გენეტიკური ტრანსფორმაცია მცენარეულ უჯრედებში ულტრაბგერის გამოყენებით
ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული ტრანსფორმაცია (SAAT) არის ეფექტური მეთოდი მცენარეული უჯრედების უცხო გენებით ინფიცირებისთვის, Agrobacterium-ის ტრანსპორტერად გამოყენებით. ულტრაბგერითი კავიტაცია იწვევს სონოპორაციას, რომელიც შეიძლება აღიწეროს, როგორც მცენარეული ქსოვილის მიზნობრივი მიკრო-დაზიანება. ამ ულტრაბგერითად შექმნილი მიკრო-დაზიანებების გავლით, DNA და DNA ვექტორები შეიძლება ეფექტურად გადავიდეს უჯრედულ მატრიცაში.
სონოპორაცია – ულტრაბგერითი გაძლიერებული უჯრედული ტრანსფორმაცია
როდესაც დაბალი სიხშირის ულტრაბგერა (დაახლოებით 20kHz) გამოიყენება უჯრედულ სუსპენზიებზე, აკუსტიკური კავიტაციის ეფექტები იწვევს მემბრანის გარდამავალ პერმეაბილიზაციას უჯრედულ ქსოვილებზე. ეს ულტრაბგერითი ეფექტი ცნობილია, როგორც სონოპორაცია და გამოიყენება გენების გადასატანად უჯრედებში ან ქსოვილებში.
ულტრაბგერითი დამუშავების უპირატესობები ეფუძნება მის არათერმულ მექანიკურ მოქმედების პრინციპს, რაც ხდის ულტრაბგერით დამუშავებას ხშირად უფრო მრავალმხრივს და ნაკლებად დამოკიდებულს უჯრედების ტიპებზე. სონოპორაციის მრავალმხრივი გამოყენება აძლევს შესაძლებლობას ტრანსგენური მცენარეების გამოყენებას, რომლებსაც აქვთ მნიშვნელოვანი პოტენციალი ადამიანის რთული თერაპიული ცილების ბიოწარმოებაში. ასეთი მცენარეული ბიორეაქტორები შეიძლება მარტივად იყოს გენეტიკურად მანიპულირებადი, ხელს უშლიან ადამიანის პათოგენებით პოტენციურ კონტამინაციას, არ აზიანებენ ტრანსფორმაციის მედიატორ ბაქტერიებს (მაგ. Agrobacterium) და წარმოადგენენ ბიოსინთეზის იაფ, ეფექტურ მეთოდს.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UP200St (200W, 26kHz) ხმის იზოლაციის კორპუსით
ულტრაბგერით დახმარებული უჯრედული ტრანსფორმაცია
ულტრაბგერითი დამუშავება არის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენებს დაბალი სიხშირის ულტრაბგერით ტალღებს ნაწილაკების აღსაძრავად ხსნარში, ხსნარების შესარევად, რითაც იზრდება მასური გადატანისა და გახსნის სიჩქარე. ამავდროულად, ულტრაბგერითი დამუშავება შეიძლება მოაშოროს გახსნილი გაზები სითხეებიდან. მცენარეულ ტრანსფორმაციაში, ულტრაბგერითი დამუშავება გამოიწვევს მიკრო-დაზიანებების წარმოქმნას მცენარეულ ქსოვილზე და გააძლიერებს შიშველი DNA-ის მიწოდებას მცენარეულ პროტოპლასტში.
