미토콘드리아 진단을 위한 고처리량 시료 전처리
연구 및 임상에서 미토콘드리아 진단은 염기서열 분석, PCR, 생화학적 분석 등 다양한 기법을 사용하여 수행됩니다. 이러한 방법은 DNA 돌연변이를 식별하고 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용됩니다. 염기서열 분석은 유전적 돌연변이를 검출하는 데 도움이 되며, PCR은 특정 DNA 서열을 정량화할 수 있습니다. 생화학적 분석은 미토콘드리아 단백질과 효소의 기능성을 평가합니다.
미토콘드리아 질환은 임상적 변이가 뚜렷하고, 서로 다른 방식으로 유전되는 두 유전체인 미토콘드리아 DNA(mtDNA)와 핵 유전체 사이의 상호작용이 복잡하여 진단이 특히 어렵습니다.
초음파 처리를 이용한 DNA 추출 및 단편화
근육 조직에서 DNA를 추출하는 것은 mtDNA의 조직 특이적 변화가 의심될 때 특히 유용합니다. 이러한 변화에는 만성 진행성 외안근마비(CPEO)에서 나타나는 mtDNA 결실, 미토콘드리아 근병증에서 나타나는 mtDNA 점 돌연변이, 알퍼스 증후군에서 나타나는 mtDNA 고갈 등이 포함될 수 있습니다. 이렇게 근육 조직에서 추출한 DNA는 결실 검출을 위한 서던 블롯과 장거리 PCR, 고갈 검출을 위한 실시간 PCR, 점 돌연변이 검출을 위한 염기서열 분석 등 다양한 유전자 검사에 사용할 수 있습니다.
강력한 초음파를 이용하는 초음파 처리는 미토콘드리아 진단의 여러 용도에 활용됩니다. 세포를 용해하여 미토콘드리아와 DNA 같은 세포 내 내용물을 추출하고, 염기서열 분석을 위해 mtDNA와 nDNA 같은 DNA를 전단하며, 시료를 균질화하는 데 사용됩니다.
고처리량 시료 전처리용 UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기는 멀티웰 및 96웰 플레이트의 시료를 균일하게 초음파 처리합니다
세포와 조직에서 미토콘드리아를 분리하는 방법
미토콘드리아 분리는 두 가지 필수 단계로 구성됩니다. 세포를 파쇄하여 내용물을 방출한 다음, 차등 원심분리를 이용하여 미토콘드리아 분획을 분리하고 회수합니다.
초음파 처리
Hielscher 초음파 처리기는 표준 세포 용해 완충액 및 키트와 호환되므로 미토콘드리아 분리에 적합합니다. 초음파 처리는 두 가지 주요 목적에 사용됩니다:
- 세포 용해: 초음파가 세포막을 파괴하여 세포 내 내용물을 방출합니다.
- 미토콘드리아 파쇄: 후속 단계에서 초음파 처리를 수행하면 미토콘드리아를 파쇄하여 미토콘드리아 단백질이나 미토콘드리아 DNA를 방출할 수 있습니다.
- mtDNA 단편화: 초음파 처리는 염기서열 분석을 위해 미토콘드리아 DNA를 전단하는 신뢰할 수 있는 기법입니다.
멀티웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP는 미토콘드리아 시료의 고처리량 전처리를 가능하게 합니다. 차등 원심분리와 함께 사용하면 초음파 처리는 미토콘드리아 분리 효율을 높여, 다양한 후속 응용에 적합한 온전한 미토콘드리아를 높은 수율로 확보할 수 있도록 합니다.
Hielscher UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기는 모든 표준 플레이트와 함께 사용할 수 있습니다
멀티웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP는 미토콘드리아 진단 등의 고처리량 시료 전처리에 다양한 이점을 제공합니다.
바이오마커 진단에서 고처리량 시료 전처리를 위한 UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기.
초음파를 이용한 mtDNA 단편화 절차 예시
준비 및 추출:
- C57BL/6 생쥐를 경추 탈구로 안락사시켰습니다.
- 간을 신속하게 적출하고 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 세척했습니다.
