ულტრაბგერითი წარმოება მაღალი სიწმინდის შიზოფილანის ბეტა-გლუკანების

შიზოფილანი არის სოკოვანი β-გლუკანი იმუნომოდულაციური თვისებებით. მაღალი აქტიური სამედიცინო ეფექტებისთვის, შიზოფილანს უნდა ჰქონდეს დაბალი მოლეკულური წონა, რათა გამოავლინოს გაუმჯობესებული ბიოშეღწევადობა. დადასტურდა, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება ამცირებს შიზოფილანის მოლეკულურ წონას. როგორც საიმედო და ეფექტური მეთოდი, ულტრაბგერითი დამუშავება მარტივად შეიძლება გამოყენებულ იქნას დაბალი მოლეკულური წონის შიზოფილანის წარმოებისთვის.

შიზოფილუმის სოკოები და ულტრაბგერითი ბეტა-გლუკანის ექსტრაქცია

შიზოფილუმის სოკოს სახეობები ბუნებაში იზრდებიან ლპობად ხეებზე წვიმიანი სეზონების შემდეგ. ნაყოფის სხეულები გროვდება შემდგომ მშრალ სეზონში. შიზოფილუმის სახეობები მდიდარია ბიოქიმიური ნაერთებით, როგორიცაა გლუკანები, და ამიტომ განსაკუთრებით ტროპიკულ ქვეყნებში მოიხმარება როგორც საკვები და წამალი. იმუნომოდულაციური, ანტიფუნგალური, ანტინეოპლასტიკური და ანტივირუსული თვისებების გამო შიზოფილუმ კომუნე, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც Splitgill სოკო, დააინტერესა ბიოტექნოლოგიური და ფარმაცევტული კომპანიები.
პოლისაქარიდი შიზოფილანი, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც sizofiran, sonifilan, ან sizofilan, არის მთავარი β-გლუკანი, რომელიც აღმოჩენილია შიზოფილუმის სოკოებში, რომლებიც სთავაზობენ მაღალეფექტურ ბიოაქტიურ β-გლუკან შიზოფილანს.
შიზოფილუმ კომუნეს სოკოები ბუნებაში იზრდებიან ხეებზე, მიცელიუმის კულტივირება ასევე შესაძლებელია ფერმენტაციის ბუიონში. ფარმაცევტული და კოსმეტიკური გამოყენებისთვის, დაბალი მოლეკულური წონის შიზოფილანი ბევრად უფრო ეფექტურია, ვიდრე მაღალი მოლეკულური წონის შიზოფილანი. ეს გამოწვეულია იმ ფაქტით, რომ დაბალი მოლეკულური წონის შიზოფილანი აჩვენებს მნიშვნელოვნად უკეთეს ბიოშეღწევადობას და აბსორბციის მაჩვენებლებს. გარდა ამისა, მაღალი მოლეკულური წონის შიზოფილანი ხშირად პრობლემურია გამოყენებაში, რადგან ის იწვევს მისი წყალხსნარების მაღალ სიბლანტეს.
ულტრაბგერითი ზომის შემცირება არის მაღალეფექტური და საიმედო ტექნიკა შიზოფილანის მოლეკულური წონის დასაყვანად, რითაც იზრდება β-გლუკანის მოლეკულის ხარისხი.

დაბალი მოლეკულური წონის შიზოფილანის წარმოების პროტოკოლი

რადგან შიზოფილანის მოლეკულური წონა მკვეთრად უკეთეს ბიოშეღწევადობას და გამოყენების თვისებებს აჩვენებს, სმირნოვის სამეცნიერო ჯგუფმა შეისწავლა ულტრაბგერითი დამუშავება β-გლუკანის მოლეკულა შიზოფილანის გასაყოფად და ზომის შესამცირებლად.

