Disintegrasi sel atau lisis adalah bagian umum dari persiapan sampel harian di laboratorium biotek. Tujuan lisis adalah untuk mengganggu bagian dinding sel atau sel lengkap untuk melepaskan molekul biologis. Homogenizers ultrasonik banyak digunakan untuk lisis sel yang sukses. Keuntungan utama dari ultrasonicators canggih adalah kontrol yang tepat atas parameter proses seperti intensitas dan suhu, yang memungkinkan untuk gangguan sel yang lembut, namun sangat efisien dan ekstraksi.

Lisis Sel menggunakan Ultrasonografi

Ultrasonic cell lysis dan ekstraksi adalah metode yang digunakan untuk memecahkan sel terbuka dan mengekstrak isinya menggunakan gelombang suara frekuensi tinggi, yaitu ultrasound. Sonikasi adalah teknik lisis, yang banyak digunakan sebagai metode gangguan sel yang mapan dan dapat diandalkan dan ekstraksi bahan intraseluler. Ultrasonic lysis adalah teknik yang dapat diandalkan untuk mempersiapkan lysate ccontaining misalnya plasmid, receptor assays, protein, DNA, RNA dll. Karena intensitas ultrasonik dapat diratakan dengan menyesuaikan parameter proses, intensitas sonikasi optimal dari sangat lembut ke intens dapat diatur secara individual untuk setiap zat dan media untuk memenuhi persyaratan aplikasi tertentu. Langkah-langkah berikut dari lisis adalah fraksinasi, isolasi organel atau / dan ekstraksi dan pemurnian protein. Bahan yang diekstraksi (= lisat) harus dipisahkan dan tunduk pada penyelidikan atau aplikasi lebih lanjut, misalnya untuk penelitian proteomik.

Dibandingkan dengan lisis sel lain dan metode ekstraksi, lisis sel ultrasonik memiliki beberapa keunggulan:

1. Kecepatan: Ultrasonic sel lisis dan ekstraksi adalah metode cepat yang dapat memecahkan sel terbuka dalam hitungan detik. Ini jauh lebih cepat daripada metode lain seperti homogenisasi, freez-thawing atau bead-milling.
2. Efisiensi: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik dapat digunakan untuk mengobati sampel kecil, besar atau ganda sekaligus, membuatnya lebih efisien daripada metode lain yang memerlukan pemrosesan individu sampel kecil.
3. Bebas bahan kimia: Ultrasonic cell lysis dan ekstraksi adalah metode non-invasif yang tidak memerlukan penggunaan bahan kimia keras atau enzim. Ini membuatnya ideal untuk aplikasi di mana integritas konten sel perlu dipertahankan. Kontaminasi sampel yang tidak diinginkan dapat dihindari.
4. Hasil tinggi: Ultrasonic sel lisis dan ekstraksi dapat mengekstrak hasil tinggi dari isi selular, termasuk DNA, RNA, dan protein. Ini karena gelombang suara frekuensi tinggi membuka dinding sel dan melepaskan isinya ke dalam larutan di sekitarnya.
5. Pengatur suhu: Ultrasonciator canggih memungkinkan kontrol suhu sampel yang tepat. Hielscher digital ultrasonic dilengkapi dengan sensor suhu pluggable dan perangkat lunak pemantauan suhu.
6. Direproduksi: Protokol untuk lisis sel ultrasonik dapat dengan mudah direproduksi dan bahkan dicocokkan dengan volume sampel yang lebih besar atau lebih kecil dengan scale-up linier sederhana.
7. Serbaguna: Ultrasonic sel lisis dan ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak berbagai jenis sel, termasuk bakteri, ragi, jamur, tanaman dan sel mamalia. Ini juga dapat digunakan untuk mengekstrak berbagai jenis molekul, termasuk protein, DNA, RNA, dan lipid.
8. Persiapan simultan dari banyak sampel: Hielscher Ultrasonics menawarkan beberapa solusi untuk memproses banyak sampel dengan nyaman di bawah kondisi proses yang persis sama. Hal ini membuat langkah persiapan sampel lisis dan ekstraksi sangat efisien dan hemat waktu.
9. Mudah digunakan: Ultrasonic cell lysis dan peralatan ekstraksi mudah digunakan dan membutuhkan pelatihan minimal. Peralatan ini juga ekonomis karena merupakan investasi tunggal tanpa persyaratan untuk pembelian kembali pembuangan. Ini membuatnya menarik bagi berbagai peneliti dan laboratorium.

Secara keseluruhan, lisis dan ekstraksi sel ultrasonik adalah metode yang cepat, efisien, dapat dikontrol dengan tepat, dan serbaguna untuk mengekstraksi konten seluler. Keuntungannya dibandingkan metode alternatif menjadikannya pilihan yang menarik untuk berbagai penelitian dan aplikasi industri.

