Peptīdu sintēzes mēroga palielināšana: ultraskaņas metodes partiju un nepārtrauktas plūsmas procesiem
Ar ultraskaņas palīdzību veiktā peptīdu sintēze apvieno jau izstrādāto peptīdu ķīmiju ar augstfrekvences mehānisko enerģiju, lai paātrinātu reakcijas un transporta procesus. Akustiskā kavitācija – Mikroskopisko burbuļu veidošanās un sabrukums – rada intensīvu lokālu sajaukšanos, mikrostrūklas un šķērsspēkus. Peptīdu sintēzē šie efekti uzlabo reaģentu transportu, sveķu mitrināšanu, izšķīdināšanu un agregātu sadalīšanu. Tādējādi zemas frekvences ultraskaņa galvenokārt darbojas kā procesa intensifikācijas līdzeklis: tā neaizstāj savienošanas ķīmiju, bet var padarīt savienošanu, aizsardzības grupu noņemšanu, mazgāšanu, sašķelšanu un apstrādi ievērojami ātrāku un efektīvāku.
Peptīdu ražošanas apjoma palielināšanas izaicinājums
Peptīdu ražošanas mēroga palielināšana no laboratorijas līdz rūpnieciskai ražošanai ir izaicinājums, jo daudzu savienošanas un deprotekcijas ciklu laikā uzkrājas nelielas neefektivitātes, kas samazina iznākumu un palielina grūti noņemamu piemaisījumu daudzumu. Lielāki reaktori rada arī ierobežojumus sajaukšanā, siltuma pārnesē, sveķu uzbriešanā un reaģentu transportēšanā, vienlaikus strauji pieaugot šķīdinātāju patēriņam, attīrīšanas prasībām un ražošanas izmaksām. Tāpēc, lai mēroga palielināšana būtu veiksmīga, ir jānodrošina reakcijas vienveidība un produkta kvalitāte, vienlaikus panākot reproducējamu caurlaidspēju, efektīvu resursu izmantošanu un precīzu visu kritisko procesa parametru kontroli.
Farmaceitiskā partija ar ultraskaņas iekārtu UIP2000hdT peptīdu sintēzes uzlabošanai
Ar ultraskaņas palīdzību veiktas peptīdu sintēzes stratēģijas
Peptīdu sintēze cietfāzē, izmantojot ultraskaņu
Fmoc cietfāzes peptīdu sintēze (SPPS) ir visplašāk pētītā ultraskaņas metode. Ultraskaņas apstrāde veicina deprotekcijas un savienošanas reaģentu iekļūšanu uzbriestajās polimēra lodītēs, vienlaikus samazinot stāvošos robežslāņus ap sveķiem. Tā var arī traucēt agregāciju uz sveķiem, kas ir viens no galvenajiem iemesliem nepilnīgai pārvēršanai hidrofobajos un citos “grūti” sekvences.
Eksperimentālie pētījumi ir pierādījuši, ka, izmantojot ultraskaņu, ir iespējams sintezēt bioloģiski aktīvus peptīdus, kuros ir pat 44 aminoskābju atlikumi, ar mazāku izejvielu patēriņu un īsāku reakcijas laiku, turklāt minētajos apstākļos nav novērots galveno blakusreakciju pieaugums. (sk. Merlino u.c., 2019)
Vēl vienā pētījumā tika ziņots, ka atsevišķu peptīdu sintēzes laiks ir samazinājies četrkārt līdz četrpadsmitkārt; 25-meru peptīds ar lielu hidrofobisko aminoskābju saturu tika sintezēts 347 minūtēs. (sk. Silva u.c., 2021)
Ultraskaņas izmeklēšanu var veikt:
- Sveķu uzbriešana un reaģentu apmaiņa
- Fmoc vai Boc aizsarggrupas noņemšana
- Aminoskābju aktivizēšana un savienošana
- Starpmazgāšana
- Ciklizācija uz sveķiem
- Pabeigtā peptīda atdalīšana no nesēja
Sintēze šķidrā fāzē un ar marķieru palīdzību
Ultraskaņa var arī pastiprināt tradicionālo šķidrā fāzes peptīdu sintēzi, paātrinot izšķīšanu, reaģentu izkliedēšanu un masas pārnesi heterogēnos vai viskozos maisījumos. Tās priekšrocības parasti ir vislielākās, ja process ir ierobežots ar maisīšanu vai transportu; pilnīgi homogēnā reakcijā, ko nosaka vienīgi iekšējā ķīmiskā kinētika, uzlabojums var būt mazāks.
