlikumus, kas traucē pakārtotajiem lietojumiem. Atrast optimālu mazgāšanas līdzekļa devu ir papildu izaicinājums.
• Sasalšanas un atkausēšanas cikli: Sasalšanas-atkausēšanas cikli var izraisīt šūnu membrānu plīsumu, bet atkārtoti cikli var izraisīt arī olbaltumvielu denaturāciju un noārdīšanos. Šī metode var prasīt arī vairākus ciklus, kas var būt laikietilpīgi un bieži vien rada zemāku ražu.
• Fermentatīvā līze: Fermentatīvās līzes metodes var būt specifiskas noteiktiem šūnu tipiem un prasa vairākas darbības, padarot tās laikietilpīgas. Tie arī rada atkritumus un prasa rūpīgu optimizāciju, lai izvairītos no parauga degradācijas. Fermentatīvie līzes komplekti bieži ir dārgi. Ja jūsu pašreizējā fermentatīvās līzes procedūra dod nepietiekamus rezultātus, ultraskaņas apstrādi kā sinerģisku metodi var izmantot, lai pastiprinātu šūnu darbības traucējumus.

Atšķirībā no parastajām mehāniskajām un ķīmiskajām šūnu līzes metodēm, ultraskaņas apstrāde ir ļoti efektīvs un uzticams līdzeklis šūnu sadalīšanai, kas ļauj pilnībā kontrolēt ultraskaņas apstrādes parametrus. Tas nodrošina augstu selektivitāti attiecībā uz materiālu izlaišanu un produkta tīrību. [sal.: Balasundaram et al., 2009]
Tas ir piemērots visiem šūnu tipiem un viegli piemērojams mazos un lielos mērogos – vienmēr kontrolētos apstākļos. Ultrasonikatori ir viegli tīrāmi. Ultraskaņas homogenizatoram vienmēr ir tīra vieta (CIP) un sterilizēšanas vietā (SIP) funkcija. Sonotrode sastāv no masīva titāna raga, ko var noslaucīt vai izskalot ūdenī vai šķīdinātājā (atkarībā no darba vides). Ultrasonikatoru uzturēšana ir saistīta ar to izturību, gandrīz nolaidību.

Ultraskaņas līze un šūnu darbības traucējumi

Parasti paraugu līze laboratorijā ilgst no 15 sekundēm līdz 2 minūtēm. Tā kā ultraskaņas intensitāti ir ļoti viegli pielāgot ar amplitūdu, nosakot ultraskaņas apstrādes laiku, kā arī izvēloties pareizo aprīkojumu, ir iespējams ļoti maigi vai ļoti pēkšņi izjaukt šūnu membrānas atkarībā no šūnu struktūras un līzes mērķa (piemēram, DNS ekstrakcijai nepieciešama mīkstāka ultraskaņas apstrāde, pilnīgai baktēriju olbaltumvielu ekstrakcijai nepieciešama intensīvāka ultraskaņas apstrāde). Temperatūru procesa laikā var uzraudzīt ar integrētu temperatūras sensoru, un to var viegli kontrolēt, atdzesējot (ledus vanna vai plūsmas šūnas ar dzesēšanas jakām) vai ar ultraskaņu impulsa režīmā. Impulsa režīma ultraskaņas apstrādes laikā īsi ultraskaņas eksplozijas cikli, kuru ilgums ir 1-15 sekundes, ļauj siltuma izkliedei un dzesēšanai ilgākos periodos.
Visi ultraskaņas vadītie procesi ir pilnībā reproducējami un lineāri mērogojami.

Ultraskaņas homogenizatori šūnu līzei un ekstrakcijai

Dažāda veida ultraskaņas ierīces ļauj saskaņot parauga sagatavošanas mērķi un nodrošināt lietotājdraudzīgumu un darbības komfortu. Zondes tipa ultrasonikatori ir visizplatītākās ierīces laboratorijā. Tie ir vispiemērotākie mazu un vidēju paraugu sagatavošanai ar tilpumu 0,1ml līdz 1000mL. Dažādi jaudas izmēri un sonotrodes ļauj pielāgot ultrasonikatoru parauga tilpumam un kuģim, lai iegūtu visefektīvākos un efektīvākos ultraskaņas rezultātus. Ultraskaņas zondes ierīce ir labākā izvēle, kad jāsagatavo atsevišķi paraugi.

