პროტეომიკის პროტოკოლი: არასმაკონტაქტო სონიკაცია აძლიერებს პეპტიდური ნიმუშის მომზადებას MS-ისთვის
ქვემოდან ზევით პროტეომიკა გახდა თანამედროვე ბიომარკერების აღმოჩენის, სტრუქტურული ბიოლოგიისა და კლინიკური დიაგნოსტიკის ქვაკუთხედი. მასსპექტრომეტრიის (MS) ანალიზამდე ცილების პეპტიდებად მონელებით, მკვლევარებს შეუძლიათ მიაღწიონ უფრო ღრმა თანმიმდევრობის დაფარვას და უფრო საიმედო რაოდენობრივ განსაზღვრას. თუმცა, გაფანტული სკლეროზისთვის მაღალი სირთულის ბიოლოგიური ნიმუშების მომზადება ტექნიკურად მომთხოვნი რჩება. ბოლოდროინდელი მეთოდოლოგიური მიღწევები ხაზს უსვამს იმას, თუ როგორ კონტროლირებადი ულტრაბგერითი დამუშავება – კონკრეტულად უკონტაქტო VialTweeter Multi-Tube sonicator და UIP400MTP Microplate sonicator – შეუძლია მნიშვნელოვნად გაამარტივოს ეს სამუშაო პროცესი, გააუმჯობესოს რეპროდუცირება და თავიდან აიცილოს ინსტრუმენტის საერთო შეფერხებები.
იპოვნეთ ნიმუშის მომზადების დეტალური პროტოკოლი, რათა მიიღოთ შესაფერისი ზომის პეპტიდები MS-ის ანალიზისთვის.
ვინ უნდა გამოიყენოს კონტაქტის გარეშე ონიცაცია პეპტიდური ნიმუშების მომზადებისთვის?
- ბოთომ-აპ პროტეომიკა & აღმოჩენის ლაბორატორიები: მეცნიერები, რომლებიც ამზადებენ მაღალი კომპლექსურობის ნიმუშებს LC-MS ან MALDI სამუშაო პროცესებისთვის, რომელთაც სურთ თანმიმდევრული, მაღალი გამომავლობის პეპტიდური აღდგენა სხვადასხვა ბიოლოგიურ მატრიცებში.
- S-Trap™ & სასუსპენზიო ტრაპინგის მომხმარებლები: ჯგუფები, რომლებიც იყენებენ მიკრო-კოლონების გაწმენდას და სჭირდებათ DNA-ის კონტროლირებული გაყოფა კოლონების დაგუბების თავიდან ასაცილებლად და ნიმუშის გლუვი ჩატვირთვისა და გადანაწილებისთვის.
- კლინიკური & ტრანსლაციური კვლევის ჯგუფები: ლაბორატორიები, რომლებიც ამუშავებენ ქსოვილებს, უჯრედებს, პლაზმას, სერუმს ან ტვინის ნიადაგის სითხეს, სადაც მონაცვლეობითი გამრავლებობისა და ნიმუშის მთლიანობის შენარჩუნება კრიტიკულია.
- კვანტიტატიური & ტარგეტირებული MS გუნდები: ლაბორატორიები, რომლებიც ატარებენ მკაცრ ტოლ დამახასიათებელ კვლევებს, სადაც მრავალჯერადი probe sonicator-ები იწვევს დაბინძურების რისკებს, რაც შეიძლება დააზიანოს დაბალი სიჭარბის პეპტიდების რაოდენობრივი აღრიცხვა.
- პროდუქტიული სერვისები & მაღალი გამტარებლობის ოპერაციები: ჯგუფები, რომლებიც ერთდროულად მრავალი ბიოლოგიური რეპლიკატების დამუშავებით არიან დაკავებული და სარგებლობენ დახურულ-ზონაში, მრავალზონიან ბლოკში სონიკაციით VialTweeter-ით, რომელიც გამორიცხავს პრობის წმენდას, ამცირებს ხელით შესრულებულ დროს და ინარჩუნებს ასეპტიკურ პირობებს.