Peptīdu sintēzē ar marķieru palīdzību veidojošais peptīds tiek pievienots šķīstošam vai nogulsnējamam organiskam stiprinājumam. Reakcijas noris šķīdumā, pēc kā marķētais starpprodukts tiek atdalīts, izmantojot nogulsnēšanu vai filtrēšanu. Ultraskaņas apstrāde var paātrināt savienošanos, aizsarggrupu noņemšanu, ciklizāciju un marķiera atdalīšanu, vienlaikus saglabājot slikti šķīstošos starpproduktus disperģētā stāvoklī.
| Tehnika | Kā ultraskaņas iedarbība to veicina | Nozīme un ierobežojumi |
|---|---|---|
| Fmoc cietfāzes peptīdu sintēze | Ultraskaņas apstrāde paātrina piperidīna iekļūšanu un Fmoc produktu izvadīšanu; uzlabo aktivēto aminoskābju transportu uzbriestajā sveķu masā; kavē agregāciju uz sveķiem | Pārliecinošākie pierādījumi un parasti vislielākais ieguvums |
| Boc cietfāzes sintēze | Ultraskaņas apstrāde uzlabo skābes iekļūšanu, reaģentu apmaiņu, savienošanu un skalošanu līdzīgi kā Fmoc ķīmijā | Ar skābēm strādājot un tās sildot, jāievēro piesardzība |
| Sintēze šķīdumā/šķidrā fāzē | Ultraskaņas apstrāde uzlabo aizsargāto aminoskābju šķīšanu, izkliedē nogulsnes un palielina kontaktu divfāzu vai suspensijas reakcijās | Ieguvums ir mazāks, ja reakcija jau ir viendabīga un ķīmiski ātruma ierobežota |
| Sintēze, izmantojot šķīstošu marķieri vai nogulsnēšanu | Ultraskaņas apstrāde nodrošina marķēto starpproduktu disperģēšanu savienošanas procesa laikā un var uzlabot to izšķīšanu pirms filtrēšanas vai nogulsnēšanas | Noderīgs grūti šķīstošiem vai liela apjoma preparātiem; ultraskaņa galvenokārt atvieglo apstrādi un masas pārnesi |
| Plūsmas vai nepārtraukta sintēze | Ultraskaņas apstrāde palīdz uzturēt sveķu un šķidruma kontaktu un novērst vietējas stagnācijas zonas vai agregāciju | Mēroga palielināšana, izmantojot plūsmas kameras konstrukciju, lai nodrošinātu vienmērīgu ultraskaņas iedarbību |
| Fragmentu ligācija un ciklizācija | Ultraskaņas apstrāde var padarīt hidrofobos fragmentus šķīstošus, sadalīt agregātus un uzlabot starpmolekulāro kontaktu | Tas pats par sevi nepaātrina katru dabisko ķīmisko ligāciju vai makrociklizāciju; dominējošs faktors var palikt pārmērīga atšķaidīšana vai starpmolekulārā agregācija |
| Enzīmatiskā peptīdu sintēze | Piemērotā intensitātē ultraskaņas apstrāde var mainīt fermentu dinamiku un uzlabot substrāta pārnesi, it īpaši izmantojot imobilizētus fermentus vai divfāzu vidi | Ļoti atkarīgs no fermentiem; pārmērīga enerģija izraisa proteīna struktūras izjaukšanos vai inaktivāciju |
| Ribosomālā/rekombinantā sintēze | Nav tiešas ietekmes uz tulkojumu | Ultraskaņas apstrāde galvenokārt tiek izmantota šūnu sadrupināšanai pēc ekspresijas |
Ultraskaņas skalēšana: partiju, recirkulācijas un nepārtrauktas plūsmas apstrāde
Hielscher ultraskaņas iekārtas var viegli integrēt jūsu konkrētajā peptīdu sintēzes ražošanas sistēmā.
Mēroga palielināšanai ir nozīmīgas trīs reaktora konfigurācijas:
- Sonicēšana partijās ir vienkārša un elastīga, taču, palielinoties tvertnes tilpumam, kļūst grūtāk nodrošināt optimālu un vienmērīgu sonicēšanu.
