Sonikasi untuk lisis sel: gangguan dan ekstraksi sel
Lisis sel ultrasonik adalah teknik persiapan sampel yang diterapkan secara luas di laboratorium bioteknologi modern. Tujuan utamanya adalah untuk mengganggu membran sel atau seluruh sel untuk melepaskan komponen intraseluler seperti protein, asam nukleat, atau organel. Dalam praktikum sehari-hari, ini berarti sonikasi adalah metode standar untuk gangguan sel yang terkendali dan ekstraksi biomolekul yang efisien. Keuntungan utama sonikator terletak pada kemampuannya untuk memodulasi parameter proses penting secara tepat, termasuk intensitas ultrasound, denyut, dan kontrol suhu. Kontrol ini memungkinkan para peneliti untuk mencapai lisis yang andal sambil meminimalkan kerusakan termal atau mekanis pada biomolekul sensitif, sehingga menghasilkan proses ekstraksi yang lembut namun sangat efisien.
Lisis Sel menggunakan Sonicators
Lisis sel ultrasonik menggunakan kavitasi akustik untuk mengganggu membran sel dan melepaskan molekul intraseluler. Hielscher Ultrasonics menawarkan sonikator tipe probe klasik serta sonikator multi-sampel untuk pemrosesan steril: VialTweeter untuk beberapa tabung dan botol serta 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP untuk pelat mikro standar.
Hielscher Ultrasonics memasok sonicator non-kontak yang kuat untuk persiapan sampel dan analisis klinis. Sonikator pelat multi-sumur UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn dan sonikator aliran GDmini2 memproses sampel dalam kondisi steril.
Homogenizer ultrasonik UP100H (100 watt) dan UP400St (400 watt): Sonikasi untuk lisis dan Ekstraksi Sel.
Homogenizer Ultrasonik untuk Lisis dan Ekstraksi Sel
| Jenis Perangkat Ultrasonik | Fokus Aplikasi | Contoh Volume | Kasus Penggunaan Umum | Keuntungan | Contoh Model |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonic tipe probe | Sonikasi sampel tunggal | 00,1 mL hingga ~1000 mL | Lisis sel, ekstraksi protein, fragmentasi DNA/RNA | Kontrol energi yang tepat; berbagai sonotrode; optimal untuk sampel kecil hingga sedang | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Pemrosesan paralel dari beberapa botol tertutup | 8-10 botol (masing-masing ~1-20 mL) | Lisis terstandardisasi dari beberapa suspensi sel | Sonikasi yang seragam; menghindari kontaminasi silang; hasil yang dapat direproduksi | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicator Pelat 96-sumur | Sonikasi pelat multiwell dan mikrotiter | Format pelat mikro | Skrining dengan hasil tinggi, proteomik, uji sel | Sonikasi simultan dan merata di seluruh sumur; ideal untuk alur kerja multi-sampel | UIP400MTP |
| reaktor sel aliran | Sonikasi berkelanjutan untuk volume yang lebih tinggi | >1 L, dapat diukur | Gangguan sel skala industri, produksi ekstrak | Pemrosesan berkelanjutan; terukur; kontrol proses penuh (amplitudo, tekanan, suhu) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + sel aliran |
| Sistem Sonikasi Steril / Tidak Langsung | Pemrosesan sampel bebas kontaminasi | Tergantung pada botol / tabung / pelat mikro | Sampel sensitif, lingkungan steril, pengaturan regulasi | Tidak ada kontak probe; menghindari sisa-sisa; upaya pembersihan minimal | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Keuntungan Menggunakan Sonikasi untuk Lisis Sel
Dibandingkan dengan metode lisis dan ekstraksi sel lainnya, lisis sel ultrasonik memiliki beberapa keunggulan:
- Kecepatan: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik adalah metode cepat yang dapat memecahkan sel terbuka dalam hitungan detik. Ini jauh lebih cepat daripada metode lain seperti homogenisasi, pencairan beku atau penggilingan manik-manik.
