Peptīdu sintēze cietajā fāzē – efektīvāka, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu
Peptīdu sintēze cietajā fāzē (SPPS) ir plaši izmantota peptīdu sintēzes metode. Apstrāde ar ultraskaņu ir uzticams līdzeklis peptīdu sintēzes intensificēšanai cietajā fāzē, nodrošinot lielāku iznākumu, uzlabotu tīrību, racemizācijas neesamību un ievērojami palielinātu reakcijas ātrumu. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus peptīdu sintēzei, atšķelšanai un šķīdināšanai.
Peptīdu sintēze cietajā fāzē ar ultraskaņu
Apstrādi ar ultraskaņu jau plaši izmanto kā intensificēšanas metodi organiskajā sintēzē, un tā ir labi pazīstama ar tādām priekšrocībām kā krasi saīsināts reakcijas laiks, lielāks iznākums, mazāks blakusproduktu daudzums, tādu reakcijas ceļu ierosināšana, kurus nevarētu īstenot citādi, un/vai labāka selektivitāte. Ievērojamus ieguvumus var panākt arī tad, ja peptīdu sintēzes reakcijās ievada ultraskaņu. Pētījumu rezultāti ir parādījuši, ka ar ultraskaņu veicināta peptīdu sintēze īsā reakcijas laikā nodrošina optimizētu augstas tīrības peptīdu iznākumu bez racemizācijas.
- Augsts peptīdu iznākums
- Ievērojami ātrāka sintēze
- Augstāka peptīdu tīrība
- Bez racemizācijas
- Dažādu peptīdu paralēla sintēze
- Mērogojama līdz jebkuram tilpumam
Ultraskaņas kausveida sonotrode vairāku reakcijas trauku vienmērīgai apstrādei ar ultraskaņu, lai uzlabotu peptīdu sintēzi.
Shēma, kurā attēlota Merifīlda peptīdu sintēze cietajā fāzē. Apstrādi ar ultraskaņu izmanto sintēzes reakcijas veicināšanai un uzlabošanai, kā arī sintezēto peptīdu atšķelšanai no sveķiem.
Shēma: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Pētījums | Pētītais peptīds vai peptīdi | Reakcijas laiks (klasiskā sintēze salīdzinājumā ar US-SPPS) | Neattīrītā produkta tīrība (klasiskā sintēze salīdzinājumā ar US-SPPS) | Racemizācija un blakusreakcijas | Galvenās atziņas |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefalīns, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfīns | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Cys/His gadījumā nav novērotas pat 70°C temperatūrā | ~7–12 reizes ātrāka sintēze; būtiski tīrības uzlabojumi, īpaši sekvencēm ar noslieci uz agregāciju, piemēram, TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mērs), Pep2 (9-mērs), Pep3 (25-mērs) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (tikai ar ultraskaņu) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nav pārbaudītas; novērota neliela Pep2 tīrības samazināšanās | Pep1 sintēzes laiks samazināts 14 reizes; neattīrīto produktu iznākums ievērojami palielinājās. |
| Merlino et al. (2019) | Modeļa pentapeptīdi, peptīdi līdz 44-mēram, “sarežģītas sekvences” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modelis) | 84% → 93% (modelis); ievērojami augstāka nekā termiskās karsēšanas gadījumā (~45°C) | Nav būtiska Cys/His enantiomēru daudzuma pieauguma | Ļoti efektīva sarežģītām sekvencēm un sekvencēm ar noslieci uz agregāciju; ļauj samazināt reaģentu pārākumu, saglabājot augstu tīrību. |
Ar ultraskaņu uzlabota peptīdu sintēze cietajā fāzē
Cietās fāzes peptīdu sintēze (SPPS) ir ķīmiska reakcija, kas ļauj veidot peptīdu ķēdi, secīgi reaģējot aminoskābju atvasinājumiem uz nešķīstoša poraina nesēja. Tomēr tradicionālā cietās fāzes peptīdu sintēze ir salīdzinoši neefektīvs un lēns process. Tāpēc peptīdu sintēzes intensificēšana ar ultraskaņu ir augstu vērtēts līdzeklis efektīvākai un ātrākai peptīdu sintēzei.
Silva et al. (2021) salīdzināja “klasisko” fluorenilmetoksikarbonilgrupas (Fmoc) cietās fāzes peptīdu sintēzi (SPPS) ar ultraskaņas (US) veicinātu SPPS, sintezējot trīs peptīdus, proti, fibroblastu augšanas faktora receptoram 3(FGFR3) specifisko peptīdu Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) un jaunos peptīdus Pep2 (RQMATADEA-NH2) un Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Ar US veicināta SPPS samazināja peptīdu ķēdes veidošanas laiku 14 reizes (Pep1) un 4 reizes (Pep2) salīdzinājumā ar “klasisko” metodi. Interesanti, ka ar ultraskaņu veicināta SPPS ļāva iegūt Pep1 ar augstāku tīrības pakāpi (82%) nekā “klasiskā” SPPS (73%). Ievērojamais laika samazinājums apvienojumā ar sasniegto augsto neattīrīto peptīdu tīrības pakāpi mudināja pētnieku grupu izmantot ar US veicinātu SPPS lielā peptīda Pep3 sintēzei, kura sastāvā ir daudz hidrofobu aminoskābju un homooligomēru sekvenču. Ievērības cienīgi, ka šī 25 aminoskābju atlikumu peptīda sintēze tika paveikta mazāk nekā 6 stundās (347 min), iegūstot mērenu tīrības pakāpi (aptuveni 49%).
