Բջջային լիզիզի համար բջջային ախտահանում. բջիջների խանգարում և արդյունահանում
Ուլտրաձայնային բջիջների լիզը նմուշի պատրաստման ընթացակարգ է կենսատեխնոլոգիական լաբորատորիաներում: Նպատակն է խաթարել բջջային պատերը կամ ամբողջ բջիջները՝ կենսաբանական մոլեկուլներ ազատելու համար: Sonication-ը սովորաբար օգտագործվում է բջիջների լիզման, բջիջների կազմալուծման և արդյունահանման համար: Բջիջների լիզման համար sonicators-ի հիմնական առավելությունը կայանում է գործընթացի պարամետրերի ճշգրիտ վերահսկման մեջ, ինչպիսիք են ինտենսիվությունը և ջերմաստիճանը, ինչը թույլ է տալիս մեղմ, բայց արդյունավետ բջիջների խզումը և արդյունահանումը:
Բջջային լիզիս՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային հետազոտություն
Ուլտրաձայնային բջիջների լիզիսում օգտագործվում են բարձր հաճախականության ձայնային ալիքներ՝ բաց բջիջները կոտրելու և դրանց պարունակությունը հանելու համար: Sonication-ը հաստատված և հուսալի է ներբջջային նյութի բջիջների խախտման և արդյունահանման համար, ինչպիսիք են պլազմիդները, ընկալիչների վերլուծությունները, սպիտակուցները, ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն: Գործընթացի պարամետրերը կարգավորելով՝ ուլտրաձայնային ինտենսիվությունը կարող է մանրակրկիտ կարգավորվել՝ բավարարելու կիրառման հատուկ պահանջները՝ սկսած նուրբից մինչև ինտենսիվ հնչյունավորում: Լիզիզին հաջորդող քայլերը ներառում են ֆրակցիան, օրգանելների մեկուսացում և սպիտակուցի արդյունահանում և մաքրում: Ստացված լիզատը պետք է առանձնացվի հետագա հետազոտությունների կամ կիրառման համար, ինչպիսիք են պրոտեոմիկ հետազոտությունները:
Եթե ցանկանում եք ավելին իմանալ լիզիսի, բջիջների խզման և արդյունահանման համար sonication-ի մասին, խնդրում ենք կապվել մեզ հետ: Մեր տեխնիկական թիմը ուրախ կլինի աշխատել ձեզ հետ ձեր բջիջների լիզինգի նախագծի վրա:
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ UP100H (100 վտ) և UP400St (400 վտ). Բջջային լուծույթի և արդյունահանման համար Sonication:
Բջջային լիզիսի համար Sonication-ի օգտագործման առավելությունները
Բջջի լիզի և արդյունահանման այլ մեթոդների համեմատ, ուլտրաձայնային բջիջների լիզումն ունի մի քանի առավելություն.
- Արագություն: Ուլտրաձայնային բջիջների լիզումը և արդյունահանումը արագ մեթոդ է, որը կարող է կոտրել բաց բջիջները մի քանի վայրկյանում: Սա շատ ավելի արագ է, քան մյուս մեթոդները, ինչպիսիք են համասեռացումը, սառեցման-հալեցումը կամ բշտիկ-ֆրեզումը:
- Արդյունավետություն: Ուլտրաձայնային բջիջների լիզը և արդյունահանումը կարող են օգտագործվել փոքր, մեծ կամ մի քանի նմուշներ միանգամից բուժելու համար՝ դարձնելով այն ավելի արդյունավետ, քան մյուս մեթոդները, որոնք պահանջում են փոքր նմուշների անհատական մշակում:
- Առանց քիմիական նյութերիՈւլտրաձայնային բջիջների լիզը և արդյունահանումը ոչ ինվազիվ մեթոդ է, որը չի պահանջում կոշտ քիմիական նյութերի կամ ֆերմենտների օգտագործում: Սա այն դարձնում է իդեալական այն ծրագրերի համար, որտեղ անհրաժեշտ է պահպանել բջջային բովանդակության ամբողջականությունը: Հնարավոր է խուսափել նմուշների անցանկալի աղտոտումից:
- Բարձր եկամտաբերություն. Ուլտրաձայնային բջիջների լիզումը և արդյունահանումը կարող են արդյունահանել բջջային բովանդակության բարձր եկամտաբերություն, ներառյալ ԴՆԹ, ՌՆԹ և սպիտակուցներ: Դա պայմանավորված է նրանով, որ բարձր հաճախականությամբ ձայնային ալիքները կոտրում են բջջային պատերը և պարունակությունը թողնում շրջակա լուծույթի մեջ:
- Ջերմաստիճանի վերահսկում. Բարդ ուլտրաձայնային սարքերը թույլ են տալիս ճշգրիտ վերահսկել նմուշի ջերմաստիճանը: Hielscher թվային ձայնային սարքերը հագեցած են խցանվող ջերմաստիճանի սենսորով և ջերմաստիճանի մոնիտորինգի ծրագրային ապահովմամբ:
- Վերարտադրելի: Ուլտրաձայնային բջիջների լիզիզի արձանագրությունները կարող են հեշտությամբ վերարտադրվել և նույնիսկ համապատասխանեցնել տարբեր մեծ կամ փոքր նմուշների ծավալներին պարզ գծային մասշտաբով:
- Բազմակողմանի: Ուլտրաձայնային բջիջների լիզը և արդյունահանումը կարող են օգտագործվել բջիջների տեսակների լայն շրջանակ հանելու համար, ներառյալ բակտերիաները, խմորիչները, սնկերը, բույսերը և կաթնասունների բջիջները: Այն կարող է օգտագործվել նաև տարբեր տեսակի մոլեկուլների, այդ թվում՝ սպիտակուցների, ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և լիպիդների արդյունահանման համար:
- Բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա պատրաստում. Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է մի քանի լուծումներ բազմաթիվ նմուշների հարմարավետ մշակման համար ճիշտ նույն գործընթացի պայմաններում: Սա դարձնում է լիզի և արդյունահանման նմուշի պատրաստման փուլը բարձր արդյունավետ և ժամանակի խնայողություն:
- Հեշտ է օգտագործել: Ուլտրաձայնային բջիջների լիզման և արդյունահանման սարքավորումները հեշտ է օգտագործել և պահանջում են նվազագույն ուսուցում: Սարքավորումը նաև տնտեսապես է, քանի որ այն մեկ ներդրում է, առանց հեռացման վերագնման պահանջի: Սա այն գրավիչ է դարձնում հետազոտողների և լաբորատորիաների լայն շրջանակի համար:
Ընդհանուր առմամբ, ուլտրաձայնային բջիջների լիզումը և արդյունահանումը արագ, արդյունավետ, ճշգրիտ վերահսկելի և բազմակողմանի մեթոդ է բջջային բովանդակությունը հանելու համար: Դրա առավելությունները այլընտրանքային մեթոդների նկատմամբ այն գրավիչ ընտրություն են դարձնում հետազոտական և արդյունաբերական կիրառությունների լայն շրջանակի համար:
Ուլտրաձայնային բջիջների լիզիսի աշխատանքային սկզբունքը
Ուլտրաձայնային բջիջների լիզումը և արդյունահանումը օգտագործում են բարձր հաճախականության ձայնային ալիքներ՝ բջիջները խափանելու և դրանց պարունակությունը հանելու համար: Ձայնային ալիքները ճնշման փոփոխություններ են առաջացնում շրջակա հեղուկում, ինչը հանգեցնում է փոքր փուչիկների ձևավորմանը և փլուզմանը, որը հայտնի է որպես կավիտացիա: Այս փուչիկները առաջացնում են տեղայնացված, բարձր ինտենսիվ մեխանիկական ուժեր, որոնք կարող են կոտրել բաց բջիջները և ազատել դրանց պարունակությունը շրջակա լուծույթի մեջ:
Ուլտրաձայնային սարքի միջոցով բջիջների լիզումը սովորաբար ներառում է հետևյալ քայլերը.