გენეტიკური ტრანსფორმაციისთვის, ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული ტრანსფორმაცია (SAAT) არის პრიორიტეტული მეთოდი და აქვს მნიშვნელოვნად უფრო მაღალი ეფექტურობა, ვიდრე ულტრაბგერითი დამუშავება, რომელიც გამოიყენება შიშველი DNA-ისა და DNA ვექტორების პირდაპირ პროტოპლასტში გადასატანად. მრავალმა კვლევამ აჩვენა, რომ ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული ტრანსფორმაცია (SAAT) შეიძლება გამოყენებულ იქნას მექანიკური დარღვევისა და დაზიანებების წარმოქმნისთვის მცენარეულ უჯრედებზე ულტრაბგერითი ტალღებისა და შედეგად მიღებული აკუსტიკური კავიტაციის მეშვეობით. მოკლე ულტრაბგერითი დამუშავება ქმნის მიკრო-დაზიანებებს ექსპლანტების ზედაპირზე. რადგან დაზიანებული უჯრედები საშუალებას მისცემენ Agrobacterium-ს შეღწევას მცენარეული ქსოვილის უფრო ღრმა ნაწილებში, რითაც იზრდება მცენარეული უჯრედების ინფიცირების ალბათობა. გარდა ამისა, სეკრეტირებული ფენოლური ნაერთები აძლიერებენ ტრანსფორმაციას. ულტრაბგერითად შექმნილი მიკრო-დაზიანებები ასევე უფრო შესაძლებელს ხდის ბაქტერიების მიერ ექსპლანტებში შეღწევას. SAAT წარმატებით იქნა გამოყენებული გენეტიკური ტრანსფორმაციისთვის მცენარეთა სახეობებში, რომლებიც განსაკუთრებით მიიჩნევა Agrobacterium-ის მიმართ რეზისტენტულად.
როგორც ძალიან მარტივი და იაფი მეთოდი, ასევე Agrobacterium-ით მედიირებული გენების გადატანის მნიშვნელოვანი გაძლიერება არის SAAT-ის მთავარი უპირატესობები. Chenopodium rubrum L.-ისა და Beta vulgaris L.-ის ტრანსფორმაციაში SAAT-ის წარმატებული გამოყენების გარდა, ეს მიდგომა ასევე გამოყენებულია რეკომბინანტური Escherichia coli ველური ტიპის თერმოლაბილური ჰოლოტოქსინისა და Escherichia coli მუტანტი LT ვაქცინის ადიუვანტების წარმოებაში Nicotiana tabacum-ში, სადაც უმაღლესი სისტემური LT-B-სპეციფიკური IgG ტიტრები აღინიშნა ფრინველებში.
(იხ. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)
VialTweeter მრავალი საცდელი სინჯარის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის, მაგ. ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული ტრანსფორმაციისთვის (SAAT)
გენების გადატანის ზოგადი პროცედურა სონოპორაციის გზით მცენარეულ უჯრედებში
- გენეტიკური მასალის მომზადება: დაიწყეთ იმ გენეტიკური მასალის მომზადებით, რომლის მცენარეულ უჯრედებში შეყვანაც გსურთ. ეს შეიძლება იყოს პლაზმიდური DNA, RNA ან სხვა ნუკლეინის მჟავები.
- მცენარეული უჯრედების იზოლაცია: იზოლირეთ მცენარის უჯრედები, რომლებიც თქვენ გსურთ მიზნად დაისახოთ. თქვენი ექსპერიმენტის შესაბამისად, ეს უჯრედები შეიძლება იზოლირებული იყოს მცენარის ქსოვილებიდან ან კულტურებიდან.
- უჯრედული სუსპენზია: განათავსეთ მცენარის უჯრედები შესაბამის საშუალოში ან ბუფერში. ეს აუცილებელია იმის უზრუნველსაყოფად, რომ უჯრედები იყოს ჯანმრთელი და გენის შთანთქმისთვის ხელსაყრელ მდგომარეობაში.
- მოამზადეთ თქვენი სონიკატორი: მოამზადეთ თქვენი პრობის ტიპის სონიკატორი ულტრაბგერითი დამუშავების წინასწარი პარამეტრების დაყენებით, როგორიცაა ამპლიტუდა, დრო, ენერგია და ტემპერატურა. ჩააღრმავეთ ულტრაბგერითი პრობი უჯრედულ სუსპენზიაში.
- ულტრაბგერითი დამუშავება: დაიწყეთ ულტრაბგერითი დამუშავების პროცედურა. პრობის წვერის სწრაფი ოსცილაცია ქმნის კავიტაციის ბუშტუკებს სითხეში. ეს ბუშტუკები ფართოვდება და იშლება ულტრაბგერითი ტალღების გამო, რაც ქმნის მექანიკურ ძალებს და მიკრონაკადებს სუსპენზიაში.