- Efisiensi: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik dapat digunakan untuk merawat sampel kecil, besar, atau ganda sekaligus, membuatnya lebih efisien daripada metode lain yang memerlukan pemrosesan sampel kecil secara individual.
- Bebas bahan kimia: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik adalah metode non-invasif yang tidak memerlukan penggunaan bahan kimia atau enzim keras. Ini membuatnya ideal untuk aplikasi di mana integritas isi sel perlu dipertahankan. Kontaminasi sampel yang tidak diinginkan dapat dihindari.
- Hasil tinggi: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik dapat mengekstrak hasil tinggi dari isi seluler, termasuk DNA, RNA, dan protein. Ini karena gelombang suara frekuensi tinggi memecah dinding sel dan melepaskan isinya ke dalam larutan di sekitarnya.
- Kontrol Suhu: Ultrasonciator canggih memungkinkan kontrol suhu sampel yang tepat. Sonikator digital Hielscher dilengkapi dengan sensor suhu yang dapat dicolokkan dan perangkat lunak pemantauan suhu.
- Direproduksi: Protokol untuk lisis sel ultrasonik dapat dengan mudah direproduksi dan bahkan dicocokkan dengan volume sampel yang berbeda yang lebih besar atau lebih kecil dengan peningkatan linier sederhana.
- Serbaguna: Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik dapat digunakan untuk mengekstrak berbagai jenis sel, termasuk bakteri, ragi, jamur, sel tumbuhan dan mamalia. Ini juga dapat digunakan untuk mengekstrak berbagai jenis molekul, termasuk protein, DNA, RNA, dan lipid.
- Persiapan simultan dari banyak sampel: Hielscher Ultrasonics menawarkan beberapa solusi untuk memproses banyak sampel dengan nyaman dalam kondisi proses yang persis sama. Hal ini membuat langkah persiapan sampel lisis dan ekstraksi sangat efisien dan hemat waktu.
- Mudah digunakan: Peralatan lisis dan ekstraksi sel ultrasonik mudah digunakan dan membutuhkan pelatihan minimal. Peralatan ini juga ekonomis karena merupakan investasi tunggal tanpa persyaratan untuk membeli kembali pembuangan. Hal ini membuatnya menarik bagi berbagai peneliti dan laboratorium.
Secara keseluruhan, lisis dan ekstraksi sel ultrasonik adalah metode yang cepat, efisien, dapat dikontrol dengan tepat, dan serbaguna untuk mengekstraksi isi seluler. Keunggulannya dibandingkan metode alternatif menjadikannya pilihan yang menarik untuk berbagai aplikasi penelitian dan industri.
Prinsip Kerja Lisis Sel Ultrasonik
Lisis dan ekstraksi sel ultrasonik menggunakan gelombang suara frekuensi tinggi untuk mengganggu sel dan mengekstrak isinya. Gelombang suara menciptakan perubahan tekanan dalam cairan di sekitarnya, menyebabkan gelembung kecil terbentuk dan runtuh dalam proses yang dikenal sebagai kavitasi. Gelembung ini menghasilkan gaya mekanis lokal yang sangat kuat yang dapat memecahkan sel terbuka dan melepaskan isinya ke dalam larutan di sekitarnya.
Lisis sel menggunakan ultrasonicator biasanya melibatkan langkah-langkah berikut:
- Sampel ditempatkan dalam tabung atau wadah dengan buffer cair.
- Probe ultrasonik dimasukkan ke dalam sampel, dan gelombang suara frekuensi tinggi dengan sekitar 20-30 kHz diterapkan.
- Gelombang ultrasound menyebabkan osilasi dan kavitasi dalam cairan di sekitarnya, menghasilkan gaya lokal yang memecah sel terbuka dan melepaskan isinya.
- Sampel disentrifugasi atau disaring untuk menghilangkan puing-puing seluler, dan isi yang diekstraksi dikumpulkan untuk analisis hilir.
Kerugian dari Metode Lisis Umum
Selama bekerja di laboratorium, Anda mungkin pernah mengalami kerumitan lisis sel menggunakan protokol lisis mekanis atau kimia tradisional.