- Recirkulācijas apstrādes procesā reaktora saturs tiek atkārtoti sūknēts caur ultraskaņas plūsmas šūnu, nodrošinot vienmērīgāku apstrādi, vienlaikus saglabājot partiju elastīgumu.
- Nepārtrauktas plūsmas procesā reakcijas plūsma tiek vadīta caur vienu vai vairākām kontrolētām ultraskaņas apstrādes zonām. Uzturēšanās laiku, plūsmas ātrumu un enerģijas patēriņu var precīzi noteikt, tādējādi padarot šo arhitektūru par vispiemērotāko liela caurlaidspējas un reproducējamai ražošanai.
Procesos, kuros izmanto sveķus, plūsmas ceļam, sūknim un vārstiem jābūt piemērotiem granulu izmēram, lai novērstu berzi vai aizsērēšanu. Alternatīva ir saglabāt sveķus maisītajā reaktorā un caur ultraskaņas kameru cirkulēt tikai šķidro fāzi.
2x rūpnieciskie ultraskaņas ģeneratori, modeļi UIP4000hdT savienots ar nerūsējošā tērauda plūsmas kameras reaktoru peptīdu ražošanai.
Bieži uzdotie jautājumi par ultraskaņas peptīdu sintēzes mēroga palielināšanu
Kas ir peptīdu sintēze ar ultraskaņas palīdzību?
Ultraskaņas peptīdu sintēzē tiek izmantoti augstas intensitātes skaņas viļņi, lai uzlabotu sajaukšanos, masas pārnesi un reakcijas kinētiku peptīdu veidošanās procesā. Akustiskā kavitācija palīdz reaģentiem iekļūt uzbriestajā sveķu masā, izkliedē agregātus un paātrina savienošanas, aizsardzības noņemšanas, mazgāšanas un sašķelšanas posmus.
Kā ultraskaņa uzlabo peptīdu sintēzi cietfāzē?
Ultraskaņas palīdzībā veiktajā cietfāzes peptīdu sintēzē (US-SPPS) ultraskaņas apstrāde uzlabo kontaktu starp pie sveķiem piesaistīto peptīdu un izšķīdušajiem reaģentiem. Tas var saīsināt reakcijas ciklus, veicināt pilnīgāku savienošanos un samazināt sekvenču iztrūkumus, jo īpaši sintēzējot hidrofobus, agregācijai pakļautus vai citādi grūti sintezējamus peptīdus.
Vai ultraskaņas apstrāde var palielināt peptīdu iznākumu un tīrību?
Ultraskaņas apstrāde var uzlabot konversiju, neattīrīto produktu iznākumu un tīrību, veicinot vienmērīgu reaģentu sadali un samazinot nepilnīgu saistīšanos. Rezultāts ir atkarīgs no peptīda sekvences, sveķiem, šķīdinātāja, saistīšanās ķīmijas un ultraskaņas parametriem, tāpēc katrs process ir jāoptimizē un analītiski jāapstiprina.
Kurus peptīdu sintēzes posmus var apstrādāt ar ultraskaņu?
Ultraskaņa var veicināt sveķu uzbriešanu, Fmoc vai Boc aizsarggrupu noņemšanu, aminoskābju savienošanu, mazgāšanu, fragmentu kondensāciju, ciklizāciju un atdalīšanu no cietā nesēja. Tā var arī uzlabot izšķīšanu un masas pārnesi šķidrā fāzē, kā arī marķieru palīdzībā veiktajā peptīdu sintēzē.
Iepazīstieties ar peptīdu sintēzi ar ultraskaņas palīdzību – cietfāzes peptīdu sintēzei un – TAGGING sintēze šķidrā fāzē!
Vai ultraskaņas peptīdu sintēze ir piemērota sarežģītām sekvencēm?
Jā. Ultraskaņa ir īpaši noderīga hidrofobām un agregācijai pakļautām sekvencēm, jo kavitācija un mikrostraumes palīdz pārtraukt agregāciju uz sveķiem un uzlabo reaģentu piekļuvi reaģējošajām vietām. Grūti veicamām savienošanām joprojām var būt nepieciešami optimizēti reaģenti, atkārtota savienošana vai pielāgoti reakcijas apstākļi.
