Apstrāde ar ultraskaņu šūnu līzei: šūnu sagraušana un ekstrakcija

Šūnu līze ar ultraskaņu ir mūsdienu biotehnoloģiju laboratorijās plaši izmantota paraugu sagatavošanas metode. Tās galvenais mērķis ir sagraut šūnu membrānas vai veselas šūnas, lai atbrīvotu intracelulāros komponentus, piemēram, olbaltumvielas, nukleīnskābes vai organoīdus. Laboratorijas ikdienas darbā tas nozīmē, ka apstrāde ar ultraskaņu ir standarta metode kontrolētai šūnu sagraušanai un efektīvai biomolekulu ekstrakcijai. Sonikatoru galvenā priekšrocība ir to spēja precīzi regulēt būtiskus procesa parametrus, tostarp ultraskaņas intensitāti, pulsāciju un temperatūras kontroli. Šāda kontrole ļauj pētniekiem panākt uzticamu līzi, vienlaikus līdz minimumam samazinot jutīgu biomolekulu termiskus vai mehāniskus bojājumus, tādējādi nodrošinot saudzīgu, taču ļoti efektīvu ekstrakcijas procesu.

Šūnu līze, izmantojot sonikatorus

Šūnu līzē ar ultraskaņu izmanto akustisko kavitāciju, lai sagrautu šūnu membrānas un atbrīvotu intracelulārās molekulas. Hielscher Ultrasonics piedāvā gan klasisko zondes tipa sonikatoru, gan vairāku paraugu sonikatorus sterilai apstrādei: VialTweeter vairākām mēģenēm un flakoniem un 96 iedobju plašu sonikatoru UIP400MTP standarta mikroplatēm.
 

Hielscher Ultrasonics piegādā jaudīgus bezkontakta sonikatorus paraugu sagatavošanai un klīniskajām analīzēm. Daudziedobju plašu sonikators UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn un plūsmas sonikators GDmini2 apstrādā paraugus sterilos apstākļos.

Priekšrocības, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu šūnu līzei

Salīdzinājumā ar citām šūnu līzes un ekstrakcijas metodēm šūnu līzei ar ultraskaņu ir vairākas priekšrocības:

1. Ātrums: Šūnu līze un ekstrakcija ar ultraskaņu ir ātra metode, kas spēj pārraut šūnas dažu sekunžu laikā. Tā ir daudz ātrāka par citām metodēm, piemēram, homogenizēšanu, sasaldēšanu un atkausēšanu vai malšanu lodīšu dzirnavās.
2. Efektivitāte: Šūnu līzi un ekstrakciju ar ultraskaņu var izmantot, lai vienlaikus apstrādātu mazus, lielus vai vairākus paraugus, tādēļ tā ir efektīvāka par citām metodēm, kurām nepieciešama atsevišķa mazu paraugu apstrāde.
3. Bez ķīmiskām vielām: Šūnu līze un ekstrakcija ar ultraskaņu ir neinvazīva metode, kurai nav nepieciešamas agresīvas ķīmiskās vielas vai enzīmi. Tādēļ tā ir ideāli piemērota lietojumiem, kuros jāsaglabā šūnas satura integritāte. Var izvairīties no nevēlamas paraugu piesārņošanas.
4. Augsts iznākums: Šūnu līze un ekstrakcija ar ultraskaņu ļauj iegūt šūnu saturu, tostarp DNS, RNS un olbaltumvielas, ar augstu iznākumu. Tas ir tāpēc, ka augstfrekvences skaņas viļņi pārrauj šūnu sienas un atbrīvo to saturu apkārtējā šķīdumā.
5. Temperatūras kontrole: Mūsdienīgas ultraskaņas apstrādes ierīces ļauj precīzi kontrolēt parauga temperatūru. Hielscher digitālās ultraskaņas apstrādes ierīces ir aprīkotas ar pieslēdzamu temperatūras sensoru un temperatūras uzraudzības programmatūru.
6. Atkārtojamība: Šūnu ultraskaņas līzes protokolus var viegli atkārtot un pat pielāgot dažādiem lielākiem vai mazākiem paraugu tilpumiem, vienkārši lineāri mainot procesa mērogu.
7. Daudzpusība: Šūnu ultraskaņas līzi un ekstrakciju var izmantot ekstrakcijai no plaša šūnu veidu klāsta, tostarp baktērijām, raugiem, sēnēm, augu un zīdītāju šūnām. To var izmantot arī dažādu veidu molekulu, tostarp olbaltumvielu, DNS, RNS un lipīdu, ekstrakcijai.
8. Daudzu paraugu vienlaicīga sagatavošana: Hielscher Ultrasonics piedāvā vairākus risinājumus, kas ļauj ērti apstrādāt daudzus paraugus pilnīgi vienādos procesa apstākļos. Tas padara paraugu sagatavošanas līzes un ekstrakcijas posmu ļoti efektīvu un ļauj ietaupīt laiku.
9. Vienkārša lietošana: Šūnu ultraskaņas līzes un ekstrakcijas iekārtas ir viegli lietojamas, un to lietošanai nepieciešama minimāla apmācība. Iekārtas ir arī ekonomiskas, jo tas ir vienreizējs ieguldījums bez nepieciešamības atkārtoti iegādāties vienreizlietojamos piederumus. Tas padara tās pievilcīgas plašam pētnieku un laboratoriju lokam.