- Lisis mekanis: Metode lisis mekanis, seperti penggilingan dengan mortar dan alu atau homogenisasi menggunakan pers perancis, pabrik manik-manik, atau sistem rotor-stator seringkali tidak memiliki opsi kontrol dan penyesuaian precise. Ini berarti penggunaan penggilingan dan penggilingan dapat dengan cepat menghasilkan panas dan gaya geser yang dapat merusak sampel dan mendenaturasi protein. Mereka juga bisa memakan waktu dan membutuhkan bahan awal dalam jumlah besar.
- Lisis kimia: Metode lisis kimia, seperti lisis berbasis deterjen, dapat merusak sampel dengan mengganggu lapisan ganda lipid dan denaturasi protein. Mereka juga dapat memerlukan beberapa langkah dan dapat meninggalkan kontaminan residu yang mengganggu aplikasi hilir. Menemukan dosis deterjen yang optimal merupakan tantangan tambahan.
- Siklus beku-cair: Siklus beku-cair dapat menyebabkan membran sel pecah, tetapi siklus berulang juga dapat menyebabkan denaturasi dan degradasi protein. Metode ini juga dapat memerlukan beberapa siklus, yang dapat memakan waktu dan seringkali menghasilkan hasil yang lebih rendah.
- Lisis enzimatik: Metode lisis enzimatik dapat spesifik untuk jenis sel tertentu dan memerlukan banyak langkah, sehingga memakan waktu. Mereka juga menghasilkan limbah dan membutuhkan pengoptimalan yang cermat untuk menghindari degradasi sampel. Kit lisis enzimatik seringkali mahal. Jika prosedur lisis enzimatik Anda saat ini memberikan hasil yang tidak memadai, sonikasi sebagai metode sinergis dapat diterapkan untuk mengintensifkan gangguan sel.
Berbeda dengan metode lisis sel mekanis dan kimia konvensional, sonikasi adalah alat yang sangat efisien dan andal untuk disintegrasi sel yang memungkinkan kontrol penuh atas parameter sonikasi. Ini memastikan selektivitas yang tinggi pada pelepasan bahan dan kemurnian produk. [lih. Balasundaram et al., 2009]
Sangat cocok untuk semua jenis sel dan mudah diterapkan dalam skala kecil dan besar – selalu dalam kondisi terkendali. Ultrasonicators mudah dibersihkan. Homogenizer ultrasonik selalu memiliki fungsi clean-in-place (CIP) dan sterilize-in-place (SIP). Sonotrode terdiri dari tanduk titanium besar yang dapat dibersihkan atau dibilas dalam air atau pelarut (tergantung pada media kerja). Pemeliharaan ultrasonicators adalah karena kekokohannya hampir dapat diabaikan.
Lisis Ultrasonik dan Gangguan Sel
Umumnya, lisis sampel di laboratorium akan memakan waktu antara 15 detik dan 2 menit. Karena intensitas sonikasi sangat mudah disesuaikan dengan pengaturan amplitudo waktu sonikasi serta dengan memilih peralatan yang tepat, dimungkinkan untuk mengganggu membran sel dengan sangat lembut atau sangat tiba-tiba, tergantung pada struktur sel dan pada tujuan lisis (misalnya ekstraksi DNA membutuhkan sonikasi yang lebih lembut, ekstraksi protein lengkap bakteri membutuhkan perawatan ultrasound yang lebih intens). Suhu selama proses dapat dipantau oleh sensor suhu terintegrasi dan dapat dengan mudah dikontrol dengan pendinginan (penangas es atau sel aliran dengan jaket pendingin) atau dengan sonikasi dalam mode berdenyut. Selama sonikasi mode pulsa, siklus ledakan sonikasi pendek dengan durasi 1-15 detik memungkinkan pembuangan panas dan pendinginan selama periode intermiten yang lebih lama.
Semua proses yang digerakkan oleh ultrasound sepenuhnya dapat direproduksi dan dapat diskalakan secara linier.
The VialTweeter adalah homogenizer ultrasonik untuk persiapan steril simultan, seragam dan cepat dari banyak sampel.
