Կենսաթաղանթի և պրոտեոմային վերլուծության մեջ Hielscher բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերի կիրառման արձանագրություն

Բազմաթիվ նմուշների համար նախատեսված ուլտրաձայնային սարքերի, օրինակ՝ VialTweeter բազմափորձանոթ ուլտրաձայնային սարքի և UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային սարքի օգտագործումը պարզեցնում է լաբորատոր աշխատանքային գործընթացները՝ մեծ թվով նմուշների մշակման կիրառություններում։ Երկու սարքերն էլ թույլ են տալիս ճշգրիտ և միատեսակ ուլտրաձայնային մշակման ենթարկել բազմաթիվ նմուշներ՝ նվազագույնի հասցնելով փոփոխականությունը և բարձրացնելով վերարտադրելիությունը։ Սա հատկապես օգտակար է այն փորձերում, որոնք պահանջում են նմուշների համաչափ լիզիս, կենսաթաղանթի անջատում, սպիտակուցների էքստրակցիա կամ պրոտեոլիտիկ մարսում, և որոնց դեպքում ձեռքով կամ առանձին նմուշներով աշխատելու մեթոդները պակաս արդյունավետ են ու հակված են անհամաչափ արդյունքներ տալու։

Պարզեցրեք աշխատանքային գործընթացները բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերով

Օրինակ՝ UIP400MTP սարքը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ ուլտրաձայնային մշակման ենթարկել միկրոթիթեղի հորատիկները՝ ապահովելով կենսաթաղանթների կամ բջջային նյութի միատեսակ անջատումը։ Միաժամանակ VialTweeter սարքն ապահովում է բազմաթիվ փորձանոթներում գտնվող նմուշների ճշգրիտ լիզիս և հոմոգենացում՝ առանց խաչաձև աղտոտման։ Այս ուլտրաձայնային սարքերը զգալիորեն կրճատում են մշակման ժամանակը, բարելավում փորձերի վերարտադրելիությունը և պահպանում նմուշների ամբողջականության բարձր աստիճանը՝ դառնալով անփոխարինելի գործիքներ մանրէաբանության, պրոտեոմիկայի և մոլեկուլային կենսաբանության հետազոտություններում։
Ստորև ներկայացված է մանրամասն արձանագրություն, որը ցույց է տալիս Hielscher բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերի՝ VialTweeter բազմափորձանոթ ուլտրաձայնային սարքի և UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային սարքի կիրառումը E. coli կենսաթաղանթի ձևավորման և հետագա պրոտեոմային վերլուծության հետազոտության մեջ։

Արձանագրություն. կենսաթաղանթի ձևավորում, անջատում և պրոտեոմային վերլուծություն՝ Hielscher բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերի կիրառմամբ

1. Բակտերիալ կուլտուրայի պատրաստում

• Աճեցրեք E. coli բակտերիաները (W3110 շտամ) 30°C ջերմաստիճանում, որը նպաստավոր է E. coli կենսաթաղանթի ձևավորման համար, հետևյալ բաղադրիչները պարունակող տրիպտոնային արգանակի (TB) միջավայրում.
  – 10 g/L տրիպտոն
  – 5 g/L NaCl
• Ըստ անհրաժեշտության ավելացրեք հակաբիոտիկներ՝ պլազմիդի պահպանումն ապահովելու համար։
• Մանրադիտակային և պրոմոտորի ակտիվության հետազոտությունների համար օգտագործեք E. coli W3110 շտամը՝ գենոմում ներդրված ուժեղացված GFP (eGFP) ռեպորտերով, որը գտնվում է rplL պրոմոտորի վերահսկողության ներքո։
• Պրոմոտորների ակտիվությունները չափելու համար օգտագործեք տարբեր պրոմոտորների GFP ռեպորտերային պլազմիդներ (օրինակ՝ csgA, csgD, fliA, fliC, flhD )։

2. Կենսաթաղանթի աճեցում և անջատում

• 12 հորատիկով թիթեղի յուրաքանչյուր հորատիկում ցանեք 1,5 mL նոսրացված բակտերիալ կուլտուրա (CellStar 12 հորատիկով թիթեղներ, Greiner Bio-One)։
• Ինկուբացրեք՝ կենսաթաղանթի ձևավորումը հնարավոր դարձնելու համար։
• Զգուշորեն հեռացրեք պլանկտոնային (չկպած) կուլտուրան։

– Յուրաքանչյուր հորատիկ լվացեք 500 µL PBS լուծույթով։
– Անջատեք կպած բջիջները՝ 12 հորատիկով թիթեղը ուլտրաձայնային մշակման ենթարկելով UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային սարքում։ UIP400MTP սարքն ապահովում է միատեսակ անջատում՝ բոլոր հորատիկներին հաղորդելով համաչափ ուլտրաձայնային էներգիա։
– Ուլտրաձայնային մշակման կարգավորումներ՝ 60% ամպլիտուդ, ցիկլային ռեժիմ՝ 60 sec ՄԻԱՑՎԱԾ / 30 sec ԱՆՋԱՏՎԱԾ։