- PTM & სტრუქტურული ცილების მკვლევრები: მეცნიერები, რომლებსაც სჭირდებათ ნაზი, ტემპერატურულად კონტროლირებადი დამუშავება, რათა შეინარჩუნონ ლაბილური მოდიფიკაციები და მაქსიმალურად გაზარდონ სექვენსის დაცვა უჯრედების ლიზისისა და ჰომოგენიზაციის დროს.
მრავალ ნიმუშის სონიკატორი “VialTweeter” ბევრმა დახურულ ვიალებში ცალკეული ნიმუშების მომზადებისთვის პროტეომიკაში
პროტოკოლის მიმოხილვა: ქსოვილებიდან და უჯრედებიდან MS-ისთვის მზად პეპტიდებამდე
ფართოდ მიღებული ქვემოდან ზევით პროტეომიკის სამუშაო პროცესი, რომელიც ასახულია ვოიტკევიჩის და სხვების მიერ. გთავაზობთ მძლავრ, მასშტაბურ მეთოდს პეპტიდის ნიმუშების მოსამზადებლად სხვადასხვა ბიოლოგიური მატრიცებიდან. დაწყებული 50-100 მგ გაყინული ქსოვილით ან 1-20 მილიონი უჯრედით, პროტოკოლი აერთიანებს სუსპენზიის ჭერის (S-Trap™) ტექნოლოგიას, რათა ეფექტურად ამოიღოს სარეცხი საშუალებები, მარილები და დამაბინძურებლები ფერმენტული მონელებამდე.
ლიზისის, ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრის, შემცირებისა და ალკილაციის შემდეგ, ნიმუში მჟავად ხდება და იტვირთება S-Trap™ სპინის სვეტზე, სადაც ხდება ტრიფსინ/ლიზს მონელება. მიღებული პეპტიდები იხსნება, შრება და ექვემდებარება LC-MS ანალიზს. ადამიანის გულის 50 მგ ქსოვილზე გამოყენებისას, ეს სამუშაო პროცესი მუდმივად იძლევა საკმარის პეპტიდებს 30-40 ინექციისთვის, რაც განსაზღვრავს 4,000-ზე მეტ უნიკალურ ცილას თითო გაშვებაში. მიუხედავად იმისა, რომ ქიმია და სვეტებზე დაფუძნებული გაწმენდა კარგად არის განსაზღვრული, მილსადენის წარმატება დიდწილად დამოკიდებულია საწყის ფიზიკურ დარღვევაზე და დნმ-ის მართვის საფეხურებზე.
პროტოკოლი რეკომენდაციას უწევს VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ის გამოყენებას უჯრედების გაჟონვისთვის და დნმ-ის გაპარსვისთვის – ორივე ნაბიჯი გადამწყვეტია პეპტიდების ანალიზისთვის.
VialTweeter ათხელებს შეფუთულ 1.0, 1.5 და 2.0 მლ ეპენდორფის ტუბებს და სხვადასხვა NUNC ვაილებს
ულტრაბგერითი უჯრედებისა და ქსოვილების ლიზისი პროტეინის გამოყოფისათვის
დაბლა-ზედა პროტეომიკის სამუშაო პროცესში, სონიკაცია მნიშვნელოვანი ნაბიჯია უჯრედის ნიმუშის ლიზისში, რათა გამოეყოს პროტეინები შემდგომი მასის სპექტრომეტრიის ანალიზისთვის. უჯრედის პელეტისთვის SDS უჯრედის ლიზის ბუფერის დამატების შემდეგ, ნიმუშები ულტრაბგერითი პროცესის გავლა უტარებენ VialTweeter მრავალტუბიანი სონიკატორის გამოყენებით. პროტოკოლი იყენებს 1.5 მლ-მიკროფიუჟის ტუბებს და განსაზღვრავს სონიკატორის მუშაობას 30% სიმძლავრეზე 10 წამი ჩართული და 10 წამი გამორთული ციკლით, რომელიც გაიმეორება 3-ჯერ. შემდეგ 1 წუთის ლოდინის შემდეგ, ციკლი კიდევ ორჯერ მრავალჯერ განმეორდება. ნიმუშები უწყვეტად აცივდება ყინულით.
