გენეტიკური ტრანსფორმაცია მცენარეთა უჯრედებში ულტრაბგერითი გამოყენებით

Agrobacterium-ის შუამავლობით ტრანსფორმაცია (SAAT) არის ეფექტური მეთოდი მცენარეთა უჯრედების უცხო გენებით დაინფიცირებისთვის აგრობაქტერიის, როგორც გადამტანის გამოყენებით. ულტრაბგერითი კავიტაცია იწვევს სონოპორაციას, რაც შეიძლება შეფასდეს, როგორც მცენარის ქსოვილის მიზანმიმართული მიკრო ჭრილობა. ამ ულტრაბგერითი შექმნილი მიკრო ჭრილობების მეშვეობით, დნმ და დნმ ვექტორები შეიძლება ეფექტურად გადაიტანონ უჯრედის მატრიქსში.

სონოპორაცია – ულტრაბგერითი გაძლიერებული უჯრედის ტრანსფორმაცია

როდესაც დაბალი სიხშირის ულტრაბგერა (დაახლოებით 20 კჰც) გამოიყენება უჯრედის სუსპენზიებზე, აკუსტიკური კავიტაციის ეფექტი იწვევს უჯრედულ ქსოვილებზე მემბრანის გარდამავალ გამტარიანობას. ეს ულტრაბგერითი ეფექტი ცნობილია როგორც სონოპორაცია და გამოიყენება უჯრედებში ან ქსოვილებში გენის გადასატანად.
ულტრაბგერითი მოქმედების უპირატესობები დაფუძნებულია მის არათერმული მექანიკური მუშაობის პრინციპზე, რაც ხდის სონიფიკაციას ხშირად უფრო მრავალმხრივს და ნაკლებად დამოკიდებულს უჯრედების ტიპებზე. სონოპორაციის მრავალმხრივი გამოყენება ხსნის ტრანსგენური მცენარეების გამოყენების შესაძლებლობას, რომლებსაც აქვთ მნიშვნელოვანი პოტენციალი ადამიანის რთული თერაპიული ცილების ბიოწარმოებაში. ასეთი მცენარეული ბიორეაქტორები შეიძლება ადვილად იყოს გენეტიკურად მანიპულირებული, თავიდან აიცილონ ადამიანის პათოგენებით პოტენციური დაბინძურება, არ დააზიანოს ტრანსფორმაციის შუამავალი ბაქტერიები (მაგ. აგრობაქტერია) და წარმოადგენს ბიოსინთეზის იაფ, ეფექტურ მეთოდს.

უჯრედების ტრანსფორმაცია ულტრაბგერითი დახმარებით

Sonication არის ტექნიკა, რომელიც იყენებს დაბალი სიხშირის ულტრაბგერითი ტალღებს ნაწილაკების ხსნარში აჟიტირებისთვის, ხსნარების შერევისთვის, რითაც ზრდის მასის გადაცემის და დაშლის სიჩქარეს. ამავდროულად, გაჟღენთვას შეუძლია გახსნილი აირები სითხეებიდან ამოიღოს. მცენარის ტრანსფორმაციისას, ხმოვანი გამოსხივება გამოიწვევს მცენარის ქსოვილზე მიკროჭრილობების წარმოქმნას და აძლიერებს შიშველი დნმ-ის მიწოდებას მცენარის პროტოპლასტში.