შიზოფილანის ულტრაბგერითი დამუშავება

β-1.3(1.6)-გლუკანი შიზოფილანი (SPG) მიიღება S. commune სოკოს ჩაძირული კულტივირებით ბიორეაქტორში, სუბსტრატად საქაროზის გამოყენებით.
კულტივირების დასრულების შემდეგ, კულტურული ბუიონი განზავდა დემინერალიზებული წყლით შიზოფილანის კონცენტრაციამდე 2 g/L და დამუშავდა ულტრაბგერითი პროცესორი UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, გერმანია) რეცირკულაციის რეჟიმში შემდეგი პარამეტრებითა და პირობებით: საშუალო ნაკადი 50 mL/s, სიხშირე 20 kHz, გამომავალი სიმძლავრე 2000 W, სონოტროდის ტიპი BS2d22, ბუსტერის ტიპი B2-1.4 და ამპლიტუდა 100%. კულტურული ბუიონის ტემპერატურა ულტრაბგერითი დამუშავების დაწყებისას იყო 25°C. ულტრაბგერით დამუშავებული კულტურული ბუიონი (სპეციფიკური ენერგიის შეყვანა 100 Ws/mL) გაიფილტრა Seitz HS800 სიღრმისეული ფილტრის გავლით 1,5 bar წნევის ქვეშ 40°C-ზე. ულტრაბგერით დამუშავებული შიზოფილანი (uSPG) ქიმიური დახასიათებისთვის ჩამოილექა ფილტრატიდან სამჯერადი რაოდენობის იზოპროპილის სპირტით ლაბორატორიულ ტემპერატურაზე და გაშრა 60°C-ზე 12h-ის განმავლობაში. uSPG-ის ხსნარები იმუნოლოგიური კვლევებისთვის მომზადდა შემდეგნაირად: (1) ულტრაბგერით დამუშავებული კულტურული ბუიონის ფილტრატი დიაფილტრდა 0,1m2 Pall Centramate T-series PES კასეტის გავლით (100 kDa კვეთა) 0,8 bar-ზე და დიაფილტრაცია გაგრძელდა მანამ, სანამ რეტენატის გამტარობა არ გახდა 20 μS/cm; (2) ხსნარი კონცენტრირდა დიაფილტრაციით uSPG-ის კონცენტრაციამდე 1 g/L და სტერილიზდა ავტოკლავირებით 120°C/20 წთ. დენატურირებული uSPG მომზადდა მსგავსი გზით, გარდა იმისა, რომ კულტურული ბუიონის ფილტრატს დაემატა NaOH კონცენტრაციით 0,2 M და ალკალიზებული ხსნარი ინკუბირდა 30 წთ ლაბორატორიულ ტემპერატურაზე დიაფილტრაციამდე.

ანალიზური მეთოდები

მიცელიუმის სიმრავლე შეფასდა გრავიმეტრიულად: კულტურული ნარჩენი გაიზავა წყალში 1:4 თანაფარდობით, ცენტრიფუგირდა 10 000 × g-ზე 25°C-ზე 20 წთ-ის განმავლობაში, ნალექი გაიწმინდა სამჯერადი რაოდენობის წყლით, გაშრეცა 60°C-ზე და შეიწონა. შიზოფილანი გამოიყოფა სუპერნატანტიდან სამჯერადი რაოდენობის იზოპროპილის სპირტით, გაშრეცა 60°C-ზე 24h-ის განმავლობაში და მისი სიმრავლე დადგინდა გრავიმეტრიულად. pO2 კულტურულ ნარჩენში გაიზომა ოპტიკური ზონდით Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, შვეიცარია).
კულტურული ნარჩენის დინამიური სიბლანტე გაიზომა HAAKE Visco Tester 6L-ზე 1L და 2L შპინდლებით 4°C-ზე და 30 rpm ბრუნვის სიჩქარით. ფილტრაციის სიჩქარე გამოთვლილია 500 mL კულტურული ნარჩენის ფილტრაციის დროის მიხედვით 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, აშშ) სიღრმისეული ფილტრის გავლით 1,5 bar წნევისა და 40°C-ის პირობებში.
uSPG მოლეკულური წონა გაიზომა SEC-MALLS-ით HPLC სისტემა Alliance (Waters)-ზე, თანმიმდევრულად შეერთებული PL aquagel OH60 და PL aquagel OH40 კოლონებით, და დეტექტორი miniDAWN TREOS (Wyatt) კონცენტრირდა დიაფილტრაციით uSPG კონცენტრაციამდე 1 g/L და სტერილიზდა ავტოკლავირებით 120°C/20 min. დენატურირებული uSPG მომზადდა მსგავსი გზით, გარდა იმისა, რომ კულტურული ნარჩენის ფილტრატში დაემატა NaOH 0,2 M კონცენტრაციით და ალკალიზებული ხსნარი ინკუბირდა 30 min-ის განმავლობაში ლაბორატორიულ ტემპერატურაზე დიაფილტრაციამდე.

