Ultraskaņas apstrāde šūnu līzei: šūnu darbības traucējumi un ekstrakcija
Ultraskaņas šūnu līze ir plaši izmantota paraugu sagatavošanas metode mūsdienu biotehnoloģiju laboratorijās. Tās galvenais mērķis ir izjaukt šūnu membrānas vai veselas šūnas, lai atbrīvotu tādus intracelulāros komponentus kā olbaltumvielas, nukleīnskābes vai organellas. Ikdienas laboratorijas darbā tas nozīmē, ka sonikācija ir standarta metode kontrolētai šūnu izjaukšanai un efektīvai biomolekulu ekstrakcijai. Sonikatoru galvenā priekšrocība ir to spēja precīzi modulēt kritiskos procesa parametrus, tostarp ultraskaņas intensitāti, pulsāciju un temperatūras kontroli. Šāda kontrole ļauj pētniekiem panākt uzticamu līzi, vienlaikus samazinot jutīgu biomolekulu termiskus vai mehāniskus bojājumus, tādējādi panākot saudzīgu, bet ļoti efektīvu ekstrakcijas procesu.
Šūnu līze, izmantojot sonikatorus
Ultraskaņas šūnu līze izmanto akustisko kavitāciju, lai izjauktu šūnu membrānas un atbrīvotu intracelulārās molekulas. Hielscher Ultrasonics piedāvā klasisko zondes tipa sonikatoru, kā arī vairāku paraugu sonikatorus sterilai apstrādei: VialTweeter vairākiem mēģenēm un flakoniem un 96 iedobju plates sonikatoru UIP400MTP standarta mikroplatēm.
Hielscher Ultrasonics piegādā spēcīgus bezkontakta ultraskaņas aparātus paraugu sagatavošanai un klīniskajai analīzei. Vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn un plūsmas sonikatoru GDmini2 apstrādāt paraugus sterilos apstākļos.
Ultraskaņas homogenizatori UP100H (100 vati) un UP400St (400 vati): ultraskaņas apstrāde šūnu līzei un ekstrakcijai.
Ultraskaņas homogenizatori šūnu līzei un ekstrakcijai
| Ultraskaņas ierīces tips | Pieteikumu fokuss | Parauga tilpums | Tipisks lietošanas gadījums | Priekšrocības | Modeļu piemēri |
|---|---|---|---|---|---|
| Zondes tipa sonikatori | Viena parauga sonikācija | 0.1 ml līdz ~ 1000 ml | Šūnu līze, olbaltumvielu ekstrakcija, DNS/RNS fragmentācija | Precīza enerģijas kontrole; dažādi sonotrodi; optimāli maziem un vidēji lieliem paraugiem | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Vairāku aizzīmogotu flakonu paralēla apstrāde | 8-10 flakoni (katrs ~1-20 ml) | Vairāku šūnu suspensiju standartizēta līze | Vienmērīga sonikācija; novērš savstarpēju piesārņojumu; reproducējami rezultāti. | VialTweeter, Cuphorn |
| 96 iedobju plates sonikators | Daudzplašu un mikrotitrējošo plākšņu sonikācija | Mikrodaļiņu formāts | Augstas veiktspējas skrīnings, proteomika, šūnu testi | Vienlaicīga, vienmērīga sonikācija visās iedobēs; ideāli piemērots vairāku paraugu darba plūsmām. | UIP400MTP |
| Plūsmas šūnu reaktori | Nepārtraukta sonikācija lielākiem apjomiem | >1 L, mērogojama | Rūpnieciska mēroga šūnu izjaukšana, ekstraktu ražošana | Nepārtraukta apstrāde; mērogojama; pilnīga procesa kontrole (amplitūda, spiediens, temperatūra). | UIP1000hdT, UIP2000hdT + plūsmas šūna |
| Sterilas / netiešās sonikācijas sistēmas | Paraugu apstrāde bez piesārņojuma | Atkarība no flakona/iecirkņa/mikroplatītes | Jutīgi paraugi, sterila vide, reglamentējošie apstākļi. | Nav saskares ar zondi; novērš pārnešanu; minimāla tīrīšanas intensitāte. | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Ultraskaņas izmantošanas priekšrocības šūnu līzei
Salīdzinot ar citām šūnu līzes un ekstrakcijas metodēm, ultraskaņas šūnu līzei ir vairākas priekšrocības:
- Ātrums: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra metode, kas dažu sekunžu laikā var izjaukt atvērtas šūnas. Tas ir daudz ātrāk nekā citas metodes, piemēram, homogenizācija, sasaldēšana-atkausēšana vai lodīšu frēzēšana.
- Efektivitāte: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai vienlaikus apstrādātu mazus, lielus vai vairākus paraugus, padarot to efektīvāku nekā citas metodes, kas prasa individuālu mazu paraugu apstrādi.
- Nesatur ķīmiskas vielas: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir neinvazīva metode, kurai nav nepieciešams izmantot skarbas ķīmiskas vielas vai fermentus. Tas padara to ideāli piemērotu lietojumprogrammām, kurās jāsaglabā šūnu satura integritāte. Var izvairīties no nevēlamas paraugu piesārņošanas.
- Augsta raža: Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija var iegūt augstu šūnu satura ražu, ieskaitot DNS, RNS un proteīnus. Tas ir tāpēc, ka augstfrekvences skaņas viļņi atver šūnu sienas un atbrīvo saturu apkārtējā šķīdumā.
- Temperatūras kontrole: Izsmalcināti ultrasonciatori ļauj precīzi kontrolēt parauga temperatūru. Hielscher digitālie sonikatori ir aprīkoti ar pievienojamu temperatūras sensoru un temperatūras uzraudzības programmatūru.
- Atkārtojamam: Ultraskaņas šūnu līzes protokolus var viegli reproducēt un pat saskaņot ar dažādiem lielākiem vai mazākiem paraugu apjomiem ar vienkāršu lineāru mērogošanu.
- Daudzpusīga: Ultraskaņas šūnu līzi un ekstrakciju var izmantot, lai iegūtu plašu šūnu tipu klāstu, tostarp baktērijas, raugu, sēnītes, augu un zīdītāju šūnas. To var izmantot arī dažādu veidu molekulu ekstrakcijai, ieskaitot olbaltumvielas, DNS, RNS un lipīdus.
- Vienlaicīga daudzu paraugu sagatavošana: Hielscher Ultrasonics piedāvā vairākus risinājumus, lai ērti apstrādātu daudzus paraugus tieši tādos pašos procesa apstākļos. Tas padara parauga sagatavošanas līzes un ekstrakcijas posmu ļoti efektīvu un ietaupa laiku.
- Viegli lietojams: Ultraskaņas šūnu līzes un ekstrakcijas iekārtas ir viegli lietojamas un prasa minimālu apmācību. Aprīkojums ir arī ekonomisks, jo tas ir viens ieguldījums bez prasības par atsavināšanas atkārtotu pirkšanu. Tas padara to pievilcīgu plašam pētnieku un laboratoriju lokam.
Kopumā ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija ir ātra, efektīva, precīzi kontrolējama un daudzpusīga metode šūnu satura ieguvei. Tās priekšrocības salīdzinājumā ar alternatīvām metodēm padara to par pievilcīgu izvēli plašam pētniecības un rūpniecības lietojumu klāstam.
Ultraskaņas šūnu līzes darba princips
Ultraskaņas šūnu līze un ekstrakcija izmanto augstas frekvences skaņas viļņus, lai izjauktu šūnas un ekstrahētu to saturu. Skaņas viļņi rada spiediena izmaiņas apkārtējā šķidrumā, izraisot mazu burbuļu veidošanos un sabrukumu procesā, kas pazīstams kā kavitācija. Šie burbuļi rada lokalizētus ļoti intensīvus mehāniskus spēkus, kas var salauzt atvērtas šūnas un atbrīvot to saturu apkārtējā šķīdumā.
Šūnu līze, izmantojot ultrasonikatoru, parasti ietver šādas darbības:
- Paraugu ievieto mēģenē vai traukā ar šķidruma buferšķīdumu.
- Paraugā tiek ievietota ultraskaņas zonde, un tiek izmantoti augstfrekvences skaņas viļņi ar aptuveni 20-30 kHz.
- Ultraskaņas viļņi izraisa svārstības un kavitāciju apkārtējā šķidrumā, radot lokalizētus spēkus, kas izjauc atvērtās šūnas un atbrīvo to saturu.
- Paraugu centrifugē vai filtrē, lai atdalītu šūnu atliekas, un ekstrahēto saturu savāc pakārtotai analīzei.
Parasto līzes metožu trūkumi
Strādājot laboratorijās, jūs, iespējams, jau esat piedzīvojis šūnu līzes grūtības, izmantojot tradicionālos mehāniskos vai ķīmiskos līzes protokolus.
