Ուլտրաձայնային մշակում բջիջների լիզիսի համար. բջիջների քայքայում և էքստրակցիա
Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը նմուշների նախապատրաստման լայնորեն կիրառվող մեթոդ է ժամանակակից կենսատեխնոլոգիական լաբորատորիաներում։ Դրա հիմնական նպատակը բջջաթաղանթները կամ ամբողջական բջիջները քայքայելն է՝ ներբջջային բաղադրիչները, օրինակ՝ սպիտակուցները, նուկլեինաթթուները կամ օրգանելները, ազատելու համար։ Առօրյա լաբորատոր աշխատանքում սա նշանակում է, որ ուլտրաձայնային մշակումը բջիջների վերահսկվող քայքայման և կենսամոլեկուլների արդյունավետ էքստրակցիայի ստանդարտ մեթոդ է։ Սոնիկատորների հիմնական առավելությունը գործընթացի կարևոր պարամետրերը, այդ թվում՝ ուլտրաձայնի ինտենսիվությունը, իմպուլսային ռեժիմը և ջերմաստիճանի վերահսկումը, ճշգրիտ կարգավորելու հնարավորությունն է։ Այս վերահսկումը հետազոտողներին թույլ է տալիս ապահովել հուսալի լիզիս՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով զգայուն կենսամոլեկուլների ջերմային կամ մեխանիկական վնասումը, ինչի արդյունքում էքստրակցիան ընթանում է մեղմ, բայց բարձր արդյունավետությամբ։
Բջիջների լիզիս սոնիկատորների միջոցով
Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսն օգտագործում է ակուստիկ կավիտացիան՝ բջջաթաղանթները քայքայելու և ներբջջային մոլեկուլներն ազատելու համար։ Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է ինչպես դասական զոնդային սոնիկատոր, այնպես էլ ստերիլ մշակման համար նախատեսված բազմա նմուշային սոնիկատորներ՝ VialTweeter՝ բազմաթիվ փորձանոթների և սրվակների համար, և 96 հորիկով պլանշետների UIP400MTP սոնիկատոր՝ ստանդարտ միկրոպլանշետների համար։
Hielscher Ultrasonics-ը մատակարարում է հզոր անկոնտակտ սոնիկատորներ՝ նմուշների նախապատրաստման և կլինիկական վերլուծության համար։ Բազմահորիկ պլանշետների UIP400MTP սոնիկատորը, VialTweeter-ը, CupHorn-ը և հոսքային GDmini2 սոնիկատորը մշակում են նմուշները ստերիլ պայմաններում։
UP100H (100 վատտ) և UP400St (400 վատտ) ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ. ուլտրաձայնային մշակում՝ բջիջների լիզիսի և էքստրակցիայի համար։
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ բջիջների լիզիսի և էքստրակցիայի համար
| Ուլտրաձայնային սարքի տեսակը | Կիրառման հիմնական ուղղությունը | Նմուշի ծավալը | Կիրառման բնորոշ օրինակը | Առավելությունները | Մոդելների օրինակներ |
|---|---|---|---|---|---|
| Զոնդային սոնիկատորներ | Մեկ նմուշի ուլտրաձայնային մշակում | 0,1 mL-ից մինչև ~1000 mL | Բջիջների լիզիս, սպիտակուցների էքստրակցիա, DNA/RNA-ի ֆրագմենտացում | Էներգիայի ճշգրիտ վերահսկում, տարբեր սոնոտրոդներ, օպտիմալ են փոքր և միջին ծավալի նմուշների համար | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Բազմաթիվ հերմետիկ փակված սրվակների զուգահեռ մշակում | 8–10 սրվակ (յուրաքանչյուրը՝ ~1–20 mL) | Բազմաթիվ բջջային սուսպենզիաների ստանդարտացված լիզիս | Հավասարաչափ ուլտրաձայնային մշակում, խաչաձև աղտոտման կանխում, վերարտադրելի արդյունքներ | VialTweeter, CupHorn |
