미토콘드리아 진단을 위한 고처리량 시료 전처리
연구 및 클리닉에서 미토콘드리아 진단은 염기서열분석, PCR 및 생화학적 분석과 같은 다양한 기술을 사용하여 수행됩니다. 이러한 방법은 DNA 돌연변이를 식별하고 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용됩니다. 염기서열분석은 유전적 돌연변이를 검출하는 데 도움이 되며, PCR은 특정 DNA 염기서열을 정량화할 수 있습니다. 생화학적 분석은 미토콘드리아 단백질과 효소의 기능을 평가합니다.
미토콘드리아 질환의 진단은 이러한 질환의 뚜렷한 임상적 다양성과 서로 다르게 유전되는 두 가지 게놈, 즉 미토콘드리아 DNA(mtDNA)와 핵 게놈 간의 복잡한 상호 작용으로 인해 특히 어렵습니다.
초음파 처리를 사용한 DNA 추출 및 단편화
근육 조직에서 DNA를 추출하는 것은 mtDNA의 조직 특이적 변화가 의심될 때 특히 유용합니다. 이러한 변화에는 만성 진행성 외부 안구 마비(CPEO)에서 mtDNA의 결실, 미토콘드리아 근병증에서 mtDNA의 점 돌연변이 또는 알퍼스 증후군에서 mtDNA의 고갈이 포함될 수 있습니다. 근육 조직에서 추출한 DNA는 결실을 위한 Southern blot 및 long-range PCR, 고갈을 위한 real-time PCR, 점 돌연변이에 대한 염기서열 분석과 같은 다양한 유전자 검사에 사용할 수 있습니다.
강렬한 초음파를 사용하는 초음파 처리는 미토콘드리아 진단의 여러 응용 분야에 적용됩니다. 세포를 용해하여 미토콘드리아 및 DNA와 같은 세포 내 내용물을 추출하고, 시퀀싱을 위해 mtDNA 및 nDNA와 같은 DNA를 전단하고, 샘플을 균질화하는 데 사용됩니다.
고처리량 시료 전처리를 위한 UIP400MTP 플레이트 초음파 발생기 Multi-well 및 96-well 플레이트에서 시료를 균일하게 초음파 처리
세포와 조직에서 미토콘드리아를 분리하는 방법
미토콘드리아 분리는 세포를 파괴하여 내용물을 방출하는 것과 미토콘드리아 분획을 분리하고 회수하기 위해 차등 원심분리를 사용하는 두 가지 필수 단계로 구성됩니다.
쥡니다
Hielscher 초음파 발생기는 표준 용해 완충액 및 키트와 호환되므로 미토콘드리아의 분리에 적합합니다. 초음파 처리는 두 가지 주요 목적을 제공합니다.
- 세포 용해: 초음파는 세포막을 파괴하여 세포 내 내용물을 방출합니다.
- 미토콘드리아 파괴: 후속 단계에서 초음파 처리는 미토콘드리아를 절단하여 미토콘드리아 단백질 또는 미토콘드리아 DNA를 방출할 수 있습니다.
- mtDNA 단편화: 초음파 처리는 시퀀싱을 위해 미토콘드리아 DNA를 전단하는 신뢰할 수 있는 기술입니다.
멀티웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP는 미토콘드리아 샘플의 고처리량 샘플 준비를 가능하게 합니다. 차등 원심 분리와 함께 초음파 처리는 미토콘드리아 분리의 효율성을 향상시켜 다양한 다운 스트림 응용 분야에 적합한 온전한 미토콘드리아의 높은 수율을 보장합니다.
Hielscher UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기 모든 표준 플레이트와 함께 작동
멀티웰 플레이트 초음파 발생기는 UIP400MTP 예를 들어 미토콘드리아 진단에서 고처리량 시료 전처리에 많은 이점을 제공합니다.
UIP400MTP 바이오마커 진단에서 고처리량 시료 준비를 위한 Multiwell Plate Sonicator.
초음파 mtDNA 단편화를 위한 예시 지침
준비 및 추출:
- C57BL/6 마우스는 자궁경부 탈구에 의해 죽었다.