- Mehāniskā līze: Mehāniskās līzes metodēm, piemēram, slīpēšanai ar javu un piestu vai homogenizācijai, izmantojot franču presi, lodīšu dzirnavas vai rotora statora sistēmu, bieži trūkst precizitātes kontroles un regulēšanas iespēju. Tas nozīmē, ka malšanas un slīpēšanas izmantošana var ātri radīt siltuma un bīdes spēkus, kas var sabojāt paraugu un denaturēt proteīnus. Tie var būt arī laikietilpīgi un prasa lielu daudzumu izejmateriālu.
- Ķīmiskā līze: Ķīmiskās līzes metodes, piemēram, līze uz mazgāšanas līdzekļu bāzes, var sabojāt paraugu, izjaucot lipīdu divslāņu un denaturot proteīnus. Tiem var būt nepieciešami arī vairāki soļi, un tie var atstāt piesārņotāju atlikumus, kas traucē pakārtotajiem lietojumiem. Atrast optimālu mazgāšanas līdzekļa devu ir papildu izaicinājums.
- Sasalšanas un atkausēšanas cikli: Sasalšanas-atkausēšanas cikli var izraisīt šūnu membrānu plīsumu, bet atkārtoti cikli var izraisīt arī olbaltumvielu denaturāciju un noārdīšanos. Šī metode var prasīt arī vairākus ciklus, kas var būt laikietilpīgi un bieži vien rada zemāku ražu.
- Fermentatīvā līze: Fermentatīvās līzes metodes var būt specifiskas noteiktiem šūnu tipiem un prasa vairākas darbības, padarot tās laikietilpīgas. Tie arī rada atkritumus un prasa rūpīgu optimizāciju, lai izvairītos no parauga degradācijas. Fermentatīvie līzes komplekti bieži ir dārgi. Ja jūsu pašreizējā fermentatīvās līzes procedūra dod nepietiekamus rezultātus, ultraskaņas apstrādi kā sinerģisku metodi var izmantot, lai pastiprinātu šūnu darbības traucējumus.
Atšķirībā no parastajām mehāniskajām un ķīmiskajām šūnu līzes metodēm, ultraskaņas apstrāde ir ļoti efektīvs un uzticams līdzeklis šūnu sadalīšanai, kas ļauj pilnībā kontrolēt ultraskaņas apstrādes parametrus. Tas nodrošina augstu selektivitāti attiecībā uz materiālu izlaišanu un produkta tīrību. [sal.: Balasundaram et al., 2009]
Tas ir piemērots visiem šūnu tipiem un viegli piemērojams mazos un lielos mērogos – vienmēr kontrolētos apstākļos. Ultrasonikatori ir viegli tīrāmi. Ultraskaņas homogenizatoram vienmēr ir tīra vieta (CIP) un sterilizēšanas vietā (SIP) funkcija. Sonotrode sastāv no masīva titāna raga, ko var noslaucīt vai izskalot ūdenī vai šķīdinātājā (atkarībā no darba vides). Ultrasonikatoru uzturēšana ir saistīta ar to izturību, gandrīz nolaidību.
Ultraskaņas līze un šūnu darbības traucējumi
Parasti paraugu līze laboratorijā ilgst no 15 sekundēm līdz 2 minūtēm. Tā kā ultraskaņas intensitāti ir ļoti viegli pielāgot ar amplitūdu, nosakot ultraskaņas apstrādes laiku, kā arī izvēloties pareizo aprīkojumu, ir iespējams ļoti maigi vai ļoti pēkšņi izjaukt šūnu membrānas atkarībā no šūnu struktūras un līzes mērķa (piemēram, DNS ekstrakcijai nepieciešama mīkstāka ultraskaņas apstrāde, pilnīgai baktēriju olbaltumvielu ekstrakcijai nepieciešama intensīvāka ultraskaņas apstrāde). Temperatūru procesa laikā var uzraudzīt ar integrētu temperatūras sensoru, un to var viegli kontrolēt, atdzesējot (ledus vanna vai plūsmas šūnas ar dzesēšanas jakām) vai ar ultraskaņu impulsa režīmā. Impulsa režīma ultraskaņas apstrādes laikā īsi ultraskaņas eksplozijas cikli, kuru ilgums ir 1-15 sekundes, ļauj siltuma izkliedei un dzesēšanai ilgākos periodos.
Visi ultraskaņas vadītie procesi ir pilnībā reproducējami un lineāri mērogojami.
The VialTweeter ir ultraskaņas homogenizators vienlaicīgai, vienmērīgai un ātrai daudzu paraugu sterilai sagatavošanai.
