Արձանագրություն՝ օգտագործելով Hielscher Multi-Sample Sonicators կենսաֆիլմում և պրոտեոմիկ անալիզում
Բազմաթիվ նմուշների ձայնային սարքերի օգտագործումը, ինչպիսիք են VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ը և UIP400MTP Microplate Sonicator-ը, հեշտացնում են լաբորատոր աշխատանքային հոսքերը բարձր թողունակության ծրագրերի համար: Երկու սարքերն էլ թույլ են տալիս ճշգրիտ և միատեսակ ուլտրաձայնային մշակում բազմաթիվ նմուշների մեջ՝ նվազագույնի հասցնելով փոփոխականությունը և բարձրացնելով վերարտադրելիությունը: Սա հատկապես ձեռնտու է այն փորձերի դեպքում, որոնք պահանջում են նմուշի հետևողական լիզում, բիոֆիլմի անջատում, սպիտակուցի արդյունահանում կամ պրոտեոլիտիկ մարսում, որտեղ ձեռքով կամ մեկ նմուշի մեթոդներն ավելի քիչ արդյունավետ են և հակված են անհամապատասխանության:
Կատարելագործեք աշխատանքային հոսքերը բազմակի նմուշային Sonicators-ով
UIP400MTP-ն, օրինակ, հնարավորություն է տալիս միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակում միկրոափսե հորեր, ապահովելով միատեսակ անջատում biofilms կամ բջջային նյութի. Միևնույն ժամանակ, VialTweeter-ն առաջարկում է խողովակների մի քանի նմուշների ճշգրիտ լիզում և համասեռացում՝ առանց խաչաձեւ աղտոտման: Այս sonicators զգալիորեն նվազեցնում են մշակման ժամանակները, բարելավում են փորձարարական վերարտադրելիությունը և պահպանում են նմուշների բարձր ամբողջականությունը՝ դրանք դարձնելով անփոխարինելի գործիքներ մանրէաբանության, պրոտեոմիկայի և մոլեկուլային կենսաբանության հետազոտություններում:
Ստորև բերված է մանրամասն արձանագրություն, որը ցույց է տալիս Hielscher-ի բազմակի նմուշների ձայնագրման մոդելների, VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ի և Microplate Sonicator UIP400MTP-ի օգտագործումը E. coli-ի բիոֆիլմի ձևավորման և հետագա պրոտեոմիկ վերլուծության հետ կապված ուսումնասիրության մեջ:
Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP – նմուշի հուսալի պատրաստում բարձր թողունակությամբ
Արձանագրություն. Կենսաթաղանթի ձևավորում, անջատում և պրոտեոմային վերլուծություն՝ օգտագործելով Hielscher Multi-Sample Sonicators
1. Բակտերիալ մշակույթի պատրաստում
- E. coli բակտերիաների (շտամ W3110) կուլտուրա 30°C-ում, E. coli բիոֆիլմի ձևավորման համար բարենպաստ ջերմաստիճան, տրիպտոնային արգանակի (TB) միջավայրում, որը պարունակում է.
– 10 գ/լ տրիպտոն
– 5 գ/լ NaCl - Պլազմիդի պահպանումն ապահովելու համար անհրաժեշտության դեպքում լրացրեք հակաբիոտիկները:
- Մանրադիտակի և խթանիչի գործունեության ուսումնասիրությունների համար օգտագործեք W3110 E. coli շտամը գենոմային ուժեղացված GFP (eGFP) հաղորդիչով, որը գտնվում է rplL խթանողի հսկողության ներքո:
- Օգտագործեք GFP-ի թղթակից պլազմիդները տարբեր խթանողների համար (օրինակ. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) խթանող գործունեությունը չափելու համար:
2. Կենսաֆիլմի մշակում և անջատում
- Սերմնացրեք 1,5 մլ նոսրացված բակտերիաների կուլտուրա մեկ ջրհորի մեջ 12 ջրհորանոց ափսեի մեջ (CellStar 12 ջրհորի թիթեղներ, Greiner Bio-One):
- Ինկուբացնել՝ բիոֆիլմի ձևավորումը թույլ տալու համար:
- Զգուշորեն հեռացրեք պլանկտոնային (ոչ կպչուն) մշակույթը:
– Յուրաքանչյուր լավ լվացեք 500 μL PBS-ով:
– Անջատեք կցված բջիջները՝ UIP400MTP միկրոափսեի ձայնային սարքի 12 հորատանցքի ափսեի միջոցով: UIP400MTP-ն ապահովում է միատեսակ ջոկատ՝ ապահովելով հետևողական ուլտրաձայնային էներգիա բոլոր հորերում:
– Sonication կարգավորումներ՝ 60% ամպլիտուդ, ցիկլի ռեժիմ՝ 60 վ ON / 30 sec OFF:
3. Բջիջների հավաքում և լիզիս
- Ցենտրիֆուգեք անջատված բիոֆիլմի բջիջները 4500 գ 5 րոպեի ընթացքում:
- Լվացեք գնդիկավոր բջիջները PBS-ով:
- Բջիջները նորից կասեցրեք 100 µL 2% նատրիումի լաուրոյլ սարկոզինատում (SLS) և ինկուբացրեք 95°C-ում 15 րոպե:
- Sonicate անել՝ օգտագործելով VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ը՝ բջիջների ամբողջական լիզումն ապահովելու համար:
– Sonication կարգավորումներ. 100% ամպլիտուդ, 50 վ ON / 10 s OFF 10 րոպե ընդհանուր գործարկման ժամանակ; նմուշները պահել սառույցի վրա:
4. Կրճատում և ալկիլացում
- Դիսուլֆիդային կապերը նվազեցնելու համար ավելացրեք 5 մՄ տրիս(2-կարբոքսիէթիլ) ֆոսֆին (TCEP) և ինկուբացրեք 95°C-ում 15 րոպե:
- Ալկիլացնել սպիտակուցները 10 մՄ յոդոացետամիդով 30 րոպե 25°C-ում:
5. Սպիտակուցների քանակականացում և մարսում
- Լիզատները ցենտրիֆուգեք՝ բեկորները մաքրելու համար:
- Քանակականացրեք ընդհանուր սպիտակուցի պարունակությունը՝ օգտագործելով Pierce BCA Protein Assay Kit-ը:
- Մարսեք 50 մկգ ընդհանուր սպիտակուցը 1 մկգ տրիփսինով 2% SLS և 100 մՄ ամոնիումի բիկարբոնատ պարունակող լուծույթում:
- Ինկուբացնել մարսողության ռեակցիան գիշերվա ընթացքում 30°C-ում:
6. Պեպտիդային մաքրում
- SLS նստեցրեք՝ ավելացնելով 1,5% տրիֆտորքացախաթթու (TFA), ապա ցենտրիֆուգեք:
- Մաքրել պեպտիդները՝ օգտագործելով C18 միկրոսպին սյունակներ:
- Չորացնել մաքրված պեպտիդները և նորից կասեցնել 0,1% TFA-ում:
7. Հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-Զանգվածային սպեկտրոմետրիա (LC-MS/MS)
- Վերլուծեք պեպտիդները Q-Exactive Plus զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա՝ զուգակցված Ultimate 3000 RSLC նանո համակարգով:
- Առանձնացրեք պեպտիդները՝ օգտագործելով հակադարձ փուլային HPLC սյունակ (75 մկմ × 42 սմ), որը լցված է C18 խեժով (2,4 մկմ):
- Կիրառեք գրադիենտ 2% -ից մինչև 35% լուծիչ B (ացետոնիտրիլ 0,15% մածուցիկ թթուով) 140 րոպեի ընթացքում:
- Ձեռք բերեք տվյալներ՝ օգտագործելով բարձր լուծաչափով MS սկանավորում, որին հաջորդում են 10 ամենաինտենսիվ իոնների MS/MS սկանավորումները:
8. Տվյալների վերլուծություն
- Մշակել չմշակված LC-MS տվյալները՝ օգտագործելով Progenesis ծրագրաշարը:
- Արտահանել .mgf ֆայլեր և վերլուծել դրանք MASCOT-ով:
- Կատարեք պեպտիդների քանակականացում՝ օգտագործելով SafeQuant՝ որակի վերահսկման և կեղծ հայտնաբերման ճշգրտման համար:
- Անցկացրեք բոլոր փորձերը կրկնօրինակով կամ եռակի՝ վերարտադրելիություն ապահովելու համար:
Multi-Sample Sonicators բարձր թողունակությամբ նմուշների պատրաստման համար
VialTweeter-ի և UIP400MTP-ի բազմակի նմուշների ձայնային ապարատի մոդելները զգալիորեն բարձրացնում են փորձարարական աշխատանքային հոսքերի ճշգրտությունն ու արդյունավետությունը, հատկապես բիոֆիլմի հետազոտության և պրոտեոմիկայի ոլորտում: Բազմաթիվ նմուշներ միատեսակ մշակելու նրանց կարողությունը ապահովում է բարձր թողունակություն՝ առանց տվյալների որակի խախտման: Այս առավելությունները, զուգակցված վերը նկարագրված պարզեցված աշխատանքային հոսքերի հետ, Hielscher-ի բազմակի նմուշային սոնիկատորները դարձնում են ժամանակակից կենսաբանական հետազոտությունների կարևոր գործիքներ:
- բարձր արդյունավետություն
- գերժամանակակից տեխնոլոգիա
- հուսալիություն & ամրություն
- կարգավորելի, ճշգրիտ գործընթացի վերահսկում
- խմբաքանակ & ներդիր
- ցանկացած ծավալի համար
- խելացի ծրագրակազմ