გენეტიკური ტრანსფორმაციისთვის, Agrobacterium-ის შუამავლობით გაჟღენთილი ტრანსფორმაცია (SAAT) არის სასურველი მეთოდი და აქვს ბევრად უფრო მაღალი ეფექტურობა, ვიდრე სონიკა, რომელიც გამოიყენება შიშველი დნმ-ის და დნმ ვექტორების პირდაპირ პროტოპლასტში გადასატანად. მრავალრიცხოვანმა კვლევებმა აჩვენა, რომ აგრობაქტერიის შუამავლობით გამოწვეული ტრანსფორმაცია (SAAT) შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცენარეთა უჯრედებზე მექანიკური შეფერხების და ჭრილობების წარმოქმნის მიზნით ულტრაბგერითი ტალღებით და შედეგად მიღებული აკუსტიკური კავიტაცია. მოკლე ულტრაბგერითი მკურნალობა ქმნის მიკრო ჭრილობებს ექსპლანტანტების ზედაპირზე. ვინაიდან დაჭრილი უჯრედები საშუალებას მისცემს აგრობაქტერიის შეღწევას მცენარის ქსოვილების ღრმა ნაწილში, რითაც გაიზრდება მცენარის უჯრედების ინფიცირების ალბათობა. გარდა ამისა, გამოყოფილი ფენოლური ნაერთები აძლიერებენ ტრანსფორმაციას. ულტრაბგერითი წარმოქმნილი მიკრო ჭრილობები ასევე უფრო შესაძლებელს ხდის ბაქტერიების მიერ ექსპლანტაციის შეღწევას. SAAT წარმატებით გამოიყენებოდა გენეტიკური ტრანსფორმაციისთვის მცენარეთა სახეობებში, რომლებიც განსაკუთრებით რეზისტენტული იყო აგრობაქტერიის მიმართ.
როგორც ძალიან მარტივი და იაფი მეთოდი, ასევე აგრობაქტერიის შუამავლობით გენის გადაცემის მნიშვნელოვანი გაძლიერება SAAT-ის მთავარი უპირატესობაა. გარდა SAAT-ის წარმატებული გამოყენებისა Chenopodium rubrum L. და Beta vulgaris L.-ის ტრანსფორმაციაში, ეს მიდგომა ასევე გამოყენებულია რეკომბინანტული Escherichia coli ველური ტიპის სითბოსადმი მდგრადი ჰოლოტოქსინის და Escherichia coli მუტანტის LT ვაქცინის ადიუვანტების წარმოებაში Nicotiana tabacum-ში. , რომელშიც ყველაზე მაღალი სისტემური LT-B-სპეციფიკური IgG ტიტრები გამოვლინდა ფრინველებში.
(შდრ. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

მცენარეთა უჯრედებში სონოპორაციის მეშვეობით გენის გადაცემის ზოგადი პროცედურა

1. გენეტიკური მასალის მომზადება: დაიწყეთ გენეტიკური მასალის მომზადებით, რომლის შეტანა გსურთ მცენარეულ უჯრედებში. ეს შეიძლება იყოს პლაზმიდური დნმ, რნმ ან სხვა ნუკლეინის მჟავები.
2. მცენარეული უჯრედების იზოლაცია: გამოყავით მცენარის უჯრედები, რომელთა მიზანმიმართვაც გსურთ. თქვენი ექსპერიმენტიდან გამომდინარე, ეს უჯრედები შეიძლება იზოლირებული იყოს მცენარის ქსოვილებიდან ან კულტურებიდან.
3. უჯრედის სუსპენზია: შეაჩერეთ მცენარეული უჯრედები შესაფერის გარემოში ან ბუფერში. ეს აუცილებელია იმის უზრუნველსაყოფად, რომ უჯრედები იყოს ჯანსაღი და გენის ათვისებისთვის ხელსაყრელ მდგომარეობაში.
4. დააყენეთ თქვენი Sonicator: მოამზადეთ თქვენი ზონდის ტიპის სონიკატორი სონიკაციით წინასწარ დაყენებული პარამეტრებით, როგორიცაა ამპლიტუდა, დრო, ენერგია და ტემპერატურა. ჩაყარეთ ულტრაბგერითი ზონდი უჯრედის სუსპენზიაში.
5. Sonication: დაიწყეთ გაჟონვის პროცედურა. ზონდის წვერის სწრაფი რხევა წარმოქმნის კავიტაციის ბუშტებს სითხეში. ეს ბუშტები ფართოვდება და იშლება ულტრაბგერითი ტალღების გამო, ქმნიან მექანიკურ ძალებს და მიკრონაკადს სუსპენზიაში.
6. სონოპორაცია: კავიტაციის შედეგად წარმოქმნილი მექანიკური ძალები და მიკროსტრიმინგები ქმნის დროებით ფორებს და ხვრელებს მცენარეთა უჯრედების მემბრანებში. სუსპენზიაში არსებულ გენეტიკურ მასალას შეუძლია ამ ფორების მეშვეობით მცენარის უჯრედებში შეღწევა.
7. ინკუბაცია: სონოპორაციის მკურნალობის შემდეგ, ჩაატარეთ მცენარის უჯრედების ინკუბაცია, რათა მათ აღადგინონ და დაამყარონ გარსები. ეს არის გადამწყვეტი ნაბიჯი უჯრედების გადარჩენისა და წარმატებული გენის გადაცემის უზრუნველსაყოფად.

გენის გადაცემა აგრობაქტერიის ან ლიპოსომის მეშვეობით

მცენარეული უჯრედის ტრანსფექტის ორი გავრცელებული ფორმა არსებობს. ისინი იყენებენ აგრობაქტერიუმს, გრამუარყოფითი ბაქტერიების გვარს, ან ლიპოსომებს, როგორც გენეტიკური მასალის გადამტანად.