- Նմուշը տեղադրվում է հեղուկ բուֆերով խողովակի կամ տարայի մեջ:
- Նմուշի մեջ տեղադրվում է ուլտրաձայնային զոնդ, և բարձր հաճախականությամբ ձայնային ալիքները մոտ. Կիրառվում են 20-30 կՀց:
- Ուլտրաձայնային ալիքները շրջակա հեղուկում առաջացնում են տատանումներ և կավիտացիա՝ առաջացնելով տեղայնացված ուժեր, որոնք կոտրում են բաց բջիջները և ազատում դրանց պարունակությունը։
- Նմուշը ցենտրիֆուգվում կամ ֆիլտրվում է բջջային բեկորները հեռացնելու համար, իսկ արդյունահանված պարունակությունը հավաքվում է ներքևում գտնվող վերլուծության համար:
Ուլտրաձայնային հզոր ալիքները խախտում են կենսաբանական կառուցվածքների բջիջների մատրիցը և ազատում կենսաակտիվ միացությունները: Զանգվածի փոխանցումը բուսանյութի և լուծիչի (օրինակ՝ բուֆերի) միջև ուժեղանում է։ (գրաֆիկ՝ ©Vilkhu et al., 2006)
Լիզիսի ընդհանուր մեթոդների թերությունները
Լաբորատորիաներում ձեր աշխատանքի ընթացքում դուք, հավանաբար, արդեն զգացել եք բջիջների լիզի դժվարությունը՝ օգտագործելով ավանդական մեխանիկական կամ քիմիական լիզի արձանագրությունները:
- Մեխանիկական լուծ. Լիզայի մեխանիկական մեթոդները, ինչպիսիք են հավանգով և նեխուրով հղկելը կամ միատարրացումը ֆրանսիական մամլիչով, ուլունքների աղացով կամ ռոտոր-ստատոր համակարգով, հաճախ զուրկ են ճշգրիտ հսկողության և ճշգրտման տարբերակներից: Սա նշանակում է, որ ֆրեզերային և հղկման օգտագործումը կարող է արագ առաջացնել ջերմություն և կտրող ուժեր, որոնք կարող են վնասել նմուշը և դենատուրացնել սպիտակուցները: Դրանք կարող են նաև ժամանակատար լինել և մեծ քանակությամբ սկզբնական նյութ պահանջել:
- Քիմիական lysis: Քիմիական լիզի մեթոդները, ինչպիսիք են լվացող միջոցների վրա հիմնված լիզիսը, կարող են վնասել նմուշը՝ խաթարելով լիպիդային երկշերտը և դենատուրացնելով սպիտակուցները: Նրանք կարող են նաև պահանջել մի քանի քայլեր և կարող են թողնել մնացորդային աղտոտիչներ, որոնք խանգարում են հոսանքով ներքև գտնվող ծրագրերին: Լվացող միջոցի օպտիմալ չափաբաժին գտնելը լրացուցիչ խնդիր է:
- Սառեցման-հալման ցիկլեր. Սառեցման-հալման ցիկլերը կարող են առաջացնել բջջային թաղանթների պատռում, բայց կրկնվող ցիկլերը կարող են նաև առաջացնել սպիտակուցի դենատուրացիա և դեգրադացիա: Այս մեթոդը կարող է նաև պահանջել մի քանի ցիկլեր, որոնք կարող են ժամանակատար լինել և հաճախ ավելի ցածր եկամտաբերություն ունենալ:
- Ֆերմենտային lysis: Ֆերմենտային լիզի մեթոդները կարող են հատուկ լինել բջիջների որոշակի տեսակների համար և պահանջում են մի քանի քայլեր՝ դրանք դարձնելով ժամանակատար: Նրանք նաև առաջացնում են թափոններ և պահանջում են մանրակրկիտ օպտիմալացում՝ նմուշի դեգրադացիան խուսափելու համար: Ֆերմենտային լիզի փաթեթները հաճախ թանկ են: Եթե ձեր ընթացիկ ֆերմենտային լիզի պրոցեդուրան տալիս է անբավարար արդյունքներ, ապա սիներգետիկ մեթոդը կարող է կիրառվել բջիջների խանգարումն ուժեղացնելու համար:
Ի տարբերություն սովորական մեխանիկական և քիմիական բջիջների լուծարման մեթոդների, sonication-ը բջիջների տարրալուծման համար շատ արդյունավետ և հուսալի գործիք է, որը թույլ է տալիս ամբողջական վերահսկել sononication պարամետրերը: Սա ապահովում է նյութերի ազատման և արտադրանքի մաքրության բարձր ընտրողականություն: [տես. Բալասունդարամ և այլք, 2009]
Այն հարմար է բոլոր տեսակի բջիջների համար և հեշտությամբ կիրառելի է փոքր և մեծ մասշտաբով – միշտ վերահսկվող պայմաններում։ Ուլտրաձայնային սարքերը հեշտ է մաքրել: Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորը միշտ ունի մաքուր տեղում (CIP) և ստերիլիզացման (SIP) գործառույթ: Սոնոտրոդը բաղկացած է հսկայական տիտանի եղջյուրից, որը կարելի է սրբել կամ լվանալ ջրի կամ լուծիչի մեջ (կախված աշխատանքային միջավայրից): Ուլտրաձայնային սարքերի սպասարկումը պայմանավորված է նրանց ամրությամբ, որը գրեթե անտեսվում է:
Ուլտրաձայնային լիզի և բջիջների խանգարում
Ընդհանուր առմամբ, լաբորատորիայում նմուշների լիզումը կտևի 15 վայրկյանից մինչև 2 րոպե: Քանի որ ձայնային ազդանշանի ինտենսիվությունը շատ հեշտ է կարգավորվում՝ ամպլիտուդային սահմանելով ձայնային արձակման ժամանակը, ինչպես նաև ընտրելով ճիշտ սարքավորում, հնարավոր է բջջային թաղանթները շատ մեղմ կամ շատ կտրուկ խանգարել՝ կախված բջջի կառուցվածքից և լիզի նպատակից ( օրինակ՝ ԴՆԹ-ի արդյունահանումը պահանջում է ավելի մեղմ ձայնային ախտահանում, բակտերիաների ամբողջական սպիտակուցային արդյունահանումը պահանջում է ավելի ինտենսիվ ուլտրաձայնային բուժում): Ընթացքի ընթացքում ջերմաստիճանը կարող է վերահսկվել ինտեգրված ջերմաստիճանի սենսորով և հեշտությամբ վերահսկվել սառեցման միջոցով (սառցե բաղնիք կամ հոսող բջիջներ սառեցնող բաճկոններով) կամ իմպուլսային ռեժիմում ձայնային ազդանշանի միջոցով: Զարկերակային ռեժիմում հնչյունավորման ընթացքում 1-15 վայրկյան տևողությամբ կարճ ձայնային պոռթկումային ցիկլերը թույլ են տալիս ջերմության ցրում և սառչում ավելի երկար ընդհատվող ժամանակահատվածներում:
Բոլոր ուլտրաձայնային գործընթացները լիովին վերարտադրելի են և գծային մասշտաբային:
The VialTweeter ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր է բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա, միատեսակ և արագ ստերիլ պատրաստման համար:
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ բջիջների լիզի և արդյունահանման համար
Ուլտրաձայնային սարքերի տարբեր տեսակներ թույլ են տալիս համապատասխանել նմուշի պատրաստման նպատակին և ապահովել օգտատիրոջ հարմարավետությունն ու շահագործման հարմարավետությունը: Զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերը լաբորատորիայում ամենատարածված սարքերն են: Դրանք առավել հարմար են 0,1 մլ-ից մինչև 1000 մլ ծավալներով փոքր և միջին չափի նմուշների պատրաստման համար: Տարբեր հզորության չափերը և sonotrodes-ը թույլ են տալիս ուլտրաձայնային սարքը հարմարեցնել նմուշի ծավալին և նավին առավել արդյունավետ և արդյունավետ sonicating արդյունքների համար: Ուլտրաձայնային զոնդ սարքը լավագույն ընտրությունն է, երբ պետք է պատրաստվեն առանձին նմուշներ:
Եթե պետք է ավելի շատ նմուշներ պատրաստվեն, օրինակ՝ բջջային լուծույթի 8-10 սրվակ, ինտենսիվ անուղղակի հնչյունավորումը ուլտրաձայնային համակարգերով, ինչպիսին է VialTweeter-ը կամ ուլտրաձայնային գավաթը, միատարրացման ամենահարմար մեթոդն է արդյունավետ լիզի համար: Մի քանի սրվակներ միաժամանակ ձայնագրվում են նույն ինտենսիվությամբ: Սա խնայում է ոչ միայն ժամանակ, այլ նաև ապահովում է բոլոր նմուշների նույն վերաբերմունքը, ինչը նմուշների միջև արդյունքները դարձնում է հուսալի և համեմատելի: Ավելին, անուղղակի ձայնային ախտահանման ժամանակ խուսափում են խաչաձև աղտոտումից՝ ընկղմելով ուլտրաձայնային սոնոտրոդը (նաև հայտնի է որպես ուլտրաձայնային զոնդ, եղջյուր, ծայր կամ մատ): Քանի որ օգտագործվում են առանձին նմուշի չափի համապատասխան սրվակներ, ժամանակատար մաքրումը և նմուշի կորուստը անոթների տարանջատման պատճառով բաց են թողնվում: Բազմաբխի կամ միկրոտիտրային թիթեղների միատեսակ արտահոսքի համար Hielscher-ն առաջարկում է UIP400MTP:
Ավելի մեծ ծավալների համար, օրինակ՝ բջջային քաղվածքների առևտրային արտադրության համար, առավել հարմար են հոսքային բջջային ռեակտորով շարունակական ուլտրաձայնային համակարգերը: Մշակված նյութի շարունակական և համաչափ հոսքը ապահովում է հավասարաչափ ձայնային ազդեցություն: Ուլտրաձայնային տարրալուծման գործընթացի բոլոր պարամետրերը կարող են օպտիմիզացվել և ճշգրտվել հավելվածի և կոնկրետ բջջային նյութի պահանջներին:
Բակտերիալ բջիջների ուլտրաձայնային լիզինգի օրինակելի ընթացակարգ.