- 간을 신속하게 추출하여 얼음처럼 차가운 멸균 PBS에서 세척했습니다.
미토콘드리아 분리:
- 미토콘드리아는 2mL Dounce 조직 분쇄기와 조직용 Mitochondria Isolation Kit를 사용하여 분리하였다.
- 700× g 및 3,000× g에서 초기 원심분리.
- 버퍼 C를 사용하여 두 가지 추가 세척 단계를 수행합니다.
DNA 분리:
- 700×g에서 첫 번째 원심분리에서 얻은 펠릿을 사용하여 핵 DNA(nDNA)를 분리했습니다.
- 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 분리했습니다.
- 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 분리된 미토콘드리아에서 추출하였다.
- 핵 DNA(nDNA)는 쥐의 간 조직에서 추출한 조핵 추출물에서 추출했습니다.
DNA 단편화:
- DNA는 30kHz / 50W 초음파 음파 발생기 UP50H와 0.5mm 마이크로 팁 sonotrode를 사용하여 14 μm에서 2 × 30 초 동안 얼음 위에서 단편화시켰다.
단편화(Fragmentation), 시각화 및 정량화(Fragmentation Visualization and Quantification):
- 초음파 화 후 단편화는 SYBR 안전 DNA 염료가 있는 1% 아가로스 겔에서 시각화되었습니다.
- mtDNA 및 nDNA의 상대적 존재도는 qPCR에 의해 측정되었습니다.
(Mariero et al., 2019 참조)
고처리량 시료 전처리를 위해 멀티웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP 표준 96웰, 멀티웰 및 마이크로타이터 플레이트에서 많은 수의 시료 준비를 용이하게 합니다.
UIP400MTP를 사용한 고처리량 시료 전처리의 장점에 대해 자세히 알아보십시오!
초음파 처리를 사용한 최적의 미토콘드리아 분리를 위한 팁:
- 온도 제어: 0°C에서 4°C의 온도 범위에서 모든 단계를 수행하십시오. 이는 미토콘드리아의 무결성과 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다.
- 효율성과 속도: 신속하게 작업하고 특정 응용 분야에 필요한 범위 내에서만 미토콘드리아를 정제하십시오. 과도한 조작은 미토콘드리아 함량의 심각한 손실로 이어질 수 있습니다.
- 현탁액의 희석: 분리 과정 전반에 걸쳐 낮은 농도의 세포 및 세포 소기관 현탁액을 유지합니다. 이는 포획 및 응집의 위험을 최소화하여 분리된 미토콘드리아의 순도를 개선하는 데 도움이 됩니다.
- 시료 양: 하나의 큰 준비보다는 여러 개의 작은 규모 준비를 선택하십시오. 이 접근 방식은 일반적으로 수율이 더 좋은데, 스케일 업이 회수 가능한 미토콘드리아의 양을 비례적으로 증가시키지 않기 때문입니다. 멀티웰 플레이트 초음파 발생기는 UIP400MTP 미토콘드리아 분리를 위한 세포의 빠르고 안정적인 용해와 미토콘드리아에서 단백질 추출을 용이하게 합니다.
이 지침은 초음파 용해 및 원심분리를 사용한 분리 공정을 보다 효율적으로 만들어 다운스트림 응용 분야에 적합한 고품질 미토콘드리아 제제를 생성합니다.
Hielscher 초음파 발생기 – 독일에서 만든 품질
Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
96-well plate 초음파 발생기는 microtiter 및 multiwell 플레이트의 초음파 처리를위한 UIP400MTP입니다.
문헌 / 참고문헌
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mitochondria and Mitochondrial Diagnostic에 대해 자주 묻는 질문
미토콘드리아란?
미토콘드리아는 대부분의 진핵 생물의 세포에서 발견되는 막 결합 세포 기관입니다. 그들은 세포 호흡 과정을 통해 아데노신 삼인산(ATP) 형태로 에너지를 생산하기 때문에 세포의 발전소로 알려져 있습니다. 또한 미토콘드리아는 자체 DNA를 가지고 있으며 세포 주기 조절 및 세포 사멸을 포함한 다른 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다.
mtDNA와 Genomic DNA의 차이점은 무엇입니까?
미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 몇 가지 주요 면에서 게놈 DNA(gDNA)와 다릅니다. MtDNA는 미토콘드리아에 위치하고 원형이며 모계로 유전되는 반면, gDNA는 세포핵에 위치하고 선형이며 양쪽 부모로부터 유전됩니다. MtDNA는 훨씬 작아서 37개의 유전자만 암호화하는 반면 gDNA에는 약 20,000-25,000개의 유전자가 포함되어 있습니다. MtDNA는 세포당 여러 사본에 존재하고, 돌연변이 비율이 더 높으며, 주로 미토콘드리아 기능에 관여하는 단백질을 암호화합니다. 대조적으로, gDNA는 일반적으로 이배체이고, 돌연변이 비율이 낮으며, 유기체의 발달 및 기능에 필요한 광범위한 유전자 배열을 암호화합니다. 또한 mtDNA 전사 및 번역은 미토콘드리아 내에서 발생하는 반면, gDNA 전사는 핵에서 일어나고 번역은 세포질에서 발생합니다. 이러한 차이는 그들의 뚜렷한 역할과 진화적 기원을 반영합니다.
Cell-Free Extract란 무엇입니까?
cell-free 추출물은 단백질, 핵산 및 기타 세포 구성 요소를 포함하여 용해된 세포의 내용물을 포함하지만 온전한 세포막이 없는 용액입니다. 이 추출물은 생화학 및 분자 생물학 연구에서 체외 세포 과정을 연구하는 데 사용되어 연구자들이 살아있는 세포 외부의 반응 및 메커니즘을 분석할 수 있도록 합니다.
PCR 검사는 미토콘드리아 진단에서 어떤 역할을 합니까?
PCR 검사는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 돌연변이, 결실 또는 복제 수 변이를 감지할 수 있도록 하여 미토콘드리아 진단에 중요한 역할을 합니다. 이를 통해 특정 mtDNA 영역을 증폭하여 미토콘드리아 장애와 관련된 병원성 변이를 식별할 수 있습니다. 정량적 PCR(qPCR) 및 장거리 PCR과 같은 PCR 기반 기술도 mtDNA 무결성, 이형질 수준 및 mtDNA 고갈을 평가하는 데 사용되어 미토콘드리아 기능 및 질병에 대한 필수적인 통찰력을 제공합니다.
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차등 원심분리란 무엇입니까?
차등 원심분리는 세포 분획 및 미토콘드리아 분리에 널리 사용되는 기술입니다. 이 방법은 밀도와 모양에 따라 달라지는 침강 계수를 기준으로 세포 구조를 분리합니다. 이 공정에는 특정 밀도의 완충 염 용액에 있는 샘플에 다양한 수준의 원심력을 적용하는 작업이 포함됩니다. 유사한 침강 계수를 가진 구조는 동시에 수집 튜브의 바닥에 가라앉아 회수를 허용합니다.
미토콘드리아 분리에 차등 원심분리는 어떻게 사용됩니까?
차등 원심분리를 통해 연구자들은 미토콘드리아 분획을 다른 세포 구성 요소와 효과적으로 분리할 수 있습니다. 미토콘드리아의 분리에는 여러 원심분리 단계와 그에 따른 분리물의 회수가 포함됩니다.
초기 원심분리: 큰 세포 파편과 핵을 침전시키기 위해 낮은 원심력을 가합니다.
후속 원심분리: 미토콘드리아가 풍부한 펠릿 분획까지 원심력을 단계적으로 증가시킵니다. 각 원심분리 단계는 침강 계수가 점진적으로 높아지는 구조를 제거합니다.
분획 회수: 각 원심분리 후, 펠릿이 수집되고 상층액은 다음 분획을 분리하기 위해 더 높은 중력가속도를 받습니다. 이것은 미토콘드리아의 원하는 순도가 달성될 때까지 반복됩니다.