• აგრობაქტერიის შუამავლობით სონოპორაცია: Agrobacterium tumefaciens არის ბაქტერია, რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება მცენარეთა გენეტიკურ ინჟინერიაში. ამ მეთოდით სასურველი გენის შემცველი პლაზმიდური დნმ შეჰყავთ აგრობაქტერიუმში, რომელიც შემდეგ ურევენ მცენარეულ უჯრედებს. უჯრედის სუსპენზია ექვემდებარება სონოპორაციას ზონდის ტიპის სონიკატორის გამოყენებით. ულტრაბგერითი ენერგია აძლიერებს გენეტიკური მასალის გადატანას აგრობაქტერიიდან მცენარეულ უჯრედებამდე. ეს მეთოდი ფართოდ გამოიყენება მცენარეთა გენეტიკური მოდიფიკაციისთვის.
• ლიპოსომა-შუამავლობით სონოპორაცია: ლიპოსომები არის ლიპიდზე დაფუძნებული ვეზიკულები, რომლებსაც შეუძლიათ გენეტიკური მასალის გადატანა. ამ მეთოდით, პლაზმიდური დნმ-ით ან სხვა ნუკლეინის მჟავებით დატვირთული ლიპოსომები შერეულია მცენარეულ უჯრედებთან. სონოპორაცია ზონდის ტიპის სონიკატორის გამოყენებით გამოიყენება მცენარეთა უჯრედების მიერ ლიპოსომების ათვისების გასაადვილებლად. ულტრაბგერითი არღვევს ლიპოსომების ლიპიდურ ორ ფენებს, ათავისუფლებს გენეტიკურ მასალას მცენარეულ უჯრედებში. ეს მიდგომა სასარგებლოა მცენარეთა უჯრედებში გენის ექსპრესიის გარდამავალი კვლევებისთვის.

მეცნიერულად დადასტურებული სარგებელი Sonication-ის დახმარებით Agrobacterium Mediamediate Transformation (SAAT)

Agrobacterium-ის შუამავლობით ტრანსფორმაცია (SAAT) გამოყენებული იქნა მცენარეთა მრავალ სახეობაში. მცენარეთა უჯრედების კულტურების მოკლე და შედარებით რბილი ულტრაბგერითი მკურნალობა იწვევს სონოპორაციას, რაც შემდგომში აგრობაქტერიის, როგორც გენის გადამტანის, ღრმა შეღწევის საშუალებას იძლევა. ქვემოთ შეგიძლიათ წაიკითხოთ სანიმუშო კვლევები, რომლებიც აჩვენებენ SAAT-ის სასარგებლო ეფექტებს.

აშვაგანდას ტრანსფორმაცია ულტრაბგერითი დახმარებით

W. somnifera-ში ტრანსფორმაციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად (ცნობილი როგორც აშვაგანდა ან ზამთრის ალუბალი), დეჰდაშტიმ და კოლეგებმა (2016) გამოიკვლიეს აცეტოსირინგონის (AS) და სონიკაციის გამოყენება.
აცეტოსირინგონი (AS) დაემატა სამ ეტაპად: აგრობაქტერიუმის თხევადი კულტურა, აგრობაქტერიული ინფექცია და ექსპლანტანტების თანაკულტივირება აგრობაქტერიუმთან. Agrobacterium-ის თხევად კულტურაში 75 μM AS-ის დამატება აღმოჩნდა ოპტიმალური ვირ გენების ინდუქციისთვის.
sonication-ის (SAAT) დამატებით გამოყენებამ გამოიწვია გენის ყველაზე მაღალი ექსპრესია. აღმოჩნდა, რომ gusA გენის გამოხატულება თმიან ფესვებში იყო საუკეთესო, როდესაც ფოთლები და ყლორტების წვერები ხდებოდა 10 და 20 წამის განმავლობაში, შესაბამისად. გაუმჯობესებული პროტოკოლის ტრანსფორმაციის ეფექტურობა დაფიქსირდა 66,5 და 59,5% ფოთლისა და ყლორტის წვერის ექსპლანტანტების შემთხვევაში, შესაბამისად. სხვა პროტოკოლებთან შედარებით, ამ გაუმჯობესებული პროტოკოლის ტრანსფორმაციის ეფექტურობა აღმოჩნდა 2,5-ჯერ მეტი ფოთლებისთვის და 3,7-ჯერ მეტი გასროლის წვეროებისთვის. Southern blot ანალიზმა დაადასტურა gusA ტრანსგენის 1-2 ასლი W1-W4 ხაზებში, ხოლო 1-4 ტრანსგენის ასლი გამოვლინდა გაუმჯობესებული პროტოკოლით გენერირებული W5 ხაზში.