შედეგები:
ულტრაბგერითი დამუშავება პირდაპირ გამოიყენებოდა S. commune 144-სთ კულტურული ნარჩენის მიცელიუმთან ერთად, SPG-ს შემდგომი დამუშავების გასამარტივებლად.
 
ულტრაბგერითად დამუშავებული შიზოფილანის მახასიათებლები: ულტრაბგერითად დამუშავებული შიზოფილანი (uSPG) გამოილექა კულტურული ნარჩენის ფილტრატიდან სპირტით და დახასიათდა. SEC-MALLS-ით uSPG-ის Mw შეფასდა დაახლოებით 1 MDa-ად. შიზოფილანის საშუალო მოლეკულური წონა თხევადი ფერმენტაციისას არის დაახლოებით 5 MDa, ხოლო მყარფაზურ კულტივირებისას ის შეიძლება მიაღწიოს 10 MDa-მდე. ულტრაბგერითად დამუშავებული შიზოფილანის მოლეკულური წონის ბუნებრივი, დაუმუშავებელი შიზოფილანის მოლეკულურ წონებთან შედარებისას შეინიშნება ულტრაბგერითი დამუშავების გამო 5–10-ჯერ შემცირებული მოლეკულური წონა.
ულტრაბგერითად დამუშავებული პოლისაქარიდი uSPG შეიცავდა 0,7% w/w ცილას და 1,0% w/w ნარჩენს ანთების შემდეგ. uSPG ჰიდროლიზატი შედგებოდა გლუკოზისგან მეტი ვიდრე 99%-ით. ანალიზური შედეგები მიუთითებს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება უსწორმასწოროდ ჭრის β-გლუკანის ძირითად ჯაჭვს და გვერდითი რგოლები რჩება მთლიანი, რითაც მცირდება შიზოფილანის ზომა და მოლეკულური წონა. იმუნოლოგიური კვლევები ძირითადად ცილა- და ენდოტოქსინ-თავისუფალ uSPG-ზე აჩვენა, რომ ულტრაბგერითად დამუშავებულ დაბალ-Mw შიზოფილანს აქვს გამოხატული იმუნომოდულაციური აქტივობა.

 
შემცირებული სიბლანტე: ულტრაბგერითმა დამუშავებამ გამოიწვია კულტურული ნარჩენის სიბლანტის მნიშვნელოვანი შემცირება. ულტრაბგერითი დამუშავების დროს, კულტურული ნარჩენის სიბლანტე იცვლებოდა არაწრფივად: სიბლანტის შემცირება იყო სწრაფი ულტრა-ბგერითი დამუშავების დასაწყისში, მაგრამ შემდეგ ის ნელდებოდა. კუთრი ენერგიის შეტანა 100 Ws/mL იყო საკმარისი კულტურული ნარჩენის სიბლანტის თითქმის 7-ჯერ შესამცირებლად.

გაუმჯობესებული ფილტრაცია: ულტრაბგერით დამუშავებული კულტურის ნაყენი ფილტრში უფრო სწრაფად გადიოდა, ვიდრე დამუშავების გარეშე დარჩენილი კულტურის ნაყენი (სპეციფიკური ენერგიის შეყვანა 0 Ws/mL) მაღალმოლეკულური SPG-ით. გარდა ამისა, ულტრაბგერითმა დამუშავებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა პროდუქტის დაკარგვა ფილტრაციის დროს. დამუშავების გარეშე დარჩენილი კულტურის ნაყენის ფილტრატში მაღალმოლეკულური SPG-ით (სპეციფიკური ენერგიის შეყვანა 0 Ws/mL) შეიცავდა 0,3 ± 0,07 g/L SPG-ს, მაშინ როცა SPG-ს კონცენტრაცია სიღრმისეულ ფილტრაციამდე იყო 2 g/L. ამის საპირისპიროდ, 100 Ws/mL ულტრაბგერით დამუშავებული კულტურის ნაყენის ფილტრატი შეიცავდა SPG-ს 2,2 ± 0,2 g/L კონცენტრაციით, რაც თითქმის ნულოვან პროდუქტის დაკარგვას შეესაბამება.