- სონოპორაცია: კავიტაციით წარმოქმნილი მექანიკური ძალები და მიკრონაკადები ქმნიან დროებით პორებს და ხვრელებს მცენარის უჯრედების მემბრანებში. სუსპენზიაში არსებული გენეტიკური მასალა შეუძლია შევიდეს მცენარის უჯრედებში ამ პორების გავლით.
- ინკუბაცია: სონოპორაციის დამუშავების შემდეგ, ინკუბირეთ მცენარის უჯრედები, რათა მათ აღიდგინონ ძალები და გაამყარონ მემბრანები. ეს არის გადამწყვეტი ნაბიჯი უჯრედების გადარჩენისა და გენის წარმატებული გადატანის უზრუნველსაყოფად.
გენის გადატანა Agrobacterium-ის ან ლიპოსომების მეშვეობით
არსებობს მცენარის უჯრედების ტრანსფექციის ორი საერთო ფორმა. ისინი იყენებენ ან Agrobacterium-ს, გრამ-უარყოფითი ბაქტერიების გვარს, ან ლიპოსომებს, როგორც გენეტიკური მასალის მატარებლებს.
- Agrobacterium-ით მედირებული სონოპორაცია: Agrobacterium tumefaciens არის ბაქტერია, რომელიც ფართოდ გამოიყენება მცენარეთა გენეტიკურ ინჟინერიაში. ამ მეთოდში, სასურველ გენს შემცველი პლაზმიდური დნმ შეჰყავთ Agrobacterium-ში, რომელიც შემდეგ ერევა მცენარის უჯრედებს. უჯრედული სუსპენზია ექვემდებარება სონოპორაციას პრობის ტიპის სონიკატორის გამოყენებით. ულტრაბგერითი ენერგია აძლიერებს გენეტიკური მასალის გადატანას Agrobacterium-დან მცენარის უჯრედებში. ეს მეთოდი ფართოდ გამოიყენება მცენარეთა გენეტიკური მოდიფიკაციისთვის.
- ლიპოსომებით მედირებული სონოპორაცია: ლიპოსომები არის ლიპიდზე დაფუძნებული ვეზიკულები, რომლებსაც შეუძლიათ გადაიტანონ გენეტიკური მასალა. ამ მეთოდში, პლაზმიდური დნმ-ით ან სხვა ნუკლეინის მჟავებით დატვირთული ლიპოსომები ერევა მცენარის უჯრედებს. ლიპოსომების მცენარის უჯრედების მიერ შთანთქმის ხელშეწყობისთვის გამოიყენება სონოპორაცია პრობის ტიპის სონიკატორის მეშვეობით. ულტრაბგერა არღვევს ლიპოსომების ლიპიდურ ორშრიანებს, რითაც თავისუფლდება გენეტიკური მასალა მცენარის უჯრედებში. ეს მიდგომა სასარგებლოა მცენარის უჯრედებში გენის ტრანზიტორული ექსპრესიის კვლევებისთვის.
ულტრაბგერითი დამუშავებით Agrobacterium-ით მედირებული ტრანსფორმაციის (SAAT) სამეცნიეროდ დადასტურებული სარგებელი
ულტრაბგერითი დამუშავებით Agrobacterium-ით მედირებული ტრანსფორმაცია (SAAT) გამოყენებულია მრავალ მცენარეულ სახეობაში. მცენარის უჯრედული კულტურების მოკლე და შედარებით რბილი ულტრაბგერითი დამუშავება იწვევს სონოპორაციას, რაც შემდგომში საშუალებას აძლევს Agrobacterium-ს, როგორც გენის მატარებელს, ღრმად შეიჭრას. ქვემოთ შეგიძლიათ წაიკითხოთ მაგალითური კვლევები, რომლებიც აჩვენებს SAAT-ის სასარგებლო ეფექტებს.
სონიკატორი UP200Ht გენის ტრანსფექციისთვის სონოპორაციის მეშვეობით
ულტრაბგერითი დამუშავებით Ashwagandha-ს ტრანსფორმაცია
იმისათვის, რომ გაზარდონ ტრანსფორმაციის ეფექტურობა W. somnifera-ში (ცნობილი, როგორც ashwagandha ან ზამთრის ალუბალი), Dehdashti და მისი კოლეგები (2016) შეისწავლეს აცეტოსირინგონის (AS) და ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენება.