- Šūnu suspensijas sagatavošana: Šūnu granulas pilnībā jāsuspendē buferšķīdumā, homogenizējot (izvēlieties buferšķīdumu, kas ir saderīgs ar šādu analīzi, piemēram, īpašu hromatogrāfijas metodi). Ja nepieciešams, pievienojiet lizocīmus un/ vai citas piedevas (tām jābūt saderīgām arī ar atdalīšanas/ attīrīšanas līdzekļiem). Viegli samaisiet / homogenizējiet šķīdumu ar vieglu ultraskaņu, līdz tiek sasniegta pilnīga suspensija.
Uzziniet vairāk par lizocīmu un sonikācijas sinerģiju! - Ultraskaņas līze: Paraugu ievieto ledus vannā. Šūnu darbības traucējumu gadījumā apstrādājiet suspensiju ar 60-90 sekunžu pārrāvumiem (izmantojot sonikatora impulsa režīmu).
- Atdalīšana: lizātu centrifugē (piemēram, 10 minūtes 10 000 x g temperatūrā; 4 °C temperatūrā). Uzmanīgi atdaliet centrifugātu no šūnu granulveida nogulšņu masas. Centrifugāts ir kopējais šūnu lizāts. Pēc centrifugāta filtrēšanas jūs iegūstat dzidrinātu šķīstošās šūnas proteīna šķidrumu.
Visizplatītākie ultrasonikatoru lietojumi bioloģijā un biotehnoloģijā ir:
- Šūnu ekstrakta sagatavošana
- Rauga, baktēriju, augu šūnu, mīksto vai cieto šūnu audu, nukleīniskā materiāla traucējumi
- olbaltumvielu ekstrakcija
- Fermentu sagatavošana un izolēšana
- Antigēnu ražošana
- DNS ekstrakcija un/vai mērķtiecīga fragmentācija
- liposomu sagatavošana
Šūnu darbības traucējumi ar zondes tipa ultrasonikatoru ir efektīva paraugu sagatavošanas metode.
Ultraskaņas daudzveidīgie pielietojumi atzarojas biotehnoloģijas, bioinženierijas, mikrobioloģijas, molekulārās bioloģijas, bioķīmijas, imunoloģijas, bakterioloģijas, virusoloģijas, proteomikas, ģenētikas, fizioloģijas, šūnu bioloģijas, hematoloģijas un botānikas nozarēs.
Līze: šūnu struktūru laušana
Šūnas aizsargā daļēji caurlaidīga plazmas membrāna, kas sastāv no fosfo-lipīdu divslāņa (arī olbaltumvielu-lipīdu divslāņu; ko veido hidrofobi lipīdi un hidrofilās fosfora molekulas ar iestrādātām olbaltumvielu molekulām) un rada barjeru starp šūnu iekšpusi (citoplazmu) un ekstracelulāro vidi. Augu šūnas un prokariotu šūnas ieskauj šūnu siena. Pateicoties vairāku slāņu biezai celulozes šūnu sienai, augu šūnas ir grūtāk lizēt nekā dzīvnieku šūnas. Šūnu interjeru, piemēram, organellus, kodolu, mitohondriju, stabilizē citoskelets.
Lysing šūnas, tā mērķis ir iegūt un atdalīt organellus, proteīnus, DNS, mRNS vai citas biomolekulas.
Parastās šūnu līzes metodes un to trūkumi
Šūnu lizēšanai ir vairākas metodes, kuras var iedalīt mehāniskās un ķīmiskās metodēs, kas ietver mazgāšanas līdzekļu vai šķīdinātāju izmantošanu, augsta spiediena pielietošanu vai lodīšu dzirnavu vai franču preses izmantošanu. Šo metožu visproblemātiskākais trūkums ir procesa parametru sarežģīta kontrole un pielāgošana un tādējādi ietekme.
Zemāk redzamajā tabulā parādīti galvenie parasto līzes metožu trūkumi:
Tabula: Tradicionālajām šūnu līzes metodēm ir lieli trūkumi
Līzes procedūra
Līze ir jutīgs process. Līzes laikā šūnu membrānas aizsardzība tiek iznīcināta, tomēr jānovērš ekstrahēto proteīnu inaktivācija, denaturācija un noārdīšanās nefizioloģiskā vidē (novirze no pH vērtības). Tāpēc parasti līzi veic buferšķīdumā. Lielākā daļa grūtību rodas no nekontrolētiem šūnu darbības traucējumiem, kas izraisa visa intracelulārā materiāla nemērķtiecīgu izdalīšanos vai/ un mērķa produkta denaturāciju.
Bieži uzdotie jautājumi par ultraskaņu un šūnu līzi
- Vai jūs varat lizēt šūnas ar ultraskaņu? Jā, ultraskaņas apstrāde efektīvi lizē šūnas, izmantojot augstfrekvences ultraskaņas viļņus, kas izraisa kavitāciju- parādību, kad šūnu suspensijā veidojas mazi tvaika burbuļi un sabrūk vardarbīgi. Iegūtie mehāniskie spēki traucē šūnu membrānas un atvieglo intracelulāro komponentu izdalīšanos šķidrumā.
- Kā izmantot sonikatoru šūnu līzei? Sonicator izmantošana šūnu līzei ietver sonikatora zondes iegremdēšanu šūnu suspensijā un tādu parametru pielāgošanu kā amplitūda un impulsa ilgums. Process ir rūpīgi jāuzrauga, lai optimizētu šūnu darbības traucējumus, vienlaikus samazinot olbaltumvielu denaturāciju un fermentu inaktivāciju.
- Kāds ir ultraskaņas apstrādes princips šūnu līzei? Ultraskaņas apstrāde darbojas pēc akustiskās kavitācijas principa. Ultraskaņas enerģija tiek pārraidīta šķidrā vidē, izraisot straujas spiediena svārstības, kas noved pie mikroburbuļu veidošanās un implosijas. Šīs implosijas rada intensīvus bīdes spēkus un lokalizētu augstu temperatūru, izjaucot šūnu struktūras un uzlabojot lizāta viendabīgumu.
- Cik ilgi notiek šūnu līzes ultraskaņas apstrāde? Ultraskaņas apstrādes ilgums šūnu līzei var ievērojami atšķirties atkarībā no tādiem faktoriem kā šūnu tips, šūnu blīvums, ultraskaņas jauda un izmantotais īpašais protokols. Tipiskas procedūras var būt no dažām sekundēm līdz dažām minūtēm, ko bieži veic ciklos, lai pārvaldītu siltuma veidošanos un nodrošinātu vienmērīgu šūnu darbības traucējumus.
- Kāds ir ultraskaņas apstrādes mērķis olbaltumvielu ekstrakcijā? Olbaltumvielu ekstrakcijā ultraskaņas apstrāde kalpo, lai efektīvi plīstu šūnu membrānas un šķīdinātu olbaltumvielas. Šī metode ir īpaši noderīga, lai atbrīvotu olbaltumvielas no šūnu nodalījumiem, padarot to par būtisku, lai sagatavotu lizātus, no kuriem olbaltumvielas ir jāattīra vai jāanalizē.
- Kāpēc ekstrakcijai tiek izmantota ultraskaņas apstrāde? Ultraskaņas apstrāde ir labvēlīga ekstrakcijai, pateicoties tās ātrajai darbībai un spējai pielietot mērķtiecīgu enerģiju, sadalot šūnu struktūras, lai atbrīvotu bioaktīvās molekulas, neizmantojot skarbu ķīmisko apstrādi, tādējādi saglabājot iegūto savienojumu funkcionālo integritāti.
- Vai ultraskaņas apstrāde traucē olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbību? Lai gan ultraskaņas apstrāde var efektīvi izjaukt šūnu membrānas, tā var arī traucēt olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbību. Traucējumu līmenis ir atkarīgs no ultraskaņas apstrādes intensitātes un iedarbības ilguma, kas var izraisīt proteīnu kompleksu denaturāciju vai disociāciju, kas varētu ietekmēt turpmākos analītiskos vai funkcionālos pētījumus.
- Vai E. coli lizēšanai var izmantot ultraskaņu? Hielscher ultraskaņas aparāti ir īpaši efektīvi baktēriju šūnu, piemēram, E. coli, lizēšanai, kurām ir izturīgas šūnu sienas. Šī metode nodrošina fizikālu metodi šūnu sienas un membrānas bīdīšanai, padarot to par vēlamo metodi baktēriju lizātu sagatavošanai molekulārās bioloģijas un bioķīmijas laboratorijās.
- Kādi ir turpmākie procesi pēc sonikācijas posma?
Turpmākie posmi pēc ultraskaņas līzes parasti ietver lizāta frakcionēšanu, mērķtiecīgu organellu izolēšanu un turpmāku olbaltumvielu ekstrakciju vai attīrīšanu.
Pēc tam apstrādāto lizātu atdala un sagatavo analītiskiem vai funkcionāliem lietojumiem, piemēram, augstas izšķirtspējas proteomikas, transkriptomikas vai receptoru saistīšanās pētījumiem.
Literatūra/Atsauces
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.