ეს პროცესი არა მხოლოდ აწვდის დახმარებას უჯრედების დანგრევაში, არამედ ის სპეციალურად აუცილებელია ლიზისის დროს გამოყოფილი გენომური DNA-ის გადაჭრესთვის. ეფექტური DNA-ის გაჭრა მნიშვნელოვანია ნიმუშის სუსტიობის შესამცირებლად და S-Trap™ კოლონების დაბლოკვის თავიდან ასარიდებლად, რაც უზრუნველყოფს ოპტიმალურ პროტეინის აღდგენას და აღდგენილ შემდეგ პეპტიდის დაშლას.
ულტრაზონური DNA გაჭრის გადამწყვეტი როლი
S-Trap™-ზე დაფუძნებული სამუშაო პროცესების ერთ-ერთი ყველაზე ხშირი წარუმატებლობა არის კოლონის დაბლოკვა, რაც თითქმის ერთმნიშვნელოვნად გამოწვეულია უჯრედების ან ქსოვილის ჰომოგენიზაციის დროს გამოყოფილი მაღალი მოლეკულური წონის გენომური DNA-ით. მთელი DNA მნიშვნელოვნად ზრდის ნიმუშის სუსტიობას, ხვდება პეპტიდებს და ბლოკავს მიკროპოროზულ S-Trap™ სორბენტურ საწოლს.
ულტრასონიკური დამუშავება ამ პრობლემას ხსნის DNA-ის მექანიკური ფრაგმენტირებით, მცირე, ხსნად ფაგმენტებად. კონტროლირებადი აკუსტიკური ენერგიის გამოყენებით, VialTweeter ეფექტურად ჭრის ნუკლეინის მჟავებს, ზედმეტი სიცხის გამოწვევის ან უცხო კონტამინანტების შეყვანის გარეშე. ეს სისქის შემცირება უზრუნველყოფს სითხის გლუვ ჩატვირთვას, სტაბილურ დინების სიჩქარეს და დაუდევრებელ გლიკოზის კინეტიკას.
ოპტიმიზირებული VialTweeter სონიკაციის პარამეტრები
პროტოკოლი განსაზღვრავს მაღალრეპროდუქციულ სონიკაციის რეჟიმს, რომელიც ოპტიმიზირებულია ბიოლოგიური ნიმუშის მთლიანობისა და მომდევნო მასსპექტროსკოპიის შესაბამისობისთვის. 1,5მლ-მიკროცენტრიფიუგის ჩასადებში მოთავსებული ნიმუშებისთვის, Hielscher VialTweeter არასაკონტაქტო ბლოკ-სონიკატორის გამოყენებით, შემდეგი პარამეტრები უზრუნველყოფს ლიზისსა და ოპტიმალური DNA-ის ჭრას, პროტეინის სტრუქტურის შენარჩუნებით:
- ამპლიტუდა: 30% ენერგია
- ციკლის ნიმუში: 10 წამი ჩართვა / 10 წამი გამორთულია
- ხანგრძლივობა: 3 ციკლი (10 წამი ჩართვა/10 წამი გამორთვა) → 1 წუთი დასვენება ყინულზე → გაიმეორეთ კიდევ 2-ჯერ
- ტემპერატურის მენეჯმენტი: ნიმუშები მოთავსებულია ყინულზე დამუშავების დროს, რათა თავიდან იქნას აცილებული თერმული დენატურაცია და ნაადრევი ფერმენტული აქტივობა
ეს იმპულსური გაჟონვის მიდგომა ხელს უშლის ლოკალიზებულ გადახურებას, ამცირებს პეპტიდების დაჟანგვას და უზრუნველყოფს ერთგვაროვან აკუსტიკური ექსპოზიციას ყველა ფლაკონზე. დახურული მილის დაყენება ასევე გამორიცხავს ნიმუშებს შორის ზონდის გაწმენდის აუცილებლობას, რაც მკვეთრად ამცირებს პრაქტიკულ დროს და ოპერატორის ცვალებადობას.
მთავარი უპირატესობები თანამედროვე პროტეომიკის სამუშაო პროცესისთვის
VialTweeter-ის ინტეგრირება თქვენი ქვედა-ზედაპირის პროტეომიკის სამუშაო პროცესში გაძლევთ რამდენიმე ოპერაციულ და სამეცნიერო სარგებელს:
- დნმ-ის კონსისტენტური ფრაგმენტაცია: ერთგვაროვანი акуსტიკური ენერგიის მიწოდება ყველა ბიოლოგიური კონტეინერისადმი უზრუნველყოფს აღდგენს სითხის შეზღუდვას და თავიდან ავიცილოთ ჯგუფიდან ჯგუფამდე ცვლილებები S-Trap™ დატვირთვის პროცესში.
- ლაბილური მოდიფიკაციების შენარჩუნება: ქვედა ტემპერატურის გადამუშავება ყინულის აბაზანაში იცავს გადამუშავებით შემდგომ მოდიფიკაციებს (PTMs) და უშლის ტემპერატურის გავლენით პროტეინების აგრეგაციას უჯრედების ლიზისის დროს.
- შენ streamlined ჩამოსული პროცესების პროცესი: VialTweeter-ით გადამუშავებული ლიზატები შეიძლება პირდაპირ გაწმინდოთ ცენტრიფუგაციის გზით და განისაზღვროს დამატებითი გაწმენდის ნაბიჯების გარეშე, რაც აჩქარებს გზას S-Trap™ დიგესტიამდე.
- მასშტაბურობა & მოქნილობა: ერთი და იგივე სონიკაციის პარამეტრები გამოიყენება როგორც მაღალი სირთულეების მქონე ქსოვილის ნიმუშებზე, ასევე უჯრედების სუსპენზიებში, რაც ხელს უწყობს გადამოწმების პროტეომიკას, გეგმურ რაოდენობრივ ანალიზს და გლიკოპროტეომიკის სამუშაო პროცესებს. Hielscher-ის მიკროპლატის სონიკატორები საშუალებას აძლევს მარტივად გაზარდოთ ნიმუშების რაოდენობა მრავალ ჭურჭელში.
უკონტაქტო Multi-Tube Sonicator VialTweeter შესაძლებელია მართოთ გამაგრილებელ კაბინეტებში.
სონიკატორები პროტეომიკის ნიმუშების მომზადებისთვის
მაღალი ხარისხის პეპტიდური ნიმუშების მომზადება მასსპექტრომეტრიისთვის მოითხოვს უფრო მეტს ვიდრე ეფექტური ლიზისი. – ის მოითხოვს ზუსტ კონტროლს დნმ-ის შეკუმშვაზე, ტემპერატურაზე და დაბინძურების პრევენციაზე. Hielscher VialTweeter-ის თქვენს ქვემოდან ზევით პროტეომიკის სამუშაო ნაკადში ჩართვის საშუალებით, თქვენ შეგიძლიათ აღმოფხვრათ S-Trap™ ჩაკეტვა, უზრუნველყოთ პროტეინის რეპროდუცირებადი აღდგენა და შეინარჩუნოთ სისუფთავე, რომელიც საჭიროა მგრძნობიარე MS ანალიზებისთვის. ადამიანის ქსოვილს, კულტივირებულ უჯრედებს თუ კომპლექსურ ლიზატებს ამუშავებთ, ულტრაბგერითი ბლოკის დამუშავება უზრუნველყოფს საიმედოობას, მასშტაბურობას და პროცესის კონტროლს, რასაც თანამედროვე პროტეომიკის ლაბორატორიები ითხოვენ.
ნიმუშების უფრო მაღალ რაოდენობამდე გასადიდებლად, ისარგებლეთ Hielscher-ის ორიენტირებული, უკონტაქტო მიკროპლატის სონიკატორის მოდელებით UIP400MTP და UIP550MTP! დაამუშავეთ ნებისმიერი სტანდარტული მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტა მაღალი გამტარუნარიანობის პროტეომიკისთვის!
დახურული მილით დამუშავება vs ტრადიციული პრობის სონიკატორები
ისტორიულად, მკვლევარები დამოკიდებული იყვნენ პირდაპირ კონტაქტურ პროაბ სონიკატორებზე DNA-ის გაყოფისთვის. მიუხედავად ეფექტურობისა, პროაბ სისტემები ხელს უწყობენ რამდენიმე კრიტიკულ შეზღუდვას პროტეომიკულ პროცესებში:
- ჯვარედინი დაბინძურების რისკი: პრობს რამდენიმე ნიმუშზე მეორედ გამოყენება ქმნის აეროზოლის გადატანას და გულმკერდობს ჯვარედინ დაბინძურებებს, რომლებიც არასწორად ეფექტიანად აფასებენ MS–ის რაოდენობრივ შედეგებს.
- ნიმუშის დაკარგვა: პირდაპირ ჩასმა შეიძლება გამოიწვიოს ცვეთას, აორთქლებას და ძვირფასი პეპტიდების პრობს ზედაპირზე დაშლას.
- გასაწმენდი: Probe-ის სრულად სადეზინფექციო პროცესი მუშაობებს შორის დრო-საჭიროა და ხშირად incompletoა, რაც აუარესებს დაბალ-შედარებით პროტეინის კვლევებს.
VialTweeter ბლოკ სონიკატორი ამუშავებს მასალებს მთლიანად დახურულ მიკროცენტრიფიურში ტუბებში. ეს დახურული სისტემის დიზაინი ამცირებს probe-ის და ნიმუშის შეხებას, ხელს უშლის აეროზოლის წარმოებას და ინარჩუნებს მკაცრ ასეპტიკურ პირობებს ჰომოგენიზაციისა და ლიზისის დროს. ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც ამუშავებენ მაღალი კომპლექსურობის ქსოვილების ლიზატებს ან მრავალ სელულარულ ხაზს, ეს ნიშნავს სუფთა MS მონაცემებს, უფრო მაღალ პეპტიდების აღდგენას და უფრო სანდო ბიოლოგიურ რეპლიკატებს.
მაღალი-გამავლობის ნიმუშის მომზადებაზე გადატანა მრავალჭრილში ფირფიტებზე
Microplate Sonicator მოდელებით UIP400MTP და UIP550MTP, ტუბის დამუშავება მარტივად შეიძლება მასშტაბირებული მაღალი-გამავლობის ნიმუშის დამუშავებაზე ნებისმიერ სტანდარტულ მრავალჭრილ ფირფიტაში.
მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP ნიმუშებიდან მაღალი გამტარუნარიანობის ცილის ექსტრაქციისთვის
ხშირად დასმული კითხვები პეპტიდის ნიმუშების მომზადებისთვის სონიკაციის შესახებ
რატომ არის საჭირო სონიკაცია S-Trap™ პეპტიდების დამუშავებამდე?
სონიკაცია აუცილებელია მაღალი მოლეკულური წონის გენომური ДНК-ს მოჭრისთვის, რომელიც გამოიყოფა უჯრედის ან ქსოვილის დაშლის დროს. მთლიანად ДНК მნიშვნელოვნად ზრდის ნიმუშის სიბლანტეს, რაც შეიძლება დაბლოკოს S-Trap™ მიკრო-კოლონა და შეაჩეროს პეპტიდები, მკვეთრად ამცირებს აღდგენის პროცესს და MS-ის თავსებადობას.
როგორ აუმჯობესებს VialTweeter ბლოკ- სონიკატორი ნიმუშების მომზადებას ტრადიციულ_probe სონიკატორებთან შედარებით?
შეზღუდული კონტაქტის სონიკატორებისგან განსხვავებით, რომლებიც სამუშაოების შორის გეგმიური სისუფთავით გამოყოფას საჭიროებენ და აეროზოლის გადაცემის რისკი აქვთ, VialTweeter–ი პროცესებს სრულად დახურულ ვიალებსა და მიკროცენტრიფუგულ 튣ბებში ამუშავებს. დახურული 튣ბის დიზაინი გამორიცხავს ცვლადი დაბინძურების შესაძლებლობას, ხელს უშლის ნიმუშის დაკარგვას და უზრუნველყოფს მკაცრ ასეპტიკურ პირობებს ჰომოგენიზაციის და უჯრედების ლიზის პროცესში.
პროტეომიკის ნიმუშების მომზადებისთვის ოპტიმალური სონიკაციის პარამეტრები რა არის?
ბიოლოგიური ნიმუშების, მაგალითად, უჯრედებისა და ქსოვილებისათვის, რეკომენდებული პროტოკოლი იყენებს VialTweeter სონიკატორს 30% სიმძლავრით, 10 წამი ჩართვა / 10 წამი გამორთვა ციკლით, რომელიც მეორდება 3-ჯერ. პროცესირების დროს ნიმუშები უნდა იქნეს ყინულზე შენახული, ხოლო ციკლი კიდევ 2-ჯერ უნდა გაიმეოროს, თუ პროცესში მონაწილეობს ≥5 მილიონი უჯრედი. (შენიშვნა: Wojtkiewicz et al., 2021)
რა უნდა გავაკეთო, თუ ჩემი S-Trap™ კოლონა ფარავს ნიმუშის დატვირთვის დროს?
კოლონას ფარვას ჩვეულებრივ იწვევს მაღალი DNA-ის ს_viscosity ან არასაკმარისი გასუფთავება. პრობლემის მოსაგვარებლად, საფუძვლიანად სტაციონარიზეთ თქვენი ლიზატი პიპეტირებამდე და დარწმუნდით, რომ DNA საკმარისად არის დაჩეხილი სონიკაციის საშუალებით.
როგორ უპირატესად იყენებს არაკონტაქტური სონიკაცია რაოდენობრივი პროტეომასწავლებლების სამუშაო პროცესებში?
რაოდენობრივი კვლევების დროს, ნიმუშებს შორის მცირე დაბინძურებაც კი შეიძლება დაბალი კონცენტრატის პეპტიდების მაჩვენებლები შეცვალოს. VialTweeter-ის დახურული ტუბიკების, მრავალტუბიკური დამუშავება გამორიცხავს probe-ის ჩაწერას, უზრუნველყოფს პარტია-პარტიასადმი გამეორებადობას და ინარჩუნებს ნიმუშების მთლიანობას სანდო შედარებითი ანალიზისთვის.
რამდენი პროტეინის მოპოვება და MS-ის სიღრმე შემიძლია ველოდო ამ პროტოკოლით?
ადამიანის გულის ქსოვილის 50 მგ ან 5 მილიონი უჯრედით დაწყებული, S-Trap™ სამუშაო პროცესი, როგორც წესი, იძლევა საკმარის პეპტიდებს 30-50 LC-MS ინექციისთვის, თანმიმდევრულად განსაზღვრავს 4,000-ზე მეტ უნიკალურ ცილას თითო გაშვებაში. (შდრ. Wojtkiewicz et al., 2021)
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics აწვდის მძლავრ უკონტაქტო სონიკატორებს ნიმუშის მომზადებისა და კლინიკური ანალიზისთვის. მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn და GDmini2 ნაკადის სონიკატორი ამუშავებენ ნიმუშებს მათთან შეხების გარეშე.