미토콘드리아 분리:
- 2-mL Dounce 조직 분쇄기와 조직용 미토콘드리아 분리 키트를 사용하여 미토콘드리아를 분리했습니다.
- 700× g 및 3,000× g에서 초기 원심분리.
- 완충액 C로 두 차례 추가 세척을 수행합니다.
DNA 분리:
- 700× g에서 수행한 첫 번째 원심분리로 얻은 펠릿을 핵 DNA(nDNA) 분리에 사용했습니다.
- 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 분리했습니다.
- 분리한 미토콘드리아에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 추출했습니다.
- 핵 조추출물에서 핵 DNA(nDNA)를 추출했으며, 두 DNA 모두 생쥐 간 조직에서 유래했습니다.
DNA 단편화:
- 0.5-mm 마이크로팁 소노트로드가 장착된 30-kHz/50-W 초음파 처리기 UP50H를 사용하여 얼음 위에서 14 μm로 2 × 30초 동안 DNA를 단편화했습니다.
단편화 시각화 및 정량화:
- 초음파 처리 후의 단편화는 SYBR safe DNA 염색 시약을 사용하여 1% 아가로스 겔에서 시각화했습니다.
- mtDNA와 nDNA의 상대적 양은 qPCR로 측정했습니다.
(cf. Mariero et al., 2019)
다중 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP는 고처리량 시료 전처리를 위해 표준 96웰, 다중 웰 및 마이크로타이터 플레이트에서 다수의 시료를 쉽게 전처리할 수 있도록 합니다.
UIP400MTP를 이용한 고처리량 시료 전처리의 장점에 대해 자세히 알아보세요!
초음파 처리를 이용한 최적의 미토콘드리아 분리를 위한 팁:
- 온도 제어: 모든 단계를 0°C에서 4°C의 온도 범위에서 수행하세요. 이는 미토콘드리아의 온전성과 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다.
- 효율성과 속도: 신속하게 작업하고, 미토콘드리아는 특정 응용 분야에 필요한 정도까지만 정제하세요. 과도한 조작은 미토콘드리아 성분의 상당한 손실을 초래할 수 있습니다.
- 현탁액 희석: 분리 과정 전반에 걸쳐 세포 및 세포소기관 현탁액의 농도를 낮게 유지하세요. 이는 포획과 응집의 위험을 최소화하여 분리된 미토콘드리아의 순도를 높이는 데 도움이 됩니다.
- 시료 부피: 한 번의 대규모 전처리보다 여러 번의 소규모 전처리를 선택하세요. 규모를 확대해도 회수 가능한 미토콘드리아의 양이 비례하여 증가하지 않으므로, 이 방식은 일반적으로 더 높은 수율을 제공합니다. 다중 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP는 미토콘드리아 분리를 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 세포 용해뿐 아니라 미토콘드리아에서의 단백질 추출도 용이하게 합니다.
이 지침을 따르면 초음파 세포 용해와 원심분리를 이용한 분리 과정의 효율성이 높아져, 후속 응용에 적합한 고품질 미토콘드리아 분리물을 얻을 수 있습니다.
Hielscher 초음파 처리기 – 독일에서 제조한 품질
Hielscher 초음파 처리기는 최고 수준의 품질과 설계 기준으로 잘 알려져 있습니다. 견고함과 간편한 조작 덕분에 당사의 초음파 처리기를 산업 시설에 원활하게 통합할 수 있습니다. Hielscher 초음파 처리기는 가혹한 조건과 까다로운 환경에도 쉽게 대응합니다.
Hielscher Ultrasonics는 ISO 인증 기업으로, 최첨단 기술과 사용자 편의성을 갖춘 고성능 초음파 처리기에 특히 중점을 둡니다. 물론 Hielscher 초음파 처리기는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
마이크로타이터 및 다중 웰 플레이트의 초음파 처리를 위한 96웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP
문헌 / 참고 자료
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
미토콘드리아 및 미토콘드리아 진단에 관해 자주 묻는 질문
미토콘드리아란 무엇인가요?