| 96 հորիկով պլանշետների սոնիկատոր | Բազմահորիկ և միկրոտիտրային պլանշետների ուլտրաձայնային մշակում | Միկրոպլանշետի ձևաչափ | Մեծ թվով նմուշների սկրինինգ, պրոտեոմիկա, բջջային անալիզներ | Հորիկների միաժամանակյա, հավասարաչափ ուլտրաձայնային մշակում, իդեալական է բազմաթիվ նմուշներով աշխատանքային գործընթացների համար | UIP400MTP |
| Հոսքային խցիկով ռեակտորներ | Անընդհատ ուլտրաձայնային մշակում՝ ավելի մեծ ծավալների համար | >1 L, մասշտաբավորման հնարավորությամբ | Բջիջների քայքայում արդյունաբերական մասշտաբով, էքստրակտների արտադրություն | Անընդհատ մշակում, մասշտաբավորման հնարավորություն, գործընթացի լիակատար վերահսկում (ամպլիտուդ, ճնշում, ջերմաստիճան) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + հոսքային խցիկ |
| Ստերիլ / անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համակարգեր | Նմուշների մշակում՝ առանց աղտոտման | Կախված է սրվակից/փորձանոթից/միկրոպլանշետից | Զգայուն նմուշներ, ստերիլ միջավայրեր, կարգավորող պահանջների ենթակա պայմաններ | Զոնդի հետ շփման բացակայություն, նմուշների միջև մնացորդների փոխանցման կանխում, մաքրման նվազագույն ջանքեր | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակման կիրառման առավելությունները
Բջիջների լիզիսի և էքստրակցիայի այլ մեթոդների համեմատ՝ բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսն ունի մի շարք առավելություններ.
- Արագություն. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան արագ մեթոդ է, որը կարող է բջիջները քայքայել ընդամենը վայրկյանների ընթացքում։ Սա շատ ավելի արագ է, քան այլ մեթոդները, օրինակ՝ հոմոգենացումը, սառեցում–հալեցումը կամ գնդիկային աղացումը։
- Արդյունավետություն. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան կարելի է կիրառել փոքր, մեծ կամ միաժամանակ բազմաթիվ նմուշներ մշակելու համար, ինչն այն դարձնում է ավելի արդյունավետ, քան փոքր նմուշների առանձին մշակում պահանջող այլ մեթոդները։
- Առանց քիմիական նյութերի: Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան ոչ ինվազիվ մեթոդ է, որը չի պահանջում ագրեսիվ քիմիական նյութերի կամ ֆերմենտների օգտագործում։ Սա այն դարձնում է իդեալական այն կիրառությունների համար, որոնցում անհրաժեշտ է պահպանել բջջի պարունակության ամբողջականությունը։ Նմուշների անցանկալի աղտոտումից կարելի է խուսափել։
- Բարձր ելք. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան կարող են ապահովել բջջային պարունակության, այդ թվում՝ DNA-ի, RNA-ի և սպիտակուցների, էքստրակցիայի բարձր ելք։ Դա պայմանավորված է նրանով, որ բարձր հաճախականության ձայնային ալիքները քայքայում են բջջապատերը և պարունակությունն ազատում շրջապատող լուծույթի մեջ։
- Ջերմաստիճանի վերահսկում. Առաջադեմ ուլտրաձայնային սարքերը թույլ են տալիս ճշգրիտ վերահսկել նմուշի ջերմաստիճանը։ Hielscher-ի թվային ուլտրաձայնային սարքերը հագեցած են միացվող ջերմաստիճանային տվիչով և ջերմաստիճանի մշտադիտարկման ծրագրային ապահովմամբ։
- Վերարտադրելիություն. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրությունները կարելի է հեշտությամբ վերարտադրել և նույնիսկ հարմարեցնել նմուշների տարբեր՝ ավելի մեծ կամ ավելի փոքր ծավալներին՝ մասշտաբի պարզ գծային մեծացման միջոցով։