Ja ir jāsagatavo vairāk paraugu, piemēram, 8-10 flakoni šūnu šķīduma, intensīva netieša ultraskaņas apstrāde ar ultraskaņas sistēmām, piemēram, VialTweeter vai ultraskaņas cuphorn, ir vispiemērotākā homogenizācijas metode efektīvai līzei. Vairāki flakoni vienlaikus tiek apstrādāti ar ultraskaņu, tādā pašā intensitātē. Tas ietaupa ne tikai laiku, bet arī nodrošina vienādu visu paraugu apstrādi, kas padara rezultātus starp paraugiem ticamus un salīdzināmus. Turklāt netiešas ultraskaņas apstrādes laikā tiek novērsta savstarpēja piesārņošana, iegremdējot ultraskaņas sonotrodu (pazīstams arī kā ultraskaņas zonde, rags, gals vai pirksts). Tā kā tiek izmantoti flakoni individuāli pēc parauga lieluma, tiek izlaista laikietilpīga tīrīšana un parauga zudumi trauku dekantēšanas dēļ. Multiwell vai mikrotitrēšanas plākšņu vienotai apstrādei ar ultraskaņu Hielscher piedāvā UIP400MTP.
Lielākiem apjomiem, piemēram, šūnu ekstraktu komerciālai ražošanai, vispiemērotākās ir nepārtrauktas ultraskaņas sistēmas ar plūsmas šūnu reaktoru. Apstrādātā materiāla nepārtraukta un vienmērīga plūsma nodrošina vienmērīgu ultraskaņu. Visus ultraskaņas sadalīšanās procesa parametrus var optimizēt un pielāgot pielietojuma un konkrētā šūnu materiāla prasībām.
 
 
Baktēriju šūnu ultraskaņas lizēšanas paraugs:

• Šūnu suspensijas sagatavošana: Šūnu granulas pilnībā jāsuspendē buferšķīdumā, homogenizējot (izvēlieties buferšķīdumu, kas ir saderīgs ar šādu analīzi, piemēram, īpašu hromatogrāfijas metodi). Ja nepieciešams, pievienojiet lizocīmus un/ vai citas piedevas (tām jābūt saderīgām arī ar atdalīšanas/ attīrīšanas līdzekļiem). Viegli samaisiet / homogenizējiet šķīdumu ar vieglu ultraskaņu, līdz tiek sasniegta pilnīga suspensija.
• Ultraskaņas līze: Paraugu ievieto ledus vannā. Šūnu darbības traucējumu gadījumā apstrādājiet suspensiju ar 60-90 sekunžu pārrāvumiem (izmantojot sonikatora impulsa režīmu).
• Atdalīšana: lizātu centrifugē (piemēram, 10 minūtes 10 000 x g temperatūrā; 4 °C temperatūrā). Uzmanīgi atdaliet centrifugātu no šūnu granulveida nogulšņu masas. Centrifugāts ir kopējais šūnu lizāts. Pēc centrifugāta filtrēšanas jūs iegūstat dzidrinātu šķīstošās šūnas proteīna šķidrumu.

 
Visizplatītākie ultrasonikatoru lietojumi bioloģijā un biotehnoloģijā ir:

• Šūnu ekstrakta sagatavošana
• Rauga, baktēriju, augu šūnu, mīksto vai cieto šūnu audu, nukleīniskā materiāla traucējumi
• olbaltumvielu ekstrakcija
• Fermentu sagatavošana un izolēšana
• Antigēnu ražošana
• DNS ekstrakcija un/vai mērķtiecīga fragmentācija
• liposomu sagatavošana