3. Բջիջների հավաքում և լիզիս

• Կենսաթաղանթից անջատված բջիջները ցենտրիֆուգեք 4 500 g արագացմամբ՝ 5 րոպե։
• Նստվածքում հավաքված բջիջները լվացեք PBS լուծույթով։
• Բջիջները վերակախույթավորեք նատրիումի լաուրոիլսարկոզինատի (SLS) 2% լուծույթի 100 µL ծավալում և ինկուբացրեք 95°C ջերմաստիճանում՝ 15 րոպե։
• Ուլտրաձայնային մշակման ենթարկեք VialTweeter բազմափորձանոթ ուլտրաձայնային սարքով՝ բջիջների ամբողջական լիզիսն ապահովելու համար։
  – Ուլտրաձայնային մշակման կարգավորումներ՝ 100% ամպլիտուդ, 50 s ՄԻԱՑՎԱԾ / 10 s ԱՆՋԱՏՎԱԾ՝ աշխատանքի 10 min ընդհանուր տևողությամբ. նմուշները պահեք սառույցի վրա։

4. Վերականգնում և ալկիլացում

• Ավելացրեք 5 mM տրիս(2-կարբօքսիէթիլ)ֆոսֆին (TCEP)՝ դիսուլֆիդային կապերը վերականգնելու համար, և ինկուբացրեք 95°C ջերմաստիճանում՝ 15 րոպե։
• Սպիտակուցներն ալկիլացրեք 10 mM յոդացետամիդով՝ 30 րոպե, 25°C ջերմաստիճանում։

5. Սպիտակուցների քանակական որոշում և մարսում

• Լիզատները ցենտրիֆուգեք՝ բջջային մնացորդները հեռացնելու համար։
• Որոշեք սպիտակուցի ընդհանուր պարունակությունը՝ օգտագործելով Pierce BCA Protein Assay Kit հավաքածուն։
• Ընդհանուր սպիտակուցի 50 µg քանակը մարսեք 1 µg տրիպսինով՝ 2% SLS և 100 mM ամոնիումի հիդրոկարբոնատ պարունակող լուծույթում։
• Մարսման ռեակցիայի խառնուրդն ինկուբացրեք ամբողջ գիշեր՝ 30°C ջերմաստիճանում։

6. Պեպտիդների մաքրում

• Նստեցրեք SLS միացությունը՝ ավելացնելով 1,5% տրիֆտորքացախաթթու (TFA), ապա ցենտրիֆուգեք։
• Պեպտիդները մաքրեք՝ օգտագործելով C18 միկրոցենտրիֆուգային սյունակներ։
• Մաքրված պեպտիդները չորացրեք և վերակախույթավորեք 0,1% TFA լուծույթում։

7. Հեղուկային քրոմատագրություն–մասս-սպեկտրաչափություն (LC-MS/MS)

• Պեպտիդները վերլուծեք Q-Exactive Plus մասս-սպեկտրաչափով, որը միացված է Ultimate 3000 RSLC nano համակարգին։
• Պեպտիդներն առանձնացրեք հակադարձ ֆազային HPLC սյունակով (75 µm × 42 cm), որը լցված է C18 խեժով (2,4 µm)։
• Կիրառեք B լուծիչի (ացետոնիտրիլ՝ 0,15% մրջնաթթվով) 2%-ից 35% գրադիենտ՝ 140 րոպեի ընթացքում։
• Տվյալներ ստացեք բարձր լուծաչափով MS սկանավորումներով, որոնց հաջորդում են ամենաբարձր ինտենսիվությունն ունեցող 10 իոնների տանդեմային MS/MS սկանավորումները։

8. Տվյալների վերլուծություն

• LC-MS սկզբնական տվյալները մշակեք Progenesis ծրագրով։
• Արտահանեք .mgf ֆայլերը և վերլուծեք դրանք MASCOT ծրագրով։
• Կատարեք պեպտիդների քանակական որոշում SafeQuant ծրագրով՝ որակի վերահսկման և կեղծ հայտնաբերումների ուղղման համար։
• Բոլոր փորձերը կատարեք երկու կամ երեք կրկնությամբ՝ վերարտադրելիությունն ապահովելու համար։

Բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքեր՝ մեծ թվով նմուշների պատրաստման համար

VialTweeter և UIP400MTP բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերի մոդելները զգալիորեն բարձրացնում են փորձարարական աշխատանքային գործընթացների ճշգրտությունն ու արդյունավետությունը, հատկապես կենսաթաղանթների հետազոտություններում և պրոտեոմիկայում։ Բազմաթիվ նմուշներ միատեսակ մշակելու դրանց կարողությունն ապահովում է մեծ թվով նմուշների մշակման հնարավորություն՝ առանց տվյալների որակը նվազեցնելու։ Այս առավելությունները, վերը նկարագրված պարզեցված աշխատանքային գործընթացների հետ միասին, Hielscher բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերը դարձնում են ժամանակակից կենսաբանական հետազոտությունների համար անհրաժեշտ գործիքներ։

Նախագծում, արտադրություն և խորհրդատվություն – Գերմանիայում ստեղծված որակ

Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