Kopumā šūnu ultraskaņas līze un ekstrakcija ir ātra, efektīva, precīzi kontrolējama un daudzpusīga metode šūnu satura ekstrakcijai. Tās priekšrocības salīdzinājumā ar alternatīvām metodēm padara to par pievilcīgu izvēli plašam pētniecības un rūpniecisko lietojumu klāstam.

Šūnu ultraskaņas līzes darbības princips

Šūnu ultraskaņas līzē un ekstrakcijā izmanto augstfrekvences skaņas viļņus, lai sagrautu šūnas un ekstrahētu to saturu. Skaņas viļņi rada spiediena izmaiņas apkārtējā šķidrumā, izraisot mazu burbulīšu veidošanos un sabrukšanu procesā, ko sauc par kavitāciju. Šie burbulīši lokāli rada ļoti intensīvus mehāniskus spēkus, kas var pārraut šūnas un atbrīvot to saturu apkārtējā šķīdumā.

Šūnu līze, izmantojot ultraskaņas apstrādes ierīci, parasti ietver šādus soļus:

• Paraugu ievieto mēģenē vai traukā ar šķidru buferšķīdumu.
• Paraugā ievieto ultraskaņas zondi un iedarbojas uz to ar augstfrekvences skaņas viļņiem, kuru frekvence ir aptuveni 20–30 kHz.
• Ultraskaņas viļņi izraisa svārstības un kavitāciju apkārtējā šķidrumā, lokāli radot spēkus, kas pārrauj šūnas un atbrīvo to saturu.
• Paraugu centrifugē vai filtrē, lai atdalītu visas šūnu atliekas, un ekstrahēto saturu savāc turpmākai analīzei.

Izplatīto līzes metožu trūkumi

Strādājot laboratorijās, jūs, iespējams, jau esat saskārušies ar grūtībām, ko rada šūnu līze, izmantojot tradicionālos mehāniskās vai ķīmiskās līzes protokolus.

• Mehāniskā līze: Mehāniskās līzes metodēm, piemēram, sasmalcināšanai piestā ar piestalu vai homogenizācijai, izmantojot franču presi, lodīšu dzirnavas vai rotora un statora sistēmu, bieži trūkst precīzas kontroles un regulēšanas iespēju. Tas nozīmē, ka malšana un smalcināšana var ātri radīt siltumu un bīdes spēkus, kas var bojāt paraugu un denaturēt olbaltumvielas. Šīs metodes var arī būt laikietilpīgas un prasīt lielu izejmateriāla daudzumu.
• Ķīmiskā līze: Ķīmiskās līzes metodes, piemēram, līze ar detergentiem, var bojāt paraugu, izjaucot lipīdu dubultslāni un denaturējot olbaltumvielas. Tās var arī prasīt vairākus posmus un atstāt piesārņotāju atliekas, kas traucē turpmākajiem lietojumiem. Optimālās detergenta devas noteikšana ir papildu izaicinājums.
• Sasaldēšanas un atkausēšanas cikli: Sasaldēšanas un atkausēšanas cikli var izraisīt šūnu membrānu plīšanu, taču atkārtoti cikli var izraisīt arī olbaltumvielu denaturāciju un noārdīšanos. Arī šai metodei var būt nepieciešami vairāki cikli, kas var būt laikietilpīgi un bieži samazina iegūtā produkta iznākumu.
• Enzimātiskā līze: Enzimātiskās līzes metodes var būt specifiskas noteiktiem šūnu tipiem, un tām ir nepieciešami vairāki posmi, tādēļ tās ir laikietilpīgas. Tās arī rada atkritumus un prasa rūpīgu optimizāciju, lai novērstu parauga noārdīšanos. Enzimātiskās līzes komplekti bieži ir dārgi. Ja pašreizējā enzimātiskās līzes procedūra nesniedz pietiekamus rezultātus, apstrādi ar ultraskaņu var izmantot kā sinerģisku metodi šūnu sagraušanas intensificēšanai.