- խելացի գործառույթներ (օրինակ՝ ծրագրավորվող, տվյալների արձանագրություն, հեռակառավարում)
- հեշտ և անվտանգ գործելու համար
- ցածր սպասարկում
- CIP (մաքուր տեղում)
Դիզայն, արտադրություն և խորհրդատվություն – Որակյալ Արտադրված է Գերմանիայում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց բարձր որակի և դիզայնի չափանիշներով: Հզորությունը և հեշտ շահագործումը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի սահուն ինտեգրումը արդյունաբերական օբյեկտներում: Կոպիտ պայմանները և պահանջկոտ միջավայրերը հեշտությամբ կառավարվում են Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի կողմից:
Hielscher Ultrasonics-ը ISO սերտիֆիկացված ընկերություն է և հատուկ շեշտադրում է կատարում բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի վրա, որոնք բնութագրվում են ժամանակակից տեխնոլոգիաներով և օգտագործողների համար հարմարավետությամբ: Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են ԵԽ-ին և համապատասխանում են UL, CSA և RoH-ների պահանջներին:
Գրականություն / Հղումներ / Փաստաթերթեր
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Հաճախակի տրվող հարցեր
Ի՞նչ է կենսաֆիլմը:
Կենսաթաղանթը միկրոօրգանիզմների կառուցվածքային համայնք է, որը ներկառուցված է ինքնուրույն արտադրվող արտաբջջային մատրիցում (ECM), որը կպչում է մակերեսներին: Այն ապահովում է պաշտպանություն շրջակա միջավայրի սթրեսներից, հակաբիոտիկներից և իմունային համակարգից՝ նպաստելով մշտական վարակների և կենսաբանական ախտահանման:
Ի՞նչ է բիոֆիլմի ջոկատը:
Կենսաթաղանթի անջատումն այն գործընթացն է, որով մանրէաբանական բջիջները կամ կլաստերները առանձնանում են կենսաթաղանթի կառուցվածքից՝ ակտիվորեն (ֆերմենտային դեգրադացիայի կամ քվորումի զգայության միջոցով) կամ պասիվ (կտրող ուժերի, սննդանյութերի սպառման կամ մեխանիկական խանգարումների պատճառով): Սա հեշտացնում է բիոֆիլմի ցրումը և նոր մակերեսների գաղութացումը:
Որո՞նք են բիոֆիլմի հետ կապված սպիտակուցները:
Բիոֆիլմի հետ կապված սպիտակուցները (BAPs) մանրէային մակերեսային կամ արտազատվող սպիտակուցներ են, որոնք առանցքային դեր են խաղում կենսաթաղանթի ձևավորման, կայունության և կպչման գործում: Դրանք ներառում են ադհեզիններ, արտաբջջային ֆերմենտներ և կառուցվածքային սպիտակուցներ, ինչպիսիք են curli մանրաթելերը E. coli-ում կամ BapA-ն Staphylococcus aureus-ում:
Ի՞նչ է ECM-ն բիոֆիլմերում:
Կենսաթաղանթներում արտաբջջային մատրիցը (ECM) պոլիսախարիդների, սպիտակուցների, արտաբջջային ԴՆԹ-ի (eDNA) և լիպիդների բարդ ցանց է, որը ներառում է մանրէաբանական բջիջները: Այն ապահովում է կառուցվածքային ամբողջականություն, միջնորդում է կպչունությունը, պահպանում է խոնավությունը և բարձրացնում է կենսաթաղանթի դիմադրությունը հակամանրէային նյութերի և հյուրընկալող պաշտպանությունների նկատմամբ:
Ո՞ր գործառույթն է կատարում Curli Fibers-ը:
Կուրլի մանրաթելերը արտաբջջային ամիլոիդ մանրաթելեր են, որոնք արտադրվում են Escherichia coli-ի և հարակից բակտերիաների կողմից, որոնք վճռորոշ դեր են խաղում բիոֆիլմի ձևավորման, մակերեսային կպչման և հյուրընկալողի գաղութացման գործում: Նրանք նպաստում են բիոֆիլմի ամբողջականությանը, ուժեղացնում են դիմադրությունը շրջակա միջավայրի սթրեսներին և հեշտացնում են փոխազդեցությունը հյուրընկալող հյուսվածքների հետ վարակի ժամանակ: Բացի այդ, curli մանրաթելերը մասնակցում են իմունային համակարգի ակտիվացմանը և ներգրավված են բակտերիաների կայունության և պաթոգենության մեջ:
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.