დასკვნა: დასკვნაში სამეცნიერო ჯგუფი აღნიშნავს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება არის ეფექტური ტექნოლოგია დაბალმოლეკულური შიზოფილანის წარმოებისთვის, რომელიც შემდგომში შეიძლება გამოყენებულ იქნას კოსმეტიკასა და მედიცინაში. ულტრაბგერითი დამუშავება, როდესაც ის გამოიყენება მთლიან კულტურის ნაყენზე მიცელიუმთან ერთად, შიზოფილანის წარმოებაში ზოგიერთ უპირატესობას ქმნის. ის ამცირებს პროდუქტის დაკარგვას შემდგომი დამუშავების დროს და ხდის მაღალგადასუფთავებული პოლისაქარიდის წარმოებას შესაძლებელს ულტრაფილტრაციის ეფექტური გამოყენების გამო.
გარდა ამისა, მკვლევრებმა აღმოაჩინეს, რომ შიზოფილანის ულტრაბგერითი დამუშავება მარტივად მასშტაბურდება. UIP2000hdT საცდელი ქარხნის ულტრაბგერითი დისინტეგრატორის ერთმა ერთეულმა დამუშავა 1 ლიტრი კულტურის ნაყენი 110 წამში ნაკადის რეჟიმში. სისტემის პროდუქტიულობა მარტივად იზრდება დამატებითი ულტრაბგერითი ერთეულების თანმიმდევრული ჩართვით.

 
გაიგეთ მეტი სოკოს ექსტრაქციის მარტივი მასშტაბირების შესახებ!
 

მაღალეფექტური ულტრაბგერითი აპარატურა სოკოს გლუკანების დამუშავებისთვის

პოლისაქარიდების, როგორიცაა გლუკანები, ასევე სხვა ბიოაქტიური ნაერთების, როგორიცაა ქიტინი და ქიტოზანი, ფრაგმენტაცია შესაძლებელია სანდოდ განხორციელდეს Hielscher-ის მაღალეფექტური ულტრაბგერითი აპარატურით. ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები შეუძლიათ უზრუნველყონ მაღალი ამპლიტუდები, სთავაზობენ პროცესის პარამეტრების ზუსტ კონტროლს და შეუძლიათ მუშაობა 24/7 მძიმე დატვირთვისა და მომთხოვნ გარემოში. Hielscher Ultrasonics-ის აპარატურის დიაპაზონი სანდოდ აკმაყოფილებს ამ მოთხოვნებს. შესანიშნავი ულტრაბგერითი წარმადობის გარდა, Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები იწონებენ მაღალ ენერგოეფექტურობას, რაც მნიშვნელოვანი ეკონომიკური სარგებელია – განსაკუთრებით კომერციული მასშტაბური წარმოების გამოყენებისას.
Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები არის მაღალეფექტური სისტემები, რომლებიც შეიძლება აღიჭურვოს აქსესუარებით, როგორიცაა სონოტროდები, ბუსტერები, რეაქტორები ან ნაკადის კამერები, რათა ოპტიმალურად დააკმაყოფილონ თქვენი პროცესის მოთხოვნები. ციფრული ფერადი დისპლეით, ულტრაბგერითი დამუშავების სესიების წინასწარი დაგეგმვის შესაძლებლობით, ინტეგრირებულ SD ბარათზე ავტომატური მონაცემთა ჩაწერით, დისტანციური ბრაუზერული კონტროლითა და ბევრი სხვა ფუნქციით, უზრუნველყოფილია პროცესის მაღალი კონტროლი და მომხმარებლისთვის მოსახერხებლობა. მდგრადობასა და მძიმე დატვირთვის შესაძლებლობასთან ერთად, Hielscher-ის ულტრაბგერითი სისტემები არის თქვენი სანდო მუშა ცხენი წარმოებაში. β-გლუკანების, როგორიცაა შიზოფილანი, მოლეკულური მასის შემცირებას სჭირდება მძლავრი ულტრაბგერა მიზნობრივი გახლეჩისა და მაღალი ხარისხის საბოლოო შიზოფილანის პროდუქტის მისაღებად, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ფარმაცევტული დანიშნულებით.
 
აქ იპოვეთ მეტი ინფორმაცია სოკოებიდან ულტრაბგერითი ბეტა-გლუკანების ექსტრაქციის შესახებ, მათ შორის ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქციები!
ქვემოთ მოცემული ცხრილი გვაწვდის ინფორმაციას ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების დაახლოებითი დამუშავების სიმძლავრის შესახებ: