პროტეომიკის პროტოკოლი: არაკონტაქტური ულტრაბგერითი დამუშავება აუმჯობესებს პეპტიდების ნიმუშების მომზადებას MS-ისთვის

ქვედა-ზემოთ პროტეომიკა თანამედროვე ბიომარკერების აღმოჩენის, სტრუქტურული ბიოლოგიისა და კლინიკური დიაგნოსტიკის საფუძვლად იქცა. ცილების პეპტიდებად დაშლით მას-სპექტრომეტრიული (MS) ანალიზის წინ, მკვლევრებს შეუძლიათ მიაღწიონ უფრო ღრმა სეკვენციურ დაფარვას და უფრო საიმედო რაოდენობრივ შეფასებას. თუმცა, მაღალი სირთულის ბიოლოგიური ნიმუშების მომზადება MS-ისთვის ტექნიკურად რთული რჩება. ბოლოდროინდელმა მეთოდოლოგიურმა პროგრესებმა აჩვენა, თუ როგორ შეიძლება კონტროლირებადმა ულტრაბგერითმა დამუშავებამ – კერძოდ, არაკონტაქტური VialTweeter მრავალტუბიანი სონიკატორისა და UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორის გამოყენებით – მნიშვნელოვნად გაამარტივოს ეს სამუშაო პროცესი, გააუმჯობესოს გამეორებადობა და თავიდან აიცილოს ხელსაწყოების ფართოდ გავრცელებული შეფერხებები.
იპოვეთ დეტალური ნიმუშების მომზადების პროტოკოლი MS-ით ანალიზისთვის შესაბამისი ზომის პეპტიდების მისაღებად.

ვინ უნდა იყენებდეს არაკონტაქტურ ულტრაბგერით დამუშავებას პეპტიდების ნიმუშების მომზადებისთვის?

• ქვედა-ზემოთ პროტეომიკისა და აღმოჩენის ლაბორატორიები: მკვლევრები, რომლებიც ამზადებენ მაღალი სირთულის ნიმუშებს LC-MS ან MALDI სამუშაო პროცესებისთვის და საჭიროებენ მუდმივ, მაღალი გამოსავლიანობის პეპტიდების რეკუპერაციას სხვადასხვა ბიოლოგიურ მატრიცებში.
• S-Trap™ და სუსპენზიური დაჭერის მომხმარებლები: გუნდები, რომლებიც ეყრდნობიან მიკროკოლონების გასუფთავებას და საჭიროებენ კონტროლირებად დნმ-ის ძვრას კოლონების გაჭედვის თავიდან ასაცილებლად და ნიმუშების თანაბარი დატვირთვისა და დაშლის უზრუნველსაყოფად.
• კლინიკური და ტრანსლაციური კვლევების ჯგუფები: ლაბორატორიები, რომლებიც ამუშავებენ ქსოვილს, უჯრედებს, პლაზმას, სერუმს ან ცერებროსპინალურ სითხეს, სადაც პარტიებს შორის გამეორებადობა და ნიმუშების მთლიანობა კრიტიკულია.
• რაოდენობრივი და მიზნობრივი MS გუნდები: ლაბორატორიები, რომლებიც აწარმოებენ მკაცრ შედარებით კვლევებს, სადაც სონიკატორის პრობები იწვევს ჯვარედინი კონტამინაციის რისკებს, რაც შეიძლება დაამციროს დაბალი აბუნდანტობის პეპტიდების რაოდენობრივი შეფასება.
• ცენტრალური ინსტიტუციები და მაღალი გამტარუნარიანობის ოპერაციები: ჯგუფები, რომლებიც ერთდროულად ამუშავებენ მრავალ ბიოლოგიურ რეპლიკატს და სარგებლობენ დახურული ტუბების, მრავალტუბიანი ბლოკის ულტრაბგერითი დამუშავებით VialTweeter-ის გამოყენებით, რაც აღმოფხვრის პრობის გაწმენდის საჭიროებას, ამცირებს ხელით შესრულებული დროს და ინარჩუნებს ანტისეპტიკურ პირობებს.
• PTM და სტრუქტურული ცილების მკვლევრები: მკვლევრები, რომლებსაც სჭირდებათ ნაზი, ტემპერატურაზე კონტროლირებადი დამუშავება ლაბილური მოდიფიკაციების შესანარჩუნებლად და სეკვენციური დაფარვის მაქსიმიზაციისთვის უჯრედების ლიზისა და ჰომოგენიზაციის დროს.

პროტოკოლის მიმოხილვა: ქსოვილიდან და უჯრედებიდან MS-ისთვის მზა პეპტიდებამდე

ფართოდ მიღებული ქვედა-ზემოთ პროტეომიკის სამუშაო პროცესი, რომელიც შეიმუშავა Wojtkiewicz et al.-მა, უზრუნველყოფს მყარ, მასშტაბირებად მეთოდს პეპტიდების ნიმუშების მომზადებისთვის სხვადასხვა ბიოლოგიური მატრიციდან. დაწყებით 50–100 მგ გაყინული ქსოვილის ან 1–20 მილიონი უჯრედის, პროტოკოლი აინტეგრირებს სუსპენზიური დაჭერის (S-Trap™) ტექნოლოგიას დეტერგენტების, მარილებისა და კონტამინანტების ეფექტურად მოსაცილებლად ფერმენტული დაშლის წინ.
ლიზის, ცილების რაოდენობრივი შეფასების, რედუქციისა და ალკილირების შემდეგ, ნიმუში აციდურდება და იტვირთება S-Trap™ სპინ კოლონაზე, სადაც ხდება ტრიფსინ/ლიზC დაშლა. მიღებული პეპტიდები ელუირდება, შრება და ექვემდებარება LC-MS ანალიზს. როდესაც გამოიყენება 50 მგ ადამიანის გულის ქსოვილი, ეს სამუშაო პროცესი მუდმივად იძლევა საკმარის პეპტიდებს 30–40 ინექციისთვის, იდენტიფიცირებს 4 000-ზე მეტ უნიკალურ ცილას თითოეული გაშვებისას. მიუხედავად იმისა, რომ ქიმია და კოლონაზე დაფუძნებული გასუფთავება კარგად არის განსაზღვრული, პროცესის წარმატება მნიშვნელოვნად არის დამოკიდებული საწყის ფიზიკურ დისრუფციასა და დნმ-ის მართვის ეტაპებზე.
პროტოკოლი გთავაზობთ VialTweeter მრავალტუბიანი სონიკატორის გამოყენებას უჯრედების ლიზისა და დნმ-ის ძვრისთვის – ორივე ეტაპი კრიტიკულია პეპტიდების ანალიზისთვის.

ულტრაბგერითი უჯრედული და ქსოვილოვანი ლიზი ცილების ექსტრაქციისთვის

ქვედა-ზემოთ პროტეომიკის სამუშაო ნაკვეთში, ულტრაბგერითი დამუშავება არის გადამწყვეტი ეტაპი უჯრედული ნიმუშების ლიზისთვის ცილების ამოსაღებად შემდგომი მას-სპექტრომეტრიული ანალიზისთვის. SDS უჯრედული ლიზის ბუფერის დამატების შემდეგ უჯრედული ნალექში, ნიმუშები დამუშავდება ულტრაბგერითად VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ის გამოყენებით. პროტოკოლი იყენებს 1,5 mL მიკროცენტრიფუგის ტუბებს და განსაზღვრავს სონიკატორის გაშვებას 30% სიმძლავრეზე 10 წამი ჩართულ მდგომარეობაში და 10 წამი გამორთულ მდგომარეობაში, გამეორებული 3 ციკლის განმავლობაში. 1 წუთის ლოდინის შემდეგ, ციკლი კიდევ ორჯერ მეორდება. ნიმუშები მუდმივად მაცივდება ყინულით.
ეს პროცესი არა მხოლოდ უწყობს ხელს უჯრედების დესტრუქციას, არამედ სპეციფიკურად აუცილებელია ლიზის დროს გამოთავისუფლებული გენომური დნმ-ის დასაშლელად. ეფექტური დნმ-ის დაშლა კრიტიკულია ნიმუშის სიბლანტის შესამცირებლად და S-Trap™ კოლონების გაჭედვის თავიდან ასაცილებლად, რითაც უზრუნველყოფს ცილების ოპტიმალურ აღდგენას და საიმედო შემდგომ პეპტიდურ დიგესტიას.

ულტრაბგერითი დნმ-ის დაშლის გადამწყვეტი როლი

S-Trap™-ზე დაფუძნებულ სამუშაო პროცესებში ერთ-ერთი ყველაზე ხშირი შეფერხებაა კოლონის გაჭედვა, რაც თითქმის მხოლოდ უჯრედული ან ქსოვილოვანი ჰომოგენიზაციის დროს გამოთავისუფლებული მაღალმოლეკულური გენომური დნმ-ით არის გამოწვეული. მთლიანი დნმ მკვეთრად ზრდის ნიმუშის სიბლანტეს, იჭერს პეპტიდებს და ბლოკავს მიკროფოროვან S-Trap™ სორბენტურ ფენას.
ულტრაბგერითი დამუშავება ამ პრობლემას მოგვარებს დნმ-ის მექანიკურად დაშლით მცირე, ხსნად ფრაგმენტებად. კონტროლირებადი აკუსტიკური ენერგიის გამოყენებით, VialTweeter ეფექტურად შლის ნუკლეინის მჟავებს ზედმეტი სითბოს გენერირების ან გარე კონტამინანტების შეყვანის გარეშე. ეს სიბლანტის შემცირება უზრუნველყოფს ნიმუშის თანაბარ ჩატვირთვას, მუდმივ გამავალი ნაკადის სიჩქარეს და დიგესტიის კინეტიკის შეუფერხებლობას.

ოპტიმიზებული VialTweeter სონიკაციის პარამეტრები

პროტოკოლი განსაზღვრავს მაღალ რეპროდუქციულ სონიკაციის რეჟიმს, რომელიც ოპტიმიზებულია ბიოლოგიური ნიმუშების მთლიანობისა და შემდგომი MS-თან თავსებადობისთვის. 1,5mL მიკროცენტრიფუგის ტუბებში ნიმუშისთვის Hielscher VialTweeter არაკონტაქტური ბლოკ-სონიკატორის გამოყენებით, შემდეგი პარამეტრები უზრუნველყოფენ ლიზისა და ოპტიმალურ დნმ-ის დაშლას ცილოვანი სტრუქტურის შენარჩუნებით:

• ამპლიტუდა: 30% სიმძლავრე
• ციკლის რეჟიმი: 10 წამი ჩართული / 10 წამი გამორთული
• ხანგრძლივობა: 3 ციკლი (10წმ ჩართული/10წმ გამორთული) → 1-წუთიანი დასვენება ყინულზე → გამეორება კიდევ 2-ჯერ
• ტემპერატურის მართვა: ნიმუშები დამუშავების დროს ყინულზე ინახება თერმული დენატურაციისა და ნაადრევი ფერმენტული აქტივობის თავიდან ასაცილებლად

ეს იმპულსური სონიკაციის მიდგომა თავიდან იცილებს ლოკალურ გადახურებას, ამცირებს პეპტიდების ჟანგვას და უზრუნველყოფს თანაბარ აკუსტიკურ ექსპოზიციას ყველა ვიალში. დახურული ტუბის კონფიგურაცია ასევე აღმოფხვრის პრობის გასუფთავების საჭიროებას ნიმუშებს შორის, რაც მკვეთრად ამცირებს ხელით შესრულებული სამუშაოს დროს და ოპერატორის ცვალებადობას.

ძირითადი უპირატესობები თანამედროვე პროტეომიკის სამუშაო ნაკვეთებისთვის

VialTweeter-ის ინტეგრაცია თქვენს ქვედა-ზემოთ პროტეომიკის პაიპლაინში გთავაზობთ რამდენიმე ოპერაციულ და სამეცნიერო სარგებელს:

1. მუდმივი დნმ-ის ფრაგმენტაცია: თანაბარი აკუსტიკური ენერგიის მიწოდება ყველა ვიალში უზრუნველყოფს რეპროდუქციულ სიბლანტის შემცირებას და თავიდან იცილებს პარტიებს შორის ცვალებადობას S-Trap™ ჩატვირთვისას.
2. ლაბილური მოდიფიკაციების შენარჩუნება: დაბალტემპერატურული დამუშავება ყინულის აბაზანაში იცავს ტრანსლაციის შემდგომ მოდიფიკაციებს (PTMs) და თავიდან იცილებს სითბოთი გამოწვეულ ცილოვან აგრეგაციას უჯრედული ლიზის დროს.
3. გამარტივებული შემდგომი დამუშავება: VialTweeter-ით დამუშავებული ლიზატები შეიძლება პირდაპირ გაიწმინდოს ცენტრიფუგირებით და გაიზომოს დამატებითი გასუფთავების ეტაპების გარეშე, რაც აჩქარებს გზას S-Trap™ დიგესტიისკენ.
4. მასშტაბირებადობა და მოქნილობა: იგივე სონიკაციის პარამეტრები ვრცელდება როგორც მაღალკომპლექსურ ქსოვილოვან ნიმუშებზე, ისე უჯრედულ სუსპენზიებზე, რაც უჭერს მხარს აღმოჩენით პროტეომიკას, მიზნობრივ კვანტიფიკაციას და გლიკოპროტეომიკის სამუშაო პროცესებს. Hielscher მიკროპლატის სონიკატორები საშუალებას იძლევა მარტივად გაიზარდოს ნიმუშების რაოდენობა მრავალკბილურიან პლატებზე.

ლიტერატურა / რეფერენსები

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.