Salīdzinājumā ar tradicionālajām mehāniskajām un ķīmiskajām šūnu līzes metodēm apstrāde ar ultraskaņu ir ļoti efektīvs un uzticams līdzeklis šūnu sagraušanai, kas ļauj pilnībā kontrolēt ultraskaņas apstrādes parametrus. Tas nodrošina augstu vielu izdalīšanas selektivitāti un produkta tīrību. [sal. Balasundaram et al., 2009]
Tā ir piemērota visiem šūnu tipiem un viegli izmantojama gan mazā, gan lielā mērogā – vienmēr kontrolētos apstākļos. Ultraskaņas apstrādes ierīces ir viegli tīrāmas. Ultraskaņas homogenizatoram vienmēr ir tīrīšanas uz vietas (CIP) un sterilizācijas uz vietas (SIP) funkcija. Sonotrode ir izgatavota kā masīvs titāna rags, ko var noslaucīt vai izskalot ar ūdeni vai šķīdinātāju (atkarībā no darba vides). Pateicoties ultraskaņas apstrādes ierīču izturībai, nepieciešamība pēc to apkopes ir gandrīz nenozīmīga.

Ultraskaņas līze un šūnu sagraušana

Parasti paraugu līze laboratorijā ilgst no 15 sekundēm līdz 2 minūtēm. Tā kā ultraskaņas apstrādes intensitāti ir ļoti viegli pielāgot, iestatot amplitūdu un apstrādes ilgumu, kā arī izvēloties piemērotu aprīkojumu, šūnu membrānas var sagraut ļoti saudzīgi vai ļoti strauji atkarībā no šūnu struktūras un līzes mērķa (piemēram, DNS ekstrakcijai nepieciešama saudzīgāka apstrāde ar ultraskaņu, savukārt pilnīgai proteīnu ekstrakcijai no baktērijām nepieciešama intensīvāka apstrāde ar ultraskaņu). Temperatūru procesa laikā var uzraudzīt ar integrētu temperatūras sensoru un viegli kontrolēt, izmantojot dzesēšanu (ledus vannu vai plūsmas šūnas ar dzesēšanas apvalkiem) vai apstrādi ar ultraskaņu impulsu režīmā. Apstrādājot ar ultraskaņu impulsu režīmā, īsi ultraskaņas impulsu cikli, kas ilgst 1–15 sekundes, ļauj izkliedēt siltumu un nodrošināt dzesēšanu ilgākajos pārtraukumos starp impulsiem.
Visi ultraskaņas ierosinātie procesi ir pilnībā reproducējami, un to mērogu var mainīt lineāri.

• Šūnu suspensijas sagatavošana: šūnu nogulsnes ir pilnībā jāiesuspendē buferšķīdumā, veicot homogenizāciju (izvēlieties buferšķīdumu, kas ir saderīgs ar turpmāko analīzi, piemēram, konkrēto hromatogrāfijas metodi). Ja nepieciešams, pievienojiet lizocīmus un/vai citas piedevas (arī tām jābūt saderīgām ar atdalīšanas/attīrīšanas līdzekļiem). Saudzīgi sajauciet/homogenizējiet šķīdumu, izmantojot vieglu apstrādi ar ultraskaņu, līdz ir panākta pilnīga suspendēšana.
  Lasiet vairāk par lizocīmu un ultraskaņas apstrādes sinerģiju!
• Ultraskaņas līze: ievietojiet paraugu ledus vannā. Lai sagrautu šūnas, apstrādājiet suspensiju ar ultraskaņu 60–90 sekunžu impulsos (izmantojot ultraskaņas apstrādes ierīces impulsu režīmu).
• Atdalīšana: centrifugējiet lizātu (piemēram, 10 min. pie 10 000 x g; 4degC temperatūrā). Uzmanīgi atdaliet supernatantu no šūnu nogulsnēm. Supernatants ir kopējais šūnu lizāts. Pēc supernatanta filtrēšanas iegūst dzidrinātu šķidrumu, kas satur šķīstošos šūnu proteīnus.

 
Visbiežākie ultraskaņas apstrādes ierīču lietojumi bioloģijā un biotehnoloģijā ir:

• Šūnu ekstraktu sagatavošana
• Rauga, baktēriju, augu šūnu, mīksto vai cieto šūnu audu un nukleīnskābju materiāla sagraušana
• Proteīnu ekstrakcija
• Enzīmu sagatavošana un izolēšana
• Antigēnu ražošana
• DNS ekstrakcija un/vai mērķtiecīga fragmentēšana
• Liposomu sagatavošana