Peptīdu sintēze ar ultraskaņu, izmantojot TAGGING metodi
Peptīdu sintēze ir farmaceitiskās pētniecības un attīstības stūrakmens, tomēr tradicionālās metodes – peptīdu sintēze cietfāzē (SPPS) un klasiskā savienošana šķīduma fāzē – joprojām ir darbietilpīgas, rada lielu reaģentu patēriņu un ir grūti pielāgojamas lielāka mēroga ražošanai. Efektīvāka alternatīva ir radusies, apvienojot divas ortogonālas stratēģijas: TAGGING (temporary anchoring group) tehniku peptīdu montāžai šķīduma fāzē un ultraskaņas (sonokīmisko) apstrādi, lai paātrinātu savienošanas, aizsardzības noņemšanas un pēcapstrādes posmus. Kopā tās ļauj ražot terapeitiskos peptīdus no gramu līdz liela apjoma mērogam. – piemēram, antibiotika/pretvēža lipopeptīds lipobaktīns – ar augstu tīrības pakāpi, samazinātu attīrīšanas slodzi un ievērojami mazāku manuālo darbību skaitu.
Kādas priekšrocības sniedz peptīdu sintēze ar ultraskaņas palīdzību?
- Ekonomika šķīduma fāzē: Reakcijas notiek šķīdumā, patērējot ievērojami mazāk aminoskābju nekā peptīdu sintēzē cietfāzē
- Attīrīšana, izmantojot filtrēšanu: Ar TAG saistītais peptīds izkristalizējas polāros šķīdinātājos, tāpēc starpproduktus izdalīta ar vienkāršu filtrēšanu – nav nepieciešama kolonnu hromatogrāfija vai raksturošana katrā posmā.
- Ievērojams darbaspēka ietaupījums: Atbrīvojoties no starpposma attīrīšanas un spektrālajām pārbaudēm, visā sintēzes procesā tiek ietaupīts ievērojams darba laiks.
- Sonokīmiskais paātrinājums: Ultraskaņas apstrāde saīsina katru izšķirošo posmu – Fmoc aizsarggrupas noņemšana, sānu ķēžu savienošana, ciklizācija un vispārēja aizsarggrupas noņemšana – neietekmējot selektivitāti.
- Augsta ražība, augsta tīrība: Katra fragmentu savienošana un galīgā lipobaktīna sintēze noris ar augstu iznākumu; vispārējā aizsarggrupu noņemšana nodrošina mērķa savienojumu ar iznākumu ~83 %.
- Gatavība liela mēroga darbībai: TAGGING metode ir skaidri raksturota kā tāda, kas ļauj masveidā sintezēt peptīdus ar visaugstāko tīrības pakāpi, tādējādi padarot to par praktisku veidu, kā iegūt terapeitiski nozīmīgus lipopeptīdus gramu un kilogramu daudzumos.
- Pilnīga metožu saderība: Šī metode ir pilnībā saderīga ar tradicionālo SPPS un šķīduma fāzes ķīmiju, tāpēc esošās aizsarggrupu stratēģijas (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) un savienošanas aģenti (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) var tikt izmantoti bez izmaiņām.
Pastāstiet mums par izaicinājumiem jūsu peptīdu sintēzes procesā. Mūsu ultraskaņas eksperti ieteiks jums ideālu ultraskaņas iekārtas konfigurāciju, kas atbilst jūsu peptīdu ražošanas mērķiem!
Rūpnieciskais sonikators UIP2000hdT ar farmaceitiskās ražošanas partiju reaktoru uzlabotai peptīdu sintēzei
Kas ir TAGGING metode?
TAG metodē peptīda fragments tiek kovalenti piestiprināts pie noņemamas, sveķveidīgas stiprinājuma (TAG) grupas, kas paliek šķīdumā. Tas ļauj ar veidojošos ķēdi rīkoties tāpat kā ar cietfāzes peptīdu, taču šķidrā fāzē:
- Pēc katras savienošanas vai aizsardzības noņemšanas ar TAG saistītais peptīds tiek atdalīts cietā veidā, veicot vienkāršu filtrēšanu vai nogulsnēšanu polārā vai pretšķīdinātāja vidē, savukārt šķīstošie piemaisījumi un blakusprodukti tiek izskaloti.
- Tā kā peptīds paliek piestiprināts pie savienotājmolekulas, kolonnu hromatogrāfija un katra starpprodukta pilnīga raksturošana lielā mērā vairs nav nepieciešama, kas ļauj ievērojami ietaupīt laiku un darbaspēku.
- Reakcijas var norisināties šķīduma fāzē, izmantojot daudz mazāku aminoskābju daudzumu nekā SPPS gadījumā, un gala produkts tiek atbrīvots, sašķeļot TAG grupu sintēzes beigās.
Lipobaktīna retro-sintēzē tika izmantoti trīs fragmenti – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH un lipīdu fragments C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – kopā ar fragmentu kondensācijas stratēģiju, lai iegūtu garu peptīdu ar ļoti augstu iznākumu. (sk. Ramya et al., 2025)
Ar TAG palīdzību veikto peptīda lipobaktīna pilnīgo sintēzi paātrina ultraskaņas apstrāde.
(Pētījums: Ramya u.c., 2025)
Kā ultraskaņas apstrāde uzlabo peptīdu sintēzi šķīduma fāzē
Ultraskaņas apstrāde tiek izmantota, lai pastiprinātu un saīsinātu galvenos šķīduma fāzes posmus. Lipobaktīna sintēzē, kā aprakstīts Ramya u.c. (2025) darbā, ultraskaņas apstrāde tiek izmantota, lai:
Tā kā TAG ķīmijas procesā starpprodukti jau tiek iegūti kā filtrējamas cietvielas, ultraskaņas apstrāde un TAGGING ir savstarpēji papildinošas metodes: ultraskaņa paātrina masas pārnesi, sajaukšanu un reakcijas kinētiku, savukārt „enkurs” nodrošina, ka peptīds paliek kā atgūstama cietviela, tādējādi nodrošinot tīru darba plūsmu ar minimālu hromatogrāfijas izmantošanu.
Sonicator UP200St: Reaktors ar ultraskaņas maisīšanu peptīdu sintēzes paātrināšanai.
Augstas tīrības pakāpes peptīdu vienkārša ražošanas apjoma palielināšana, izmantojot ultraskaņas apstrādi
Bieži sastopama problēma, pārnesot peptīdu un peptīdu-zāļu ražošanas procesus no laboratorijas uz ražošanu, ir sonokīmiskā efekta saglabāšana lielākos tilpumos un nepārtrauktas plūsmas apstākļos. Uzņēmums „Hielscher“ risina šo problēmu, piedāvājot nepārtrauktu ultraskaņas procesoru klāstu — sākot no laboratorijas līdz pilnīgam rūpnieciskam mērogam —, nodrošinot validētu, reproducējamu jaudu un dokumentētu procesa kontroli.
Rūpnieciskais ultraskaņas ģenerators UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) ultraskaņas palīdzībā uzlabotai peptīdu sintēzei
Bieži uzdotie jautājumi par ultraskaņas palīdzību TAG peptīdu sintēzē
Kas ir peptīdu sintēze šķidrā fāzē (LPPS)?
Peptīdu sintēze šķidrā fāzē (LPPS) ir metode, ar kuras palīdzību peptīdus veido pakāpeniski šķīdumā, izmantojot klasiskos organiskās ķīmijas rīkus. Tā ir viena no četrām galvenajām peptīdu radīšanas metodēm un ir pazīstama kā rentabla, mērogojama un visvidei draudzīgākā no peptīdu sintēzes pieejām. Tā ir īpaši piemērota īsākiem peptīdiem, lai gan, strādājot ar garākām sekvencēm, var rasties grūtības, jo ir sarežģīti nodrošināt reakciju vienmērību, šķīdību un nevēlamo blakusproduktu noņemšanu.
Kā ultraskaņa uzlabo peptīdu sintēzi šķidrā fāzē?
Ultraskaņa (sonikācija) uzlabo LPPS procesu, paātrinot gan savienošanas, gan aizsarggrupas noņemšanas posmus. Ultraskaņas viļņi uzlabo masas pārnesi un reakcijas kinētiku, kā rezultātā:
- Saīsināts reaģēšanas laiks: savienošanas un aizsardzības atslēgšanas ciklus var ievērojami saīsināt
- Augstāka ražība: pilnīgāka pārveidošana katrā posmā
- Uzlabota neattīrīto produktu tīrība: mazāk nepilnīgu savienošanās blakusproduktu
- Mazāks reaģentu patēriņš: ātrāku un efektīvāku reakciju dēļ ir nepieciešams mazāk savienošanas reaģentu un aminoskābju ekvivalentu
Kas ir TAG-atbalstīta peptīdu sintēze (TAPS)?
Peptīdu sintēze ar marķieru palīdzību (TAPS) ir šķidrās fāzes peptīdu sintēzes īpašs gadījums, kurā peptīdus veido pakāpeniski šķīdumā, izmantojot šķīstošus organiskos marķierus cietā nesēja vietā. Šie marķieri, līdzīgi kā cietie nesēji SPPS procesā, vienkāršo izdalīšanu pēc katra sintēzes posma, ļaujot veikt atdalīšanu ar nogulsnēšanu, filtrēšanu vai ekstrakciju. Marķieriem jābūt šķīstošiem organiskos šķīdinātājos, vienlaikus saglabājot atšķirību no citiem materiāliem.
Kā ultraskaņa uzlabo marķēšanas procesu?
Ja ultraskaņas apstrāde tiek apvienota ar TAG-atbalstītu sintēzi, tās priekšrocības ir šādas:
- Ātrāki savienošanas un aizsardzības atcelšanas cikli – ultraskaņa paātrina reakcijas šķīduma fāzē, samazinot laiku, kas nepieciešams katram posmam
- Uzlabota šķīdība un vielu pārnese – ultraskaņas kavitācija palīdz saglabāt marķētā peptīda viendabīgumu šķīdumā, kas ir ļoti svarīgi, jo šķīdība ir galvenā TAPS priekšrocība salīdzinājumā ar SPPS
- Samazināts reaģentu daudzums – augstāka reakcijas efektivitāte nozīmē, ka ir nepieciešams mazāk aminoskābju un savienošanas reaģentu ekvivalentu
- Pilnīgākas reakcijas – samazināts nepilnīgi savienoto blakusproduktu daudzums, kas nodrošina augstāku neattīrītas vielas tīrību un vienkāršāku turpmāko attīrīšanu
Ievērības cienīgs piemērs ir lipobaktīna pilnīga sintēze, kurā izmantota TAG-palīdzība un ultraskaņas iedarbība, kas pierādīja, ka TAGGING metode ir pilnībā saderīga ar šķīduma fāzes metodēm un ka ultraskaņas iedarbība nodrošina augstu iznākumu katrā posmā. (sk. Ramya et al., 2025)
Kādi peptīdu garumi ir pieejami, izmantojot ultraskaņas atbalstīto TAPS metodi?
Īsie un vidēji gari peptīdi (~5–20 aminoskābju atlikumi) ir ideālais diapazons, kurā TAPS nodrošina augstu tīrības pakāpi un uzticamus rezultātus.
Garākus peptīdus var iegūt, izmantojot fragmentu kondensācijas metodi: mazākus fragmentus (6–10-merus) sintēzē uz marķiera, pēc tam tos savieno kopā, lai izveidotu pilna garuma mērķa peptīdu.
Ļoti garu vai sarežģītu mērķu gadījumā var izmantot hibrīdu SPPS/TAPS pieeju.
Uzziniet, kā ultraskaņas apstrāde uzlaboja peptīdu sintēzi cietā fāzē (SPPS)!
Vai ar ultraskaņas palīdzību veiktā šķidrās fāzes peptīdu sintēze ir pielāgojama rūpnieciskai ražošanai?
Jā, rūpnieciskie ultraskaņas iekārtas – piemēram, Hielscher modeļi UIP2000hdT vai UIP4000hdT – tos var integrēt partiju reaktoros un plūsmas kamerās, nodrošinot peptīdu ražošanu lielā apjomā. Pārbūve, iekļaujot tos esošajos reaktoros, ļauj uzlabot jau izstrādātos peptīdu sintēzes procesus.
Kādas ir galvenās ultraskaņas LPPS priekšrocības salīdzinājumā ar tradicionālo LPPS?
- Ātrums: reakcijas laiki katrā savienošanas un aizsardzības noņemšanas posmā ir ievērojami samazināti.
- Efektivitāte: augstāka iznākuma efektivitāte katrā posmā nodrošina augstāku kopējo iznākumu peptīdiem ar vairākiem atlikumiem.
- Ilgtspēja: mazāks reaģentu ekvivalentu skaits un, iespējams, mazāks šķīdinātāja daudzums, pateicoties ātrākām reakcijām.
- Piekļuve: tam nepieciešama tikai standarta ultraskaņas vannīte, nav vajadzīgi speciāli instrumenti.
- Savietojamība: darbojas ar standarta savienošanas reaģentiem (DIC, HATU, TBTU, Oxyma utt.) un aizsarggrupu stratēģijām (Boc, Fmoc).
Literatūra / Atsauces
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ultraskaņas CupHorn slēgtu cauruļu un flakonu intensīvai ultraskaņas apstrādei, lai veiktu sterilu peptīdu ultraskaņas apstrādi.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.