- Persiapan suspensi sel: Pelet sel harus sepenuhnya tersuspensi dalam larutan buffer dengan homogenisasi (pilih larutan buffer Anda yang kompatibel dengan analisis berikut, misalnya metode kromatografi tertentu). Tambahkan lisozim dan/atau aditif lainnya, jika diperlukan (mereka juga harus kompatibel dengan sarana pemisahan/pemurnian). Campur / homogenkan larutan dengan lembut di bawah sonikasi ringan sampai suspensi lengkap tercapai.
Baca lebih lanjut tentang sinergi lisozim yang dikombinasikan dengan sonikasi! - Lisis ultrasonik: Tempatkan sampel dalam penangas es. Untuk gangguan sel, sonikasi suspensi pada semburan 60-90 detik (menggunakan mode pulsa sonicator Anda).
- Pemisahan: Centrifuge lisat (misalnya 10 menit pada 10.000 x g; pada 4degC). Pisahkan supernatan dari pelet sel dengan hati-hati. Supernatan adalah lisat sel total. Setelah penyaringan supernatan, Anda mendapatkan cairan yang diklarifikasi dari protein sel larut.
Aplikasi yang paling umum untuk ultrasonicator dalam biologi dan bioteknologi adalah:
- Persiapan ekstrak sel
- Gangguan ragi, bakteri, sel tumbuhan, jaringan sel lunak atau keras, bahan nukleat
- Ekstraksi Protein
- Persiapan dan isolasi enzim
- Produksi antigen
- Ekstraksi DNA dan/atau fragmentasi yang ditargetkan
- Persiapan liposom
Gangguan sel dengan ultrasonicator tipe probe adalah metode persiapan sampel yang efisien.
Berbagai aplikasi ultrasound bercabang di sektor bioteknologi, bioteknologi, mikrobiologi, biologi molekuler, biokimia, imunologi, bakteriologi, virologi, proteomik, genetika, fisiologi, biologi seluler, hematologi, dan botani.
Lisis: Memecahkan Struktur Sel
Sel-sel dilindungi oleh membran plasma semi-permeabel yang terdiri dari lapisan ganda fosfo-lipid (juga lapisan ganda protein-lipid; dibentuk oleh lipid hidrofobik dan molekul fosfor hidrofilik dengan molekul protein tertanam) dan menciptakan penghalang antara interior sel (sitoplasma) dan lingkungan ekstraseluler. Sel tumbuhan dan sel prokariotik dikelilingi oleh dinding sel. Karena dinding sel selulosa yang tebal berlapis-lapis, sel tumbuhan lebih sulit untuk lisis daripada sel hewan. Bagian dalam sel, seperti organel, nukleus, mitokondria, distabilkan oleh sitoskeleton.
Dengan melisiskan sel, ini bertujuan untuk mengekstraksi dan memisahkan organel, protein, DNA, mRNA atau biomolekul lainnya.
Metode Konvensional Lisis Sel dan Kekurangannya
Ada beberapa metode untuk lisasi sel, yang dapat dibagi menjadi metode mekanis dan kimia, yang meliputi penggunaan deterjen atau pelarut, penerapan tekanan tinggi, atau penggunaan pabrik manik-manik atau pers Prancis. Kerugian yang paling bermasalah dari metode ini adalah kontrol dan penyesuaian parameter proses yang sulit dan dengan demikian dampaknya.
Tabel di bawah ini menampilkan kelemahan utama dari metode lisis umum:
Tabel: Metode lisis sel konvensional memiliki kelemahan utama
Prosedur Lisis
Lisis adalah proses yang sensitif. Selama lisis, perlindungan membran sel dihancurkan, namun inaktivasi, denaturasi, dan degradasi protein yang diekstraksi oleh lingkungan yang tidak fisiologis (penyimpangan dari nilai pH) harus dicegah. Oleh karena itu, secara umum lisis dilakukan dalam larutan penyangga. Sebagian besar kesulitan muncul dari gangguan sel yang tidak terkendali yang mengakibatkan pelepasan yang tidak ditargetkan dari semua bahan intraseluler atau/dan denaturasi produk target.