- Բազմակողմանիություն. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան կարող են օգտագործվել տարբեր տեսակի բջիջների էքստրակցիայի համար, ներառյալ բակտերիաները, խմորասնկերը, սնկերը, բուսական և կաթնասունների բջիջները։ Դրանք կարող են օգտագործվել նաև տարբեր տեսակի մոլեկուլների, ներառյալ սպիտակուցների, DNA-ի, RNA-ի և լիպիդների, էքստրակցիայի համար։
- Բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա նախապատրաստում. Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է մի շարք լուծումներ՝ բազմաթիվ նմուշներ հարմարավետորեն մշակելու համար՝ գործընթացի ճիշտ նույն պայմաններում։ Սա նմուշների նախապատրաստման լիզիսի և էքստրակցիայի փուլը դարձնում է խիստ արդյունավետ և ժամանակ խնայող։
- Օգտագործման հեշտություն. Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի և էքստրակցիայի սարքավորումները հեշտ են օգտագործման մեջ և պահանջում են նվազագույն ուսուցում։ Սարքավորումները նաև տնտեսապես շահավետ են, քանի որ պահանջում են մեկանգամյա ներդրում՝ առանց միանգամյա օգտագործման ծախսանյութեր կրկին գնելու անհրաժեշտության։ Սա դրանք գրավիչ է դարձնում հետազոտողների և լաբորատորիաների լայն շրջանակի համար։
Ընդհանուր առմամբ, բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը և էքստրակցիան բջջային պարունակության կորզման արագ, արդյունավետ, ճշգրիտ վերահսկելի և բազմակողմանի մեթոդ են։ Այլընտրանքային մեթոդների նկատմամբ դրանց առավելությունները դրանք գրավիչ ընտրություն են դարձնում հետազոտական և արդյունաբերական կիրառությունների լայն շրջանակի համար։
Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի աշխատանքի սկզբունքը
Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի և էքստրակցիայի ժամանակ օգտագործվում են բարձր հաճախականության ձայնային ալիքներ՝ բջիջները քայքայելու և դրանց պարունակությունը կորզելու համար։ Ձայնային ալիքները շրջապատող հեղուկում առաջացնում են ճնշման փոփոխություններ, որոնց հետևանքով փոքր պղպջակներ են ձևավորվում և փլուզվում՝ կավիտացիա կոչվող գործընթացի ընթացքում։ Այս պղպջակներն առաջացնում են տեղային խիստ ինտենսիվ մեխանիկական ուժեր, որոնք կարող են պատռել բջիջները և դրանց պարունակությունն ազատել շրջապատող լուծույթի մեջ։
Ուլտրաձայնային սարքի միջոցով բջիջների լիզիսը սովորաբար ներառում է հետևյալ քայլերը.
- Նմուշը տեղադրվում է հեղուկ բուֆեր պարունակող փորձանոթի կամ տարայի մեջ։
- Ուլտրաձայնային զոնդը մտցվում է նմուշի մեջ, և կիրառվում են մոտավորապես 20–30 kHz հաճախականությամբ ձայնային ալիքներ։
- Ուլտրաձայնային ալիքները շրջապատող հեղուկում առաջացնում են տատանումներ և կավիտացիա՝ ստեղծելով տեղային ուժեր, որոնք պատռում են բջիջները և ազատում դրանց պարունակությունը։
- Նմուշը ցենտրիֆուգվում կամ զտվում է՝ բջջային մնացորդները հեռացնելու համար, իսկ կորզված պարունակությունը հավաքվում է հետագա վերլուծության համար։
Լիզիսի տարածված մեթոդների թերությունները
Լաբորատորիաներում աշխատելիս գուցե արդեն բախվել եք բջիջների լիզիսի դժվարություններին՝ ավանդական մեխանիկական կամ քիմիական լիզիսի արձանագրություններ կիրառելիս։
- Մեխանիկական լիզիս. Մեխանիկական լիզիսի մեթոդները, ինչպիսիք են հավանգով և հավանգակոթով տրորումը կամ ֆրանսիական մամլիչով, գնդիկավոր աղացով կամ ռոտոր–ստատորային համակարգով հոմոգենացումը, հաճախ չունեն ճշգրիտ վերահսկման և կարգավորման հնարավորություններ։ Սա նշանակում է, որ աղացումն ու տրորումը կարող են արագ առաջացնել ջերմություն և սահքի ուժեր, որոնք կարող են վնասել նմուշը և առաջացնել սպիտակուցների դենատուրացիա։ Դրանք կարող են նաև ժամանակատար լինել և պահանջել մեծ քանակությամբ ելանյութ։