Vai ultraskaņas peptīdu sintēzi var īstenot lielākā mērogā?
Ultraskaņas peptīdu sintēzi var pārnest no laboratorijas eksperimentiem uz partiju, recirkulācijas vai nepārtrauktas plūsmas ražošanu. Ražošanas mēroga palielināšanu panāk, saglabājot kritiskos parametrus, piemēram, amplitūdu, īpatnējo enerģiju, temperatūru un uzturēšanās laiku, vienlaikus palielinot ultraskaņas jaudu, sonotroda laukumu vai apstrādes moduļu skaitu.
Ko nozīmē lineārā mērogojamība ultraskaņas apstrādē?
Lineārā mērogojamība nozīmē, ka caurplūdes jauda var palielināties aptuveni proporcionāli uzstādītajai ultraskaņas jaudai, ja nepieciešamā enerģija uz tilpuma vienību un citi procesa apstākļi paliek nemainīgi. Piemēram, divkāršojot efektīvo ultraskaņas jaudu, caurplūdes ātrumu var aptuveni divkāršot, ja tiek saglabāta reaktora ģeometrija, temperatūra un produkta kvalitātes mērķi.
Kāpēc Hielscher ultraskaņas iekārtas ir piemērotas peptīdu ražošanas apjoma palielināšanai?
Hielscher ultraskaņas iekārtas aptver laboratorijas, eksperimentālos un rūpnieciskos jaudas diapazonus, izmantojot nemainīgus un kontrolējamus darbības parametrus. To regulējama amplitūda, automātiskā datu reģistrēšana, temperatūras un spiediena uzraudzība, saderība ar plūsmas šūnām un modulārās konfigurācijas nodrošina reproducējamu procesa pārnesi un uzticamu ražošanu.
Vai Hielscher ultraskaņas iekārtas var darboties nepārtrauktas peptīdu ražošanas procesā?
Jā. Hielscher rūpnieciskos ultraskaņas iekārtas var integrēt recirkulācijas kontūrās un nepārtrauktas darbības plūsmas šūnu reaktoros. Šīs konfigurācijas nodrošina kontrolētu uzturēšanās laiku un enerģijas pievadi, vienlaikus samazinot atšķirības starp partijām. Rūpnieciskās sistēmas ir paredzētas nepārtrauktai darbībai 24 stundas diennaktī, 7 dienas nedēļā, striktos ražošanas apstākļos.
Kas peptīdu sintēzei ir piemērotāks — ultraskaņas vannas vai zondes tipa ultraskaņas iekārtas?
Ultraskaņas vannas var būt ērts risinājums sākotnējai pārbaudei un nelielu slēgtu trauku vienlaicīgai apstrādei. Zondes tipa ultraskaņas ģeneratori virza ultraskaņu tieši vidē, nodrošinot augstāku intensitāti, labāku parametru kontroli un lielāku mērogojamību. Tādēļ zondes un plūsmas kameras parasti tiek izmantotas eksperimentālajā un rūpnieciskajā ražošanā.
Kā tiek regulēta temperatūra ultraskaņas peptīdu sintēzes laikā?
Tā kā ultraskaņas apstrāde ievada enerģiju reakcijas maisījumā, ir ļoti svarīga efektīva dzesēšana. Hielscher ultraskaņas iekārtas ir pieejamas ar apvalkotiem tvertņiem, ārējiem siltummaiņiem, temperatūras kontrolētu recirkulāciju un impulsveida ultraskaņas apstrādi, lai efektīvi novērstu pārkaršanu. Pieslēdzamie temperatūras sensori un programmējamas temperatūras robežvērtības nodrošina uzticamu temperatūras uzraudzību un reģistrēšanu visā izstrādes un ražošanas procesā.
Kā izvēlēties Hielscher ultraskaņas iekārtu peptīdu sintēzei?
Izvēle ir atkarīga no partijas apjoma, vēlamā caurplūduma, šķīdinātāja, viskozitātes, cietvielu vai sveķu koncentrācijas, nepieciešamās īpatnējās enerģijas un ražošanas grafika. Laboratorijas testēšana nosaka efektīvo procesa diapazonu, pēc kura var noteikt Hielscher ultraskaņas iekārtas, sonotrodes un plūsmas kameras konfigurāciju atbilstoši paredzētajai caurlaidspējai.
Literatūra / Atsauces
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.