Ātrāka peptīdu sintēze, izmantojot cietās fāzes peptīdu sintēzi ar ultraskaņas maisīšanu.
(Pētījums un analīze: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) arī veica visaptverošu pētījumu par ultraskaņas ietekmi uz Fmoc balstītu cietās fāzes peptīdu sintēzi, kas ļāva sintezēt dažādus bioloģiski aktīvus peptīdus (līdz 44 aminoskābju atlikumiem), ievērojami ietaupot materiālus un saīsinot reakcijas laiku. Viņi pierādīja, ka apstrāde ar ultraskaņu nepastiprināja galvenās blakusreakcijas un uzlaboja tādu peptīdu sintēzi, kuriem ir “sarežģītas sekvences”, ierindojot ar ultraskaņu veicinātu cietās fāzes peptīdu sintēzi (US-SPPS) starp pašreizējām ļoti efektīvajām peptīdu sintēzes stratēģijām.
Augstas veiktspējas sistēmu pieejamība peptīdu sintēzei ar ultraskaņu ļauj ievērojami palielināt sintēzes ātrumu un paaugstināt neattīrīto produktu tīrības pakāpi. (Sk. Wołczański et al., 2019)
Racemizācijas izpēte. Raksturīgo 1H KMR spektru salīdzinājums modeļpeptīdiem, kas sintezēti manuāli ar klasisko metodi istabas temperatūrā un ar ultraskaņas metodi paaugstinātā temperatūrā. His un Cys α-protonu un Acm metilēngrupas ķīmiskās nobīdes (kreisajos paneļos), kā arī Val ɣ-metilgrupas protonu ķīmiskās nobīdes (labajos paneļos) liecina, ka apstrāde ar ultraskaņu 70°C temperatūrā neizraisa racemizāciju.
(Pētījums un analīze: Wołczański et al., 2019)
Peptīdu atšķelšana ar ultraskaņu
Pēc cietās fāzes peptīdu sintēzes (SPPS) sintezētie peptīdi jāatšķeļ no polimēru sveķiem. Šo posmu dēvē arī par aizsarggrupu noņemšanu. Salīdzinot parasto kratīšanu un apstrādi ar ultraskaņu peptīdu atšķelšanai no sveķiem, kratīšanas metodei nepieciešama aptuveni 1 stunda, savukārt atšķelšanu ar ultraskaņu var paveikt 15 līdz 20 min laikā. Peptīdu atšķelšanu ar ultraskaņu var izmantot aizsargātu aminoskābju un peptīdu atšķelšanai, kas ar benzilesteru saitēm piesaistīti polistirola sveķiem.
Peptīdu atšķelšana no polistirola sveķiem ar ultraskaņu ātrā procedūrā nodrošina augstu peptīdu iznākumu un augstu tīrības pakāpi bez racemizācijas.
(pētījums un attēls: ©Anuradha un Ravindranath, 1995)
Reaktors ar ultraskaņas maisīšanu uzlabotai un paātrinātai peptīdu sintēzei. Attēlā redzama ultraskaņas apstrādes ierīce UP200St stikla reaktorā ar maisītāju.
Augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīces peptīdu sintēzei
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus tiešai un netiešai apstrādei ar ultraskaņu. Jaudīgi un precīzi vadāmi ultraskaņas procesori ievada reakcijas traukā tieši nepieciešamo ultraskaņas enerģijas daudzumu. Neatkarīgi no tā, vai kā sintēzes traukus izmantojat šļirces, mēģenes, daudziedobju plates vai stikla reaktorus, Hielscher Ultrasonics piedāvā jūsu peptīdu sintēzes pielietojumam vispiemērotāko ultraskaņas ierīci.
- pielāgotu peptīdu sintēzei
- peptīdu ražošanai lielā mērogā
- peptīdu bibliotēku sintēzei
Daudzu peptīdu sintēzi veic šļircēs (piemēram, šļirču reaktoros ar fritēm). Hielscher ultraskaņas šļirču maisītājs apstrādā peptīdu šķīdumu ar ultraskaņu, ievadot ultraskaņas viļņus šķidrumā caur šļirces sieniņu. Ultraskaņas šļirču maisītājs ir viens no populārākajiem ultraskaņas risinājumiem peptīdu sintēzei ar ultraskaņas palīdzību.
Kausveida ultraskaņas sonotrode ir piemērots instruments līdz 5 reaktora trauku apstrādei ar ultraskaņu, savukārt VialTweeter var ievietot līdz desmit reakcijas mēģenēm, kā arī papildus pievienot piecus lielākus traukus, izmantojot piestiprināmu skavas piederumu.