- Քիմիական լիզիս. Քիմիական լիզիսի մեթոդները, ինչպիսին է դետերգենտների վրա հիմնված լիզիսը, կարող են վնասել նմուշը՝ խախտելով լիպիդային երկշերտը և առաջացնելով սպիտակուցների դենատուրացիա։ Դրանք կարող են նաև պահանջել բազմաթիվ քայլեր և կարող են թողնել մնացորդային աղտոտիչներ, որոնք խանգարում են հետագա կիրառություններին։ Դետերգենտի օպտիմալ չափաբաժինը գտնելը լրացուցիչ դժվարություն է։
- Սառեցման–հալեցման ցիկլեր. Սառեցման–հալեցման ցիկլերը կարող են առաջացնել բջջաթաղանթների պատռում, սակայն կրկնվող ցիկլերը կարող են նաև առաջացնել սպիտակուցների դենատուրացիա և քայքայում։ Այս մեթոդը նույնպես կարող է պահանջել բազմաթիվ ցիկլեր, ինչը կարող է ժամանակատար լինել և հաճախ հանգեցնում է ավելի ցածր ելքի։
- Ֆերմենտային լիզիս. Ֆերմենտային լիզիսի մեթոդները կարող են յուրահատուկ լինել բջիջների որոշակի տեսակների համար և պահանջել բազմաթիվ փուլեր, ինչի պատճառով դրանք ժամանակատար են։ Դրանք նաև առաջացնում են թափոններ և պահանջում մանրակրկիտ օպտիմալացում՝ նմուշի քայքայումից խուսափելու համար։ Ֆերմենտային լիզիսի հավաքածուները հաճախ թանկ են։ Եթե ֆերմենտային լիզիսի ձեր ներկայիս ընթացակարգը բավարար արդյունքներ չի տալիս, ուլտրաձայնային մշակումը կարող է կիրառվել որպես սիներգիկ մեթոդ՝ բջիջների քայքայումն ուժեղացնելու համար։
Ի տարբերություն բջիջների լիզիսի ավանդական մեխանիկական և քիմիական մեթոդների՝ ուլտրաձայնային մշակումը բջիջների քայքայման շատ արդյունավետ և հուսալի միջոց է, որը թույլ է տալիս լիովին վերահսկել ուլտրաձայնային մշակման պարամետրերը։ Սա ապահովում է նյութերի ազատման բարձր ընտրողականություն և արտադրանքի մաքրություն։ [cf. Balasundaram et al., 2009]
Այն հարմար է բջիջների բոլոր տեսակների համար և հեշտությամբ կիրառելի է փոքր ու մեծ մասշտաբներով՝ միշտ վերահսկվող պայմաններում։ Ուլտրաձայնային սարքերը հեշտ են մաքրվում։ Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորը միշտ ունի տեղում մաքրման (CIP) և տեղում ստերիլացման (SIP) գործառույթ։ Սոնոտրոդը հոծ տիտանե տատանվող մարմին է, որը կարելի է սրբել կամ լվանալ ջրով կամ լուծիչով (կախված աշխատանքային միջավայրից)։ Իրենց ամրության շնորհիվ ուլտրաձայնային սարքերի տեխնիկական սպասարկման կարիքը գրեթե աննշան է։
Ուլտրաձայնային լիզիս և բջիջների քայքայում
Ընդհանուր առմամբ, լաբորատորիայում նմուշների լիզիսը տևում է 15 վայրկյանից մինչև 2 րոպե։ Քանի որ ուլտրաձայնային մշակման ինտենսիվությունը շատ հեշտ է կարգավորել ամպլիտուդը և ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը սահմանելով, ինչպես նաև ճիշտ սարքավորում ընտրելով, հնարավոր է բջջաթաղանթները քայքայել շատ մեղմ կամ շատ կտրուկ՝ կախված բջջի կառուցվածքից և լիզիսի նպատակից (օրինակ՝ ԴՆԹ-ի էքստրակցիան պահանջում է ավելի մեղմ ուլտրաձայնային մշակում, իսկ բակտերիաներից սպիտակուցների ամբողջական էքստրակցիան՝ ավելի ինտենսիվ ուլտրաձայնային մշակում)։ Գործընթացի ընթացքում ջերմաստիճանը կարելի է հսկել ներկառուցված ջերմաստիճանի տվիչով և հեշտությամբ կառավարել սառեցմամբ (սառցային բաղնիք կամ սառեցնող պատյաններով հոսքային բջիջներ) կամ իմպուլսային ռեժիմով ուլտրաձայնային մշակմամբ։ Իմպուլսային ռեժիմով ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում 1–15 վայրկյան տևողությամբ ուլտրաձայնային ազդեցության կարճ պարբերաշրջանները հնարավորություն են տալիս ավելի երկար միջանկյալ դադարների ընթացքում ցրել ջերմությունը և ապահովել սառեցում։