Prinsip Kerja Ultrasonic Cell Lysis

Ultrasonic sel lisis dan ekstraksi menggunakan gelombang suara frekuensi tinggi untuk mengganggu sel dan mengekstrak isinya. Gelombang suara menciptakan perubahan tekanan pada cairan di sekitarnya, menyebabkan gelembung kecil terbentuk dan runtuh dalam proses yang dikenal sebagai kavitasi. Gelembung-gelembung ini menghasilkan kekuatan mekanik lokal yang sangat intens yang dapat memecah sel-sel terbuka dan melepaskan isinya ke dalam larutan di sekitarnya.

Lisis sel menggunakan ultrasonicator biasanya melibatkan langkah-langkah berikut:

• Sampel ditempatkan dalam tabung atau wadah dengan buffer cair.
• Probe ultrasonik dimasukkan ke dalam sampel, dan gelombang suara frekuensi tinggi dengan sekitar 20-30 kHz diterapkan.
• Gelombang ultrasound menyebabkan osilasi dan kavitasi dalam cairan di sekitarnya, menghasilkan kekuatan lokal yang memecah sel terbuka dan melepaskan isinya.
• Sampel disentrifugasi atau disaring untuk menghilangkan puing-puing seluler, dan konten yang diekstraksi dikumpulkan untuk analisis hilir.

Gelombang ultrasound yang kuat mengganggu matriks sel struktur biologis dan melepaskan senyawa bioaktif. Transfer massa antara bahan tanaman dan pelarut (misalnya, buffer) diintensifkan. (grafis: ©Vilkhu et al., 2006)

Kekurangan Metode Lisis Umum

Selama bekerja di laboratorium, Anda mungkin sudah mengalami kerumitan lisis sel menggunakan protokol lisis mekanis atau kimia tradisional.

• Lisis mekanis: Metode lisis mekanis, seperti penggilingan dengan mortar dan alu atau homogenisasi menggunakan french press, bead mill, atau sistem rotor-stator seringkali tidak memiliki kontrol precice dan opsi penyesuaian. Ini berarti penggunaan penggilingan dan penggilingan dapat dengan cepat menghasilkan gaya panas dan geser yang dapat merusak sampel dan protein denature. Mereka juga bisa memakan waktu dan membutuhkan bahan awal dalam jumlah besar.
• Lisis kimia: Metode lisis kimia, seperti lisis berbasis deterjen, dapat merusak sampel dengan mengganggu bilayer lipid dan protein denaturasi. Mereka juga dapat memerlukan beberapa langkah dan dapat meninggalkan sisa kontaminan yang mengganggu aplikasi hilir. Menemukan dosis deterjen yang optimal merupakan tantangan tambahan.
• Siklus beku-mencair: Siklus freeze-thaw dapat menyebabkan membran sel pecah, tetapi siklus berulang juga dapat menyebabkan denaturasi dan degradasi protein. Metode ini juga dapat memerlukan beberapa siklus, yang dapat memakan waktu dan seringkali menghasilkan hasil yang lebih rendah.
• Lisis enzimatik: Metode lisis enzimatik dapat spesifik untuk jenis sel tertentu dan memerlukan beberapa langkah, membuatnya memakan waktu. Mereka juga menghasilkan limbah dan membutuhkan optimasi yang cermat untuk menghindari degradasi sampel. Kit lisis enzimatik seringkali mahal. Jika prosedur lisis enzimatik Anda saat ini memberikan hasil yang tidak memadai, sonikasi sebagai metode sinergis dapat diterapkan untuk mengintensifkan gangguan sel.

Berbeda dengan metode lisis sel mekanis dan kimia konvensional, sonikasi adalah alat yang sangat efisien dan andal untuk disintegrasi sel yang memungkinkan kontrol penuh atas parameter sonikasi. Ini memastikan selektivitas tinggi pada pelepasan bahan dan kemurnian produk. [lihat Balasundaram dkk., 2009]
Sangat cocok untuk semua jenis sel dan mudah diterapkan dalam skala kecil dan besar – selalu dalam kondisi terkontrol. Ultrasonicators mudah dibersihkan. Homogenizer ultrasonik selalu memiliki fungsi clean-in-place (CIP) dan sterilize-in-place (SIP). Sonotrode terdiri dari tanduk titanium besar yang dapat dibersihkan atau disiram dalam air atau pelarut (tergantung pada media kerja). Pemeliharaan ultrasonicators adalah karena ketahanannya hampir dapat diabaikan.