미토콘드리아는 대부분의 진핵생물 세포에서 발견되는 막으로 둘러싸인 세포소기관입니다. 세포 호흡 과정을 통해 아데노신 삼인산(ATP) 형태로 에너지를 생산하므로 세포의 발전소로 알려져 있습니다. 또한 미토콘드리아는 자체 DNA를 가지고 있으며, 세포 주기와 세포 사멸의 조절을 비롯한 다른 세포 과정에서도 핵심적인 역할을 합니다.
mtDNA와 유전체 DNA는 어떻게 다른가요?
미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 유전체 DNA(gDNA)와 여러 핵심적인 측면에서 다릅니다. mtDNA는 미토콘드리아에 위치하고 원형이며 모계로 유전되는 반면, gDNA는 세포핵에 위치하고 선형이며 양쪽 부모로부터 유전됩니다. mtDNA는 훨씬 작으며 단 37개의 유전자를 암호화하는 반면, gDNA에는 약 20,000–25,000개의 유전자가 포함되어 있습니다. mtDNA는 세포당 여러 사본으로 존재하고 돌연변이율이 더 높으며, 주로 미토콘드리아 기능에 관여하는 단백질을 암호화합니다. 이에 비해 gDNA는 일반적으로 이배체이고 돌연변이율이 더 낮으며, 생물체의 발생과 기능에 필요한 매우 다양한 유전자를 암호화합니다. 또한 mtDNA의 전사와 번역은 미토콘드리아 내부에서 이루어지는 반면, gDNA의 전사는 핵에서, 번역은 세포질에서 이루어집니다. 이러한 차이는 각각의 고유한 역할과 진화적 기원을 반영합니다.
무세포 추출물이란 무엇인가요?
무세포 추출물은 온전한 세포막 없이 단백질, 핵산 및 기타 세포 성분을 포함한 용해된 세포의 내용물이 들어 있는 용액입니다. 이 추출물은 생화학 및 분자생물학 연구에서 시험관 내 세포 과정을 연구하는 데 사용되며, 연구자가 살아 있는 세포 외부에서 반응과 메커니즘을 분석할 수 있게 합니다.
PCR 검사는 미토콘드리아 진단에서 어떤 역할을 하나요?
PCR 검사는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 돌연변이, 결실 또는 복제수 변이를 검출할 수 있게 하여 미토콘드리아 진단에서 중요한 역할을 합니다. 특정 mtDNA 영역을 증폭하여 미토콘드리아 질환과 관련된 병원성 변이를 식별할 수 있게 합니다. 정량 PCR(qPCR) 및 장거리 PCR과 같은 PCR 기반 기법은 mtDNA의 온전성, 이형질성 수준 및 mtDNA 고갈을 평가하는 데에도 사용되며, 미토콘드리아 기능과 질환에 대한 필수적인 통찰을 제공합니다.
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분별 원심분리란 무엇인가요?
분별 원심분리는 세포 분획화와 미토콘드리아 분리에 널리 사용되는 기법입니다. 이 방법은 밀도와 형태 모두에 따라 달라지는 침강 계수를 기준으로 세포 구조물을 분리합니다. 이 과정에서는 특정 밀도의 완충 염 용액에 들어 있는 시료에 다양한 수준의 원심력을 가합니다. 침강 계수가 비슷한 구조물은 동시에 수집 튜브 바닥에 침전되므로 이를 회수할 수 있습니다.
미토콘드리아 분리에 분별 원심분리를 어떻게 사용하나요?
분별 원심분리를 통해 연구자는 미토콘드리아 분획을 다른 세포 성분으로부터 효과적으로 분리할 수 있습니다. 미토콘드리아 분리에는 여러 차례의 원심분리 단계와 그에 따른 분리물 회수가 포함됩니다.
초기 원심분리: 낮은 원심력을 가하여 큰 세포 잔해와 핵을 침전시킵니다.
후속 원심분리: 원심력을 단계적으로 높여 미토콘드리아가 풍부한 분획을 침전물로 만듭니다. 각 원심분리 단계에서는 침강 계수가 점차 더 높은 구조물을 제거합니다.
분획 회수: 각 원심분리 후 침전물을 수집하고, 상층액에 더 높은 g 힘을 가하여 다음 분획을 분리합니다. 원하는 미토콘드리아 순도에 도달할 때까지 이를 반복합니다.