Ուլտրաձայնով իրականացվող բոլոր գործընթացները լիովին վերարտադրելի են և ենթակա են գծային մասշտաբավորման։
VialTweeter-ը ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր է՝ բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա, միատեսակ և արագ ստերիլ նախապատրաստման համար։
- Բջջային կախույթի պատրաստում. բջջային նստվածքները պետք է հոմոգենիզացմամբ ամբողջությամբ կախույթացվեն բուֆերային լուծույթում (ընտրեք հետագա վերլուծության, օրինակ՝ քրոմատագրության որոշակի մեթոդի հետ համատեղելի բուֆերային լուծույթ)։ Անհրաժեշտության դեպքում ավելացրեք լիզոցիմներ և/կամ այլ հավելանյութեր (դրանք նույնպես պետք է համատեղելի լինեն բաժանման/մաքրման միջոցների հետ)։ Մեղմ ուլտրաձայնային մշակման պայմաններում զգուշորեն խառնեք/հոմոգենիզացրեք լուծույթը՝ մինչև ամբողջական կախույթացում։
Կարդացեք ավելին ուլտրաձայնային մշակման հետ համակցված լիզոցիմների սիներգիկ ազդեցությունների մասին։ - Ուլտրաձայնային լիզիս. նմուշը տեղադրեք սառցային բաղնիքում։ Բջիջները քայքայելու համար կախույթը մշակեք ուլտրաձայնով՝ 60–90 վայրկյան տևողությամբ պոռթկումներով (օգտագործելով ձեր ուլտրաձայնային սարքի իմպուլսային ռեժիմը)։
- Բաժանում. ցենտրիֆուգեք լիզատը (օրինակ՝ 10 min.՝ 10 000 x g պայմաններում, 4degC ջերմաստիճանում)։ Վերնստվածքային հեղուկը զգուշորեն առանձնացրեք բջջային նստվածքից։ Վերնստվածքային հեղուկը բջջի ամբողջական լիզատն է։ Վերնստվածքային հեղուկը ֆիլտրելուց հետո ստանում եք բջջի լուծելի սպիտակուց պարունակող պարզեցված հեղուկ։
Կենսաբանության և կենսատեխնոլոգիայի ոլորտներում ուլտրաձայնային սարքերի ամենատարածված կիրառություններն են.
- Բջջային էքստրակտի պատրաստում
- Խմորասնկերի, բակտերիաների, բուսական բջիջների, փափուկ կամ կարծր բջջային հյուսվածքի, նուկլեինային նյութի քայքայում
- Սպիտակուցների էքստրակցիա
- Ֆերմենտների պատրաստում և մեկուսացում
- Հակածինների արտադրություն
- ԴՆԹ-ի էքստրակցիա և/կամ նպատակային ֆրագմենտացում
- Լիպոսոմների պատրաստում
Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքով բջիջների քայքայումը նմուշների նախապատրաստման արդյունավետ մեթոդ է։
Ուլտրաձայնի բազմաբնույթ կիրառությունները տարածվում են կենսատեխնոլոգիայի, կենսաճարտարագիտության, մանրէաբանության, մոլեկուլային կենսաբանության, կենսաքիմիայի, իմունաբանության, բակտերիաբանության, վիրուսաբանության, պրոտեոմիկայի, գենետիկայի, ֆիզիոլոգիայի, բջջաբանության, արյունաբանության և բուսաբանության ոլորտներում։
Լիզիս. բջջային կառուցվածքների քայքայում