აცეტოსირინგონი (AS) დაემატა სამ ეტაპზე: Agrobacterium-ის თხევად კულტურაში, Agrobacterium-ის ინფექციის დროს და ექსპლანტების Agrobacterium-თან ერთად კულტივირებისას. აღმოჩნდა, რომ 75 μM AS-ის დამატება Agrobacterium-ის თხევად კულტურაში ოპტიმალურია vir გენების ინდუქციისთვის.
ულტრაბგერითი დამუშავების (SAAT) დამატებითმა გამოყენებამ უმაღლესი გენის ექსპრესია გამოიწვია. აღმოჩნდა, რომ gusA გენის ექსპრესია თმიან ფესვებში საუკეთესო იყო, როდესაც ფოთლები და ღეროს წვერები შესაბამისად 10 და 20s-ის განმავლობაში იყო დამუშავებული ულტრაბგერით. გაუმჯობესებული პროტოკოლის გენეტიკური ტრანსფორმაციის ეფექტურობა შეადგენდა 66,5% და 59,5% შესაბამისად ფოთლის და ღეროს წვერის ექსპლანტების შემთხვევაში. სხვა პროტოკოლებთან შედარებით, აღმოჩნდა, რომ ამ გაუმჯობესებული პროტოკოლის გენეტიკური ტრანსფორმაციის ეფექტურობა 2,5-ჯერ უფრო მაღალი იყო ფოთლებისთვის და 3,7-ჯერ მეტი ღეროს წვერებისთვის. Southern blot ანალიზებმა დაადასტურა gusA ტრანსგენის 1–2 კოპია W1-W4 ხაზებში, ხოლო 1–4 ტრანსგენის კოპია აღმოჩენილი იყო W5 ხაზში, რომელიც მიღებული იყო გაუმჯობესებული პროტოკოლით.
ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული გენეტიკური ტრანსფორმაციის (SAAT) ხანგრძლივობის გავლენა W. somnifera-ს ფოთლის (a) და ღეროს წვერის (b) ექსპლანტების გენეტიკური ტრანსფორმაციის სიხშირეზე
(კვლევა და გრაფიკა: © Dehdashti et al., 2016)
UP200St პრობის ტიპის ჰომოგენიზატორი სონოპორაციისა და გენის ტრანსფექციისთვის
ულტრაბგერითი დახმარებით ბამბის გენეტიკური ტრანსფორმაცია
Hussain et al. (2007) აჩვენებენ ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული ბამბის გენეტიკური ტრანსფორმაციის სასარგებლო ეფექტებს. დაბალი სიხშირის ულტრაბგერით გამოწვეული აკუსტიკური კავიტაცია ქმნის მიკრო-დაზიანებებს მცენარის ქსოვილის ზედაპირზე და მის ქვეშ (სონოპორაცია) და საშუალებას აძლევს Agrobacterium-ს უფრო ღრმად და სრულად გავრცელდეს მცენარის ქსოვილში. ეს დაზიანების ფორმა ზრდის ქსოვილის უფრო ღრმად მდებარე მცენარის უჯრედების ინფიცირების სავარაუდოობას. SAAT-ის გენეტიკური ტრანსფორმაციის ეფექტურობის შესაფასებლად, გაიზომა GUS გენის ექსპრესია. GUS რეპორტული სისტემა არის რეპორტული გენის სისტემა, რომელიც განსაკუთრებით სასარგებლოა მცენარეთა მოლეკულურ ბიოლოგიასა და მიკრობიოლოგიაში. სხვადასხვა SAAT პარამეტრების კორექტირებით, GUS ტრანზიტორული ექსპრესია ბამბაში, მწიფე ემბრიონების ექსპლანტებად გამოყენებით, მნიშვნელოვნად გაიზარდა. GUS პირველად აღმოჩენილი იყო ექსპლანტების ინკუბაციიდან 24 საათის შემდეგ, ხოლო 48 საათისთვის GUS ექსპრესია იყო ძალიან ინტენსიური, რაც წარმოადგენდა სასარგებლო ინდიკატორს ბამბის ექსპლანტის წარმატებული გენეტიკური ტრანსფორმაციისა ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული გენეტიკური ტრანსფორმაციის (SAAT) შემდეგ. სხვადასხვა გენეტიკური ტრანსფორმაციის ტექნიკების (კერძოდ, ბიოლისტიკური, Agro, BAAT, SAAT) შედარებით, ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებულმა Agrobacterium-ით მედიირებულმა გენეტიკურმა ტრანსფორმაციამ (SAAT) ბევრად საუკეთესო შედეგები აჩვენა.
გენეტიკური ტრანსფორმაციის პროცედურის არჩევანი GUS-ის ტრანზიტორული ექსპრესიის საფუძველზე. ულტრაბგერითი დამუშავებით დახმარებული Agrobacterium-ით მედიირებული გენეტიკური ტრანსფორმაცია (SAAT) აჩვენებს მნიშვნელოვნად უფრო მაღალ ტრანზიტორულ ექსპრესიას.
(კვლევა და გრაფიკა: © Hussain et al., 2007)
მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი გადაწყვეტილებები სონოპორაციისა და SAAT-ისთვის
Hielscher Ultrasonics-ს აქვს მრავალწლიანი გამოცდილება მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების შექმნისა და წარმოების სფეროში, ლაბორატორიებისთვის, სამეცნიერო-კვლევითი დაწესებულებებისთვის, ასევე ინდუსტრიული წარმოებისთვის, რომელიც მოითხოვს ძალიან მაღალ გამტარუნარიანობას. მიკრობიოლოგიისა და სიცოცხლის მეცნიერებებისთვის Hielscher სთავაზობს სხვადასხვა გადაწყვეტილებებს, რომლებიც აკმაყოფილებენ სპეციფიკური ქსოვილებისა და მათი დამუშავებისთვის აუცილებელ სხვადასხვა მოთხოვნებს. მრავალი ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის Hielscher სთავაზობს UIP400MTP-ს მრავალკაპიანი თეფშებისთვის, VialTweeter-ს 10-მდე ვიალის (მაგ., Eppendorf-ის სინჯარების) ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის ან ულტრაბგერით CupHorn-ს. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების სიმძლავრე მერყეობს 50-დან 400 ვატამდე ლაბორატორიული ჰომოგენიზატორებისთვის და 500 ვატიდან 16kW-მდე ინდუსტრიული სისტემებისთვის.
გთხოვთ, დაგვიკავშირდეთ და გვითხარით თქვენი გამოყენებისა და პროცესის მოთხოვნების შესახებ. ჩვენი მაღალკვალიფიციური პერსონალი სიამოვნებით დაგირჩევთ ყველაზე შესაფერის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორს თქვენი ბიოლოგიური პროცესისთვის.
ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაძლევთ წარმოდგენას ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების დაახლოებით დამუშავების გამტარუნარიანობაზე:
| პარტიის მოცულობა | მოცულობითი ხარჯი | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| მრავალკაპიანი / მიკროტიტრაციული თეფშები | n.a. | UIP400MTP |
| 10-მდე ვიალი | n.a. | VialTweeter |
| 5-მდე ვიალი/სინჯარა ან 1 უფრო დიდი ჭურჭელი | n.a. | CupHorn |
| 1-დან 500mL-მდე | 10-დან 200mL/min-მდე | UP100H |
| 10-დან 2000mL-მდე | 20-დან 400mL/min-მდე | UP200Ht, UP400St |
| 0,1-დან 20L-მდე | 0,2-დან 4L/min-მდე | UIP2000hdT |
| 10-დან 100L-მდე | 2-დან 10L/min-მდე | UIP4000hdT |
| n.a. | 10-დან 100L/min-მდე | UIP16000 |
| n.a. | უფრო დიდი | ჯგუფი UIP16000 |
დაგვიკავშირდით! / დაგვისვით!
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს შერევის, დისპერგირების, ემულსირებისა და ექსტრაქციისთვის ლაბორატორიულ, საცდელ და ინდუსტრიულ მასშტაბებზე.
ლიტერატურა / რეფერენსები
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს ლაბორატორიული დან ინდუსტრიული მასშტაბის.