Pertanyaan yang Sering Diajukan tentang Sonikasi dan Lisis Sel
- Bisakah Anda melisiskan sel dengan sonikasi? Ya, sonikasi secara efektif melisiskan sel menggunakan gelombang ultrasonik frekuensi tinggi yang menginduksi kavitasi, sebuah fenomena di mana gelembung uap kecil terbentuk dan runtuh dengan keras di dalam suspensi sel. Gaya mekanis yang dihasilkan mengganggu membran sel dan memfasilitasi pelepasan komponen intraseluler ke dalam cairan.
- Bagaimana cara menggunakan sonicator untuk lisis sel? Memanfaatkan sonicator untuk lisis sel melibatkan merendam probe sonicator ke dalam suspensi sel dan menyesuaikan parameter seperti amplitudo dan durasi pulsa. Proses ini harus dipantau secara ketat untuk mengoptimalkan gangguan sel sambil meminimalkan denaturasi protein dan inaktivasi enzim.
- Apa prinsip sonikasi untuk lisis sel? Sonikasi beroperasi berdasarkan prinsip kavitasi akustik. Energi ultrasonik ditransmisikan ke dalam media cair, menyebabkan fluktuasi tekanan cepat yang menyebabkan pembentukan dan ledakan gelembung mikro. Ledakan ini menghasilkan gaya geser yang kuat dan suhu tinggi yang terlokalisasi, mengganggu struktur seluler dan meningkatkan homogenitas lisat.
- Berapa lama sonikasi lisis sel? Durasi sonikasi untuk lisis sel dapat bervariasi secara signifikan tergantung pada faktor-faktor seperti jenis sel, kepadatan sel, daya sonikator, dan protokol spesifik yang digunakan. Prosedur tipikal dapat berkisar dari beberapa detik hingga beberapa menit, sering dilakukan dalam siklus untuk mengelola pembangkitan panas dan memastikan gangguan sel yang seragam.
- Apa tujuan sonikasi dalam ekstraksi protein? Dalam ekstraksi protein, sonikasi berfungsi untuk memecahkan membran sel secara efisien dan melarutkan protein. Metode ini sangat berguna untuk melepaskan protein dari dalam kompartemen seluler, sehingga penting untuk menyiapkan lisat dari mana protein akan dimurnikan atau dianalisis.
- Mengapa sonikasi digunakan untuk ekstraksi? Sonikasi disukai untuk ekstraksi karena tindakannya yang cepat dan kemampuannya untuk menerapkan energi yang ditargetkan, memecah struktur seluler untuk melepaskan molekul bioaktif tanpa menggunakan perlakuan kimia yang keras, sehingga menjaga integritas fungsional senyawa yang diekstraksi.
- Apakah sonikasi mengganggu interaksi protein-protein? Sementara sonikasi dapat secara efektif mengganggu membran sel, itu juga dapat mengganggu interaksi protein-protein. Tingkat gangguan tergantung pada intensitas sonikasi dan durasi paparan, yang berpotensi menyebabkan denaturasi atau disosiasi kompleks protein, yang dapat mempengaruhi studi analitik atau fungsional selanjutnya.
- Bisakah sonikasi digunakan untuk melisiskan E.? Sonikator Hielscher sangat efektif untuk melisiskan sel bakteri seperti E., yang memiliki dinding sel yang kuat. Teknik ini menyediakan metode fisik untuk memotong dinding sel dan membran, menjadikannya metode yang disukai untuk menyiapkan lisat bakteri di laboratorium biologi molekuler dan biokimia.
- Apa saja proses selanjutnya setelah langkah sonikasi?
Langkah-langkah hilir setelah lisis ultrasonik biasanya mencakup fraksinasi lisat, isolasi organel yang ditargetkan, dan ekstraksi atau pemurnian protein lebih lanjut.
Lisat yang telah diproses kemudian dipisahkan dan dipersiapkan untuk aplikasi analitik atau fungsional, seperti proteomik resolusi tinggi, transkriptomik, atau studi pengikatan reseptor.
Literatur / Referensi
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.