Citu veidu reaktoriem, piemēram, Merrifield vai Kamysz cietfāzes reaktoriem un citiem polipropilēna vai borsilikāta traukiem un reaktoriem, Hielscher piedāvā ierīces netiešai un tiešai apstrādei ar ultraskaņu ar pielāgotu skavas stiprinājumu vai atloku.
Protams, lielākus stikla reaktorus ar maisītājiem, piemēram, sintēzei šķīduma fāzē, var viegli aprīkot ar jebkura izmēra ultraskaņas zondēm (sauktām arī par sonotrodēm vai ultraskaņas ragiem).
- dažādi ultraskaņas ierīču veidi
- tieša un netieša apstrāde ar ultraskaņu
- precīza intensitātes regulēšana
- precīza temperatūras regulēšana
- nepārtraukta vai impulsu ultraskaņa
- viedās funkcijas, programmējamas ierīces
- pieejamas jebkuram tilpumam
- lineāra mērogojamība
UIP400MTP ir ideāla ierīce peptīdu cietfāzes sintēzei daudziedobju jeb mikrotitrēšanas platēs. Ultraskaņas kavitācija tiek netieši un vienmērīgi ierosināta daudzajās paraugu iedobēs, nodrošinot izcilu masas pārnesi un sintēzes reakciju. Noskatieties tālāk redzamo video, lai redzētu, kā darbojas mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP!
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus sajaukšanai, disperģēšanai, emulģēšanai un ekstrakcijai laboratorijas, pilotiekārtu un rūpnieciskā mērogā.
Noderīgi fakti par peptīdu sintēzi ar ultraskaņu
Kas ir peptīdi?
Peptīdi ir savienojumi, kuros vairākas aminoskābes ir savienotas ar amīdsaitēm, ko sauc par peptīdsaitēm. Kad tās ir savienotas sarežģītās struktūrās – kas parasti sastāv no 50 vai vairāk aminoskābēm –, šīs lielās peptīdu struktūras sauc par olbaltumvielām. Peptīdi ir būtiski dzīvības pamatelementi un organismā pilda daudzas funkcijas.
Kā notiek peptīdu sintēze?
Organiskajā ķīmijā, molekulārajā bioloģijā un dzīvības zinātnēs peptīdu sintēze ir peptīdu iegūšanas process. Peptīdus ķīmiski sintezē kondensācijas reakcijā starp vienas aminoskābes karboksilgrupu un citas aminoskābes aminogrupu. Lai izvairītos no nevēlamām blakusreakcijām ar dažādām aminoskābju sānu ķēdēm, parasti izmanto aizsarggrupu stratēģijas.
Ķīmiskā (in-vitro) peptīdu sintēze visbiežāk sākas ar pievienojamās aminoskābes karboksilgrupas (C-gala) piesaistīšanu augošās peptīdu ķēdes N-galam. Pretēji šai sintēzei virzienā no C uz N, garu peptīdu dabiskā olbaltumvielu biosintēze dzīvos organismos notiek pretējā virzienā. Tas nozīmē, ka biosintēzē pievienojamās aminoskābes N-gals tiek piesaistīts olbaltumvielas ķēdes C-galam (virzienā no N uz C).
Lielākā daļa peptīdu sintēzes pētniecības un izstrādes protokolu ir balstīti uz cietfāzes metodēm, savukārt sintēzes metodes šķīduma fāzē izmanto peptīdu rūpnieciskajā ražošanā lielā mērogā.
Kāds ir pašreizējais tehnoloģiju attīstības līmenis peptīdu sintēzē?
SUS-SPPS (ilgtspējīga SPPS ar ultraskaņas palīdzību) ļauj, kā pierādīts, samazināt procesu līdz tikai diviem posmiem katrā ciklā (apvienota savienošana/gala grupu bloķēšana/aizsarggrupu noņemšana + viena mazgāšana), ievērojami samazinot šķīdinātāja patēriņu un laiku. (sal. Mottola et al., 2025)
TAPS ar ultraskaņas palīdzību ir jauna metožu kombinācija ar pierādītiem panākumiem pilnajās sintēzēs (piem., lipobaktīna sintēzē), un līgumizstrādes un līgumražošanas organizācijas (CDMO) pēta tās izmantošanu aktīvo farmaceitisko vielu (API) ražošanā.
Atklājiet priekšrocības, ko sniedz TAGGING peptīdu sintēze ar ultraskaņas palīdzību!
Nepārtraukta apstrāde tiek pētīta kā turpmāks uzlabojums – ir aprakstītas nepārtrauktas viena trauka sintēzes platformas, kurās izmanto sililētus marķierus.
Nozare virzās uz zaļās ķīmijas principiem, un gan ultraskaņa, gan TAPS palīdz samazināt šķīdinātāju izmantošanu un reaģentu daudzumu, kā arī uzlabot ilgtspēju.
Literatūra / Atsauces
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no laboratorijas mēroga līdz rūpnieciskam mērogam.