- Բջջային կասեցման պատրաստում. Բջջային գնդիկները պետք է ամբողջությամբ կասեցվեն բուֆերային լուծույթում` համասեռացման միջոցով (ընտրեք ձեր բուֆերային լուծույթը, որը համապատասխանում է հետևյալ վերլուծություններին, օրինակ` հատուկ քրոմատոգրաֆիայի մեթոդին): Անհրաժեշտության դեպքում ավելացրեք լիզոզիմներ և/կամ այլ հավելումներ (դրանք պետք է նաև համատեղելի լինեն տարանջատման/մաքրման միջոցների հետ): Խառնել/միատարրացնել լուծույթը մեղմ ձայնային ազդեցության տակ մինչև ամբողջական կասեցումը ձեռք բերելը:
- Ուլտրաձայնային լուծույթ. Նմուշը դրեք սառցե լոգարանում: Բջիջների խանգարման դեպքում կախոցը 60-90 վայրկյանի ընթացքում հնչյունավորեք (օգտագործելով ձեր ձայնային սարքի իմպուլսային ռեժիմը):
- Տարանջատում. ցենտրիֆուգեք լիզատը (օր. 10 րոպե 10000 xg-ում, 4°C ջերմաստիճանում): Զգուշորեն առանձնացրեք վերին նյութը բջջի գնդիկից: Սուպերնատանտը բջիջների ընդհանուր լիզատն է: Վերևի ֆիլտրումից հետո դուք ստանում եք լուծվող բջջային սպիտակուցի հստակեցված հեղուկ:
Կենսաբանության և կենսատեխնոլոգիայի ուլտրաձայնային սարքերի ամենատարածված կիրառությունները հետևյալն են.
- Բջջի էքստրակտի պատրաստում
- Խմորիչի, բակտերիաների, բուսական բջիջների, փափուկ կամ կոշտ բջջային հյուսվածքի, նուկլեինային նյութի խախտում
- սպիտակուցի արդյունահանում
- Ֆերմենտների պատրաստում և մեկուսացում
- Անտիգենների արտադրություն
- ԴՆԹ-ի արդյունահանում և/կամ նպատակային մասնատում
- լիպոսոմային պատրաստում
Բջիջների խափանումը զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքով նմուշի պատրաստման արդյունավետ մեթոդ է:
Ստորև բերված աղյուսակը ձեզ տալիս է ակնարկ մեր ուլտրաձայնային սարքերի վերաբերյալ բջիջների խզման և արդյունահանման համար: Կտտացրեք սարքի տեսակի վրա՝ յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորի մասին լրացուցիչ տեղեկություններ ստանալու համար: Մեր լավ պատրաստված և երկար տարիների փորձ ունեցող տեխնիկական անձնակազմը ուրախ կլինի օգնել ձեզ ընտրել ձեր նմուշների համար ամենահարմար ուլտրաձայնային սարքը:
| Խմբաքանակի ծավալը | Հոսքի արագություն | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| մինչև 10 սրվակ կամ խողովակ | ԱԺ | VialTweeter |
| բազմաբնակարան / միկրոտիտրային թիթեղներ | ԱԺ | UIP400MTP |
| մի քանի խողովակներ / անոթներ | ԱԺ | բաժակի եղջյուր |
| 1-ից 500 մլ | 10-ից 200 մլ / րոպե | UP100H |
| 10-ից 1000 մլ | 20-ից 200 մլ / րոպե | UP200Ht, UP200 St |
| 10-ից 2000 մլ | 20-ից 400 մլ / րոպե | UP400 Փ |
Ուլտրաձայնի բազմակողմանի կիրառությունները ճյուղավորվում են կենսատեխնոլոգիայի, կենսաճարտարագիտության, մանրէաբանության, մոլեկուլային կենսաբանության, կենսաքիմիայի, իմունոլոգիայի, մանրէաբանության, վիրուսաբանության, պրոտեոմիկայի, գենետիկայի, ֆիզիոլոգիայի, բջջային կենսաբանության, հեմատոլոգիայի և բուսաբանության ոլորտներում:
Լիզիս. Բջջային կառուցվածքների խախտում
Բջիջները պաշտպանված են կիսաթափանցիկ պլազմային թաղանթով, որը բաղկացած է ֆոսֆո-լիպիդային երկշերտից (նաև սպիտակուց-լիպիդային երկշերտ, որը ձևավորվում է հիդրոֆոբ լիպիդներով և հիդրոֆիլ ֆոսֆորի մոլեկուլներով՝ ներկառուցված սպիտակուցի մոլեկուլներով) և ստեղծում է խոչընդոտ բջջի ներսի և ցիտոպլազմայի միջև: արտաբջջային միջավայրը. Բուսական բջիջները և պրոկարիոտային բջիջները շրջապատված են բջջային պատով։ Ցելյուլոզայի մի քանի շերտերի հաստ բջջային պատի պատճառով բույսերի բջիջները ավելի դժվար են լուծվում, քան կենդանական բջիջները: Բջջի ինտերիերը, ինչպիսիք են օրգանելները, միջուկը, միտոքոնդրիոնը, կայունացվում են ցիտոկմախքի միջոցով:
Բջիջները լիզելով՝ այն ուղղված է օրգանելների, սպիտակուցների, ԴՆԹ-ի, mRNA-ի կամ այլ կենսամոլեկուլների արդյունահանմանը և տարանջատմանը։
Բջիջների լիզիսի սովորական մեթոդները և դրանց թերությունները
Բջիջների լիզացիայի մի քանի մեթոդներ կան, որոնք կարելի է բաժանել մեխանիկական և քիմիական մեթոդների, որոնք ներառում են լվացող միջոցների կամ լուծիչների օգտագործումը, բարձր ճնշման կիրառումը կամ ուլունքների աղացման կամ ֆրանսիական մամուլի օգտագործումը: Այս մեթոդների ամենախնդրահարույց թերությունը գործընթացի պարամետրերի և դրանով իսկ ազդեցության դժվար վերահսկումն ու ճշգրտումն է:
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս լիզինգի ընդհանուր մեթոդների հիմնական թերությունները.
Աղյուսակ. Բջիջների լիզի սովորական մեթոդներն ունեն հիմնական թերություններ
Լիզիսի կարգը
Լիզը զգայուն գործընթաց է: Լիզի ընթացքում բջիջների մեմբրանի պաշտպանությունը ոչնչացվում է, սակայն պետք է կանխել արդյունահանվող սպիտակուցների ապաակտիվացումը, դենատուրացիան և քայքայումը ոչ ֆիզիոլոգիական միջավայրի կողմից (pH-ի արժեքից շեղում): Հետեւաբար, ընդհանուր առմամբ lysis իրականացվում է բուֆերային լուծում. Դժվարությունների մեծ մասը առաջանում է բջիջների անվերահսկելի խանգարումից, որը հանգեցնում է ամբողջ ներբջջային նյութի աննպատակազատման կամ/և թիրախային արտադրանքի դենատուրացմանը:
Հաճախակի տրվող հարցեր Sonication-ի և Cell Lysis-ի մասին
- Հնարավո՞ր է բջիջները լիզել սոնիկացիայով: Այո, sonication-ը արդյունավետորեն լիզում է բջիջները՝ օգտագործելով բարձր հաճախականության ուլտրաձայնային ալիքներ, որոնք հրահրում են կավիտացիա, մի երևույթ, որտեղ գոլորշիների փոքրիկ փուչիկները ձևավորվում և կատաղի փլուզվում են բջջային կախոցի ներսում: Ստացված մեխանիկական ուժերը խախտում են բջջային թաղանթները և հեշտացնում ներբջջային բաղադրիչների արտազատումը հեղուկի մեջ:
- Ինչպե՞ս օգտագործել sonicator բջջային լիզի համար: Բջջի լուծարման համար ձայնային սարքի օգտագործումը ներառում է ձայնային սարքի զոնդը բջջային կախոցի մեջ ընկղմելը և պարամետրերի կարգավորումը, ինչպիսիք են ամպլիտուդը և իմպուլսի տևողությունը: Գործընթացը պետք է ուշադիր մոնիտորինգի ենթարկվի՝ բջիջների խանգարումը օպտիմալացնելու համար՝ միևնույն ժամանակ նվազագույնի հասցնելով սպիտակուցների դենատուրացիան և ֆերմենտների ապաակտիվացումը:
- Ո՞րն է բջիջների լիզիսի սինխիզացիայի սկզբունքը: Sonication-ը գործում է ակուստիկ կավիտացիայի սկզբունքով: Ուլտրաձայնային էներգիան փոխանցվում է հեղուկ միջավայր՝ առաջացնելով ճնշման արագ տատանումներ, որոնք հանգեցնում են միկրոփուչիկների առաջացմանն ու պայթեցմանը: Այս պայթյունները առաջացնում են ինտենսիվ կտրող ուժեր և տեղայնացված բարձր ջերմաստիճաններ՝ խաթարելով բջջային կառուցվածքները և ուժեղացնելով լիզատի միատարրությունը:
- Որքա՞ն ժամանակ է տևում բջիջների լիզիզի արտահոսքը: Բջիջների լիզիզի համար ձայնային արտանետման տեւողությունը կարող է զգալիորեն տարբերվել՝ կախված այնպիսի գործոններից, ինչպիսիք են բջջի տեսակը, բջջի խտությունը, ձայնային սարքի հզորությունը և օգտագործվող հատուկ արձանագրությունը: Տիպիկ պրոցեդուրաները կարող են տատանվել մի քանի վայրկյանից մինչև մի քանի րոպե, որոնք հաճախ կատարվում են ցիկլերով՝ ջերմության առաջացումը կառավարելու և բջիջների միատեսակ խախտում ապահովելու համար:
- Ո՞րն է սպիտակուցի արդյունահանման ժամանակ ձայնային ախտահանման նպատակը: Սպիտակուցների արդյունահանման ժամանակ ձայնային արտազատումը ծառայում է բջջային թաղանթների արդյունավետ պատռմանը և սպիտակուցները լուծելու համար: Այս մեթոդը հատկապես օգտակար է բջջային բաժանմունքներից սպիտակուցներ ազատելու համար, ինչը կարևոր է դարձնում լիզատների պատրաստման համար, որոնցից սպիտակուցները պետք է մաքրվեն կամ վերլուծվեն:
- Ինչու է sonication օգտագործվում է արդյունահանման. Sonication-ը նախընտրելի է արդյունահանման համար՝ շնորհիվ իր արագ գործողության և նպատակային էներգիա կիրառելու ունակության՝ քայքայելով բջջային կառուցվածքները՝ արձակելով կենսաակտիվ մոլեկուլներ՝ առանց կոշտ քիմիական պրոցեդուրաների օգտագործման՝ դրանով իսկ պահպանելով արդյունահանվող միացությունների ֆունկցիոնալ ամբողջականությունը:
- Արդյո՞ք sonication-ը խախտում է սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունը: Թեև ձայնային ազդեցությունը կարող է արդյունավետորեն խաթարել բջջային մեմբրանները, այն կարող է նաև խաթարել սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունը: Խափանման մակարդակը կախված է ձայնային արտանետման ինտենսիվությունից և ազդեցության տևողությունից, ինչը կարող է հանգեցնել սպիտակուցային բարդույթների դենատուրացիայի կամ տարանջատման, ինչը կարող է ազդել հետագա անալիտիկ կամ ֆունկցիոնալ հետազոտությունների վրա:
- Կարո՞ղ է արդյոք Sonication-ը օգտագործել E. coli-ի լիզավորման համար: Hielscher sonicators-ը հատկապես արդյունավետ է բակտերիալ բջիջների լիզինգի համար, ինչպիսին է E. coli-ն, որոնք ունեն ամուր բջջային պատեր: Տեխնիկան ապահովում է բջջային պատը և թաղանթը կտրելու ֆիզիկական մեթոդ՝ դարձնելով այն մոլեկուլային կենսաբանության և կենսաքիմիայի լաբորատորիաներում բակտերիաների լիզատների պատրաստման նախընտրելի մեթոդ:
Գրականություն/Հղումներ
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.