Բջիջները պաշտպանված են կիսաթափանցելի պլազմային թաղանթով, որը կազմված է ֆոսֆոլիպիդային երկշերտից (նաև՝ սպիտակուցալիպիդային երկշերտից, որը ձևավորվում է հիդրոֆոբ լիպիդներից և հիդրոֆիլ ֆոսֆորի մոլեկուլներից՝ դրանցում ներդրված սպիտակուցային մոլեկուլներով) և պատնեշ է ստեղծում բջջի ներքին միջավայրի (ցիտոպլազմայի) ու արտաբջջային միջավայրի միջև։ Բուսական և պրոկարիոտ բջիջները շրջապատված են բջջապատով։ Ցելյուլոզից կազմված բազմաշերտ հաստ բջջապատի պատճառով բուսական բջիջներն ավելի դժվար են ենթարկվում լիզիսի, քան կենդանական բջիջները։ Բջջի ներքին կառուցվածքները, ինչպիսիք են օրգանելները, կորիզը և միտոքոնդրիումը, կայունացվում են բջջակմախքի միջոցով։
Բջիջների լիզիսի նպատակն է արդյունահանել և առանձնացնել օրգանելները, սպիտակուցները, DNA-ն, mRNA-ն կամ այլ կենսամոլեկուլներ։
Բջիջների լիզիսի ավանդական մեթոդները և դրանց թերությունները
Բջիջների լիզիսի մի քանի մեթոդ կա, որոնք կարելի է բաժանել մեխանիկական և քիմիական մեթոդների։ Դրանք ներառում են դետերգենտների կամ լուծիչների օգտագործումը, բարձր ճնշման կիրառումը կամ գնդիկավոր աղացի կամ ֆրանսիական մամլիչի օգտագործումը։ Այս մեթոդների ամենախնդրահարույց թերությունը գործընթացի պարամետրերի և, հետևաբար, ազդեցության վերահսկման ու կարգավորման դժվարությունն է։
Ստորև բերված աղյուսակը ներկայացնում է լիզիսի տարածված մեթոդների հիմնական թերությունները․
Աղյուսակ․ բջիջների լիզիսի ավանդական մեթոդներն ունեն էական թերություններ
Լիզիսի ընթացակարգը
Լիզիսը զգայուն գործընթաց է։ Լիզիսի ընթացքում բջջաթաղանթի պաշտպանությունը քայքայվում է, սակայն պետք է կանխել արդյունահանված սպիտակուցների ապաակտիվացումը, բնափոխումն ու քայքայումը ոչ ֆիզիոլոգիական միջավայրի պատճառով (pH-ի արժեքից շեղում)։ Ուստի լիզիսը սովորաբար իրականացվում է բուֆերային լուծույթում։ Դժվարությունների մեծ մասն առաջանում է բջիջների չվերահսկվող քայքայումից, որը հանգեցնում է ամբողջ ներբջջային նյութի ոչ նպատակային ազատմանը և/կամ թիրախային արտադրանքի բնափոխմանը։
Ուլտրաձայնային մշակման և բջիջների լիզիսի մասին հաճախ տրվող հարցեր
- Հնարավո՞ր է բջիջները ենթարկել լիզիսի ուլտրաձայնային մշակմամբ։ Այո՛, ուլտրաձայնային մշակումն արդյունավետորեն լիզիսի է ենթարկում բջիջները՝ օգտագործելով բարձր հաճախականության ուլտրաձայնային ալիքներ, որոնք առաջացնում են կավիտացիա՝ երևույթ, որի ընթացքում բջջային կախույթի ներսում ձևավորվում են գոլորշու մանր պղպջակներ և ուժգին փլուզվում։ Առաջացող մեխանիկական ուժերը քայքայում են բջջաթաղանթները և նպաստում ներբջջային բաղադրիչների ազատմանը հեղուկի մեջ։
- Ինչպե՞ս օգտագործել ուլտրաձայնային սարքը բջիջների լիզիսի համար։ Բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային սարքի օգտագործումը ներառում է սարքի զոնդը բջջային կախույթի մեջ ընկղմելը և այնպիսի պարամետրերի կարգավորումը, ինչպիսիք են ամպլիտուդը և իմպուլսի տևողությունը։ Գործընթացը պետք է ուշադիր վերահսկել՝ բջիջների քայքայումն օպտիմալացնելու և միաժամանակ սպիտակուցների բնափոխումն ու ֆերմենտների ապաակտիվացումը նվազագույնի հասցնելու համար։
- Ո՞րն է բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակման սկզբունքը։ Ուլտրաձայնային մշակումը գործում է ակուստիկ կավիտացիայի սկզբունքով։ Ուլտրաձայնային էներգիան փոխանցվում է հեղուկ միջավայրին՝ առաջացնելով ճնշման արագ տատանումներ, որոնք հանգեցնում են միկրոպղպջակների ձևավորմանն ու ներպայթյունային փլուզմանը։ Այս փլուզումներն առաջացնում են ինտենսիվ սահքային ուժեր և տեղային բարձր ջերմաստիճաններ՝ քայքայելով բջջային կառուցվածքները և բարձրացնելով լիզատի համասեռությունը։
- Որքա՞ն է տևում բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակումը։ Բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը կարող է զգալիորեն տարբերվել՝ կախված այնպիսի գործոններից, ինչպիսիք են բջջի տեսակը, բջիջների խտությունը, ուլտրաձայնային սարքի հզորությունը և կիրառվող կոնկրետ արձանագրությունը։ Սովորական ընթացակարգերը կարող են տևել մի քանի վայրկյանից մինչև մի քանի րոպե և հաճախ իրականացվում են ցիկլերով՝ ջերմության առաջացումը կառավարելու և բջիջների միատեսակ քայքայումն ապահովելու համար։
- Ո՞րն է ուլտրաձայնային մշակման նպատակը սպիտակուցների արդյունահանման ժամանակ։ Սպիտակուցների արդյունահանման ժամանակ ուլտրաձայնային մշակումը ծառայում է բջջաթաղանթներն արդյունավետորեն պատռելուն և սպիտակուցները լուծելի վիճակի բերելուն։ Այս մեթոդը հատկապես օգտակար է ներբջջային բաժանմունքներից սպիտակուցներն ազատելու համար, ինչի շնորհիվ այն էական նշանակություն ունի այն լիզատների պատրաստման համար, որոնցից սպիտակուցները պետք է մաքրվեն կամ վերլուծվեն։
- Ինչո՞ւ է ուլտրաձայնային մշակումն օգտագործվում արդյունահանման համար։ Արդյունահանման համար ուլտրաձայնային մշակմանը նախապատվություն է տրվում դրա արագ ներգործության և էներգիան նպատակային կիրառելու ունակության շնորհիվ․ այն քայքայում է բջջային կառուցվածքները՝ կենսաակտիվ մոլեկուլներն ազատելու համար՝ առանց կոշտ քիմիական մշակումների կիրառման՝ այդպիսով պահպանելով արդյունահանված միացությունների գործառութային ամբողջականությունը։
- Արդյո՞ք ուլտրաձայնային մշակումը խախտում է սպիտակուց–սպիտակուց փոխազդեցությունները։ Թեև ուլտրաձայնային մշակումը կարող է արդյունավետորեն քայքայել բջջաթաղանթները, այն կարող է նաև խախտել սպիտակուց–սպիտակուց փոխազդեցությունները։ Խախտման աստիճանը կախված է ուլտրաձայնային մշակման ինտենսիվությունից և ազդեցության տևողությունից և կարող է հանգեցնել սպիտակուցային համալիրների բնափոխման կամ դիսոցման, ինչը կարող է ազդել հետագա վերլուծական կամ ֆունկցիոնալ հետազոտությունների վրա։
- Կարելի՞ է ուլտրաձայնային մշակումն օգտագործել E. coli-ի լիզիսի համար։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հատկապես արդյունավետ են ամուր բջջապատեր ունեցող բակտերիալ բջիջների, օրինակ՝ E. coli-ի լիզիսի համար։ Այս տեխնիկան ապահովում է բջջապատը և թաղանթը սահքային ուժերով խզելու ֆիզիկական մեթոդ, ինչն այն դարձնում է նախընտրելի մեթոդ մոլեկուլային կենսաբանության և կենսաքիմիայի լաբորատորիաներում բակտերիալ լիզատների պատրաստման համար։
- Ի՞նչ հետագա գործընթացներ են հաջորդում ուլտրաձայնային մշակման փուլին։
Ուլտրաձայնային լիզիսից հետո հետագա փուլերը սովորաբար ներառում են լիզատի ֆրակցիոնացումը, օրգանոիդների նպատակային առանձնացումը և սպիտակուցների հետագա արդյունահանումը կամ մաքրումը։
Այնուհետև մշակված լիզատը բաժանվում և պատրաստվում է վերլուծական կամ ֆունկցիոնալ կիրառությունների համար, ինչպիսիք են բարձր լուծաչափով պրոտեոմիկան, տրանսկրիպտոմիկան կամ ընկալիչների հետ կապման ուսումնասիրությունները։
Գրականություն/Հղումներ
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.