Ultrasonic Lysis dan Disrupsi Sel

Umumnya, lisis sampel di laboratorium akan memakan waktu antara 15 detik dan 2 menit. Karena intensitas sonikasi sangat mudah disesuaikan dengan pengaturan amplitudo waktu sonication dan juga dengan memilih peralatan yang tepat, adalah mungkin untuk mengganggu membran sel dengan sangat lembut atau sangat mendadak, tergantung pada struktur sel dan pada tujuan lisis ( misalnya ekstraksi DNA memerlukan sonication yang lebih lembut, ekstraksi protein lengkap bakteri memerlukan penanganan ultrasound yang lebih intens). Suhu selama proses dapat dipantau oleh sensor suhu yang terintegrasi dan dapat dikontrol dengan mudah dengan pendinginan (sel pemandian es atau sel aliran dengan jaket pendingin) atau dengan sonikasi dalam mode berdenyut. Selama sonication mode pulsa, siklus burst sonication pendek dengan durasi 1-15 detik memungkinkan pembuangan panas dan pendinginan selama periode intermiten yang lebih lama.
Semua proses USG-driven benar-benar direproduksi dan linear scalable.

Ultrasonic homogenizers untuk sel lisis dan ekstraksi

Berbagai jenis perangkat ultrasonik memungkinkan untuk mencocokkan tujuan persiapan sampel dan untuk memastikan keramahan pengguna dan kenyamanan operasi. Ultrasonikator tipe probe adalah perangkat yang paling umum di laboratorium. Mereka paling cocok untuk persiapan sampel kecil dan menengah dengan volume 0,1mL hingga 1000mL. Ukuran daya yang berbeda dan sonotrodes memungkinkan untuk menyesuaikan ultrasonicator dengan volume sampel dan kapal untuk hasil sonikasi yang paling efektif dan efisien. Perangkat probe ultrasonik adalah pilihan terbaik ketika sampel tunggal harus disiapkan.

Jika lebih banyak sampel harus disiapkan, misalnya 8-10 botol larutan sel, sonikasi tidak langsung yang intens dengan sistem ultrasonik seperti VialTweeter atau cuphorn ultrasonik adalah metode homogenisasi yang paling cocok untuk lisis yang efisien. Beberapa botol disonikasi pada saat yang sama, dengan intensitas yang sama. Ini tidak hanya menghemat waktu, tetapi juga memastikan perlakuan yang sama dari semua sampel, yang membuat hasil di antara sampel dapat diandalkan dan sebanding. Selanjutnya, selama sonikasi tidak langsung kontaminasi silang dengan merendam sonotrode ultrasonik (juga dikenal sebagai probe ultrasonik, tanduk, ujung, atau jari) dihindari. Karena secara individual untuk ukuran sampel botol yang cocok digunakan, pembersihan yang memakan waktu dan kehilangan sampel karena penuangan kapal dihilangkan. Untuk sonikasi seragam pelat multiwell atau mikrotiter, Hielscher menawarkan UIP400MTP.
Untuk volume yang lebih tinggi, misalnya untuk produksi komersial ekstrak sel, sistem ultrasonik terus menerus dengan reaktor sel aliran yang paling cocok. Aliran terus menerus dan bahkan dari bahan yang diproses menjamin bahkan sonikasi. Semua parameter dari proses disintegrasi ultrasonik dapat dioptimalkan dan disesuaikan dengan kebutuhan aplikasi dan materi sel tertentu.
 
 
Prosedur teladan untuk Lysing ultrasonik sel bakteri:

• Persiapan suspensi sel: Sel pelet harus benar-benar ditangguhkan dalam larutan penyangga oleh homogenisasi (memilih solusi buffer Anda kompatibel dengan analisis berikut, misalnya metode kromatografi tertentu). Tambah lysozymes dan / atau aditif lainnya, jika diperlukan (mereka harus juga kompatibel dengan cara pemisahan / pemurnian). Campur / menyeragamkan solusi lembut di bawah sonikasi ringan sampai suspensi lengkap tercapai.
• Ultrasonic lisis: Tempatkan sampel dalam penangas es. Untuk gangguan sel, sonicate suspensi di 60-90 semburan kedua (menggunakan modus pulsa Ultrasonikator Anda).
• (. Misalnya 10 menit pada 10.000 x g; di 4degC): pemisahan Centrifuge lisat tersebut. Memisahkan supernatan dari pelet sel hati-hati. supernatan adalah lisat total sel. Setelah penyaringan supernatan, Anda mendapatkan cairan diklarifikasi dari protein sel larut.

 
 
Aplikasi yang paling umum untuk ultrasonicators dalam biologi dan bioteknologi adalah:

• persiapan ekstrak sel
• Gangguan ragi, bakteri, sel tumbuhan, jaringan sel lunak atau keras, bahan nukleat
• Ekstraksi Protein
• Persiapan dan isolasi enzim
• Produksi antigen
• ekstraksi DNA dan / atau fragmentasi ditargetkan
• persiapan liposom