ბგერითი დახმარებით აგრობაქტერიული ტრანსფორმაციის (SAAT) ხანგრძლივობის ეფექტი W. somnifera ფოთლის (a) და ყლორტის წვერის (b) ექსპლანტაციის ტრანსფორმაციის სიხშირეზე
(კვლევა და გრაფიკა: © დეჰდაშტი და სხვ., 2016)

ბამბის ტრანსფორმაცია ულტრაბგერითი დახმარებით

ჰუსეინი და სხვ. (2007) აჩვენეთ ბამბის ტრანსფორმაციის გახმოვანებით დამხმარე ეფექტების დემონსტრირება. დაბალი სიხშირის ულტრაბგერით გამოწვეული აკუსტიკური კავიტაცია ქმნის მიკროჭრილობებს მცენარის ქსოვილის ზედაპირზე და მის ქვემოთ (სონოპორაცია) და საშუალებას აძლევს აგრობაქტერიუმს უფრო ღრმად და მთლიანად იმოგზაუროს მცენარის ქსოვილში. ეს ჭრილობა ზრდის ქსოვილებში ღრმად მოთავსებული მცენარეული უჯრედების დაინფიცირების ალბათობას. SAAT-ის ტრანსფორმაციის ეფექტურობის შესაფასებლად, გაზომეს GUS გენის ექსპრესია. GUS-ის მომხსენებელი სისტემა არის მომხსენებელი გენის სისტემა, განსაკუთრებით სასარგებლო მცენარეთა მოლეკულურ ბიოლოგიასა და მიკრობიოლოგიაში. სხვადასხვა SAAT პარამეტრების კორექტირებით, GUS გარდამავალი გამოხატულება ბამბაში, მწიფე ემბრიონების გამოყენებით, როგორც ექსპლანტაცია, მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა. GUS პირველად გამოვლინდა ექსპლანტანტების ინკუბაციიდან 24 სთ-ში და 48 სთ-ისთვის GUS-ის გამოხატულება იყო ძალიან ინტენსიური, რაც ემსახურებოდა ბამბის ექსპლანტაციის წარმატებული ტრანსფორმაციის სასარგებლო ინდიკატორს აგრობაქტერიის შუამავლობით გაფორმებული ტრანსფორმაციის (SAAT) შემდეგ გაჟღერების დახმარებით. ტრანსფორმაციის სხვადასხვა ტექნიკის (კერძოდ, ბიოლისტიკური, აგრო, BAAT, SAAT) შედარებამ აჩვენა ტრანსფორმაციის შორს საუკეთესო შედეგები.

ტრანსფორმაციის პროცედურის არჩევანი GUS-ის გარდამავალი გამოხატვის საფუძველზე. Agrobacterium-ის შუამავლობით ტრანსფორმაცია (SAAT) ავლენს გაჟღენთილი დახმარებით.
(შესწავლა და გრაფიკა: © Hussain et al., 2007)

მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი გადაწყვეტილებები Sonoporation-ისთვის და SAAT-ისთვის

Hielscher Ultrasonics დიდი ხნის გამოცდილებაა მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი აპარატების შემუშავებასა და წარმოებაში ლაბორატორიებისთვის, კვლევითი ობიექტებისთვის, ასევე სამრეწველო წარმოებისთვის ძალიან მაღალი გამტარუნარიანობით. მიკრობიოლოგიისა და სიცოცხლის მეცნიერებისთვის, Hielscher გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტილებებს კონკრეტული ქსოვილებისა და მათი მკურნალობისთვის აუცილებელი სხვადასხვა მოთხოვნების დასაკმაყოფილებლად. მრავალი ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი გამოსაყენებლად Hielscher გთავაზობთ UIP400MTP-ს მულტიბგერითი ფირფიტებისთვის, VialTweeter-ს 10-მდე ფლაკონის (მაგ., Eppendorf მილები) ან ულტრაბგერითი CupHorn-ისთვის. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითები ხელმისაწვდომია 50-დან 400 ვატამდე, როგორც ლაბორატორიული ჰომოგენიზატორები, ხოლო სამრეწველო სისტემები მოიცავს სიმძლავრის დიაპაზონს 500 ვატიდან 16 კვტ-მდე.
გთხოვთ, დაგვიკავშირდეთ და შეგვატყობინოთ თქვენი განაცხადის და პროცესის მოთხოვნების შესახებ. ჩვენი გამოცდილი პერსონალი სიამოვნებით შემოგთავაზებთ ყველაზე შესაფერისი ულტრაბგერითი აპარატს თქვენი ბიოლოგიური პროცესისთვის.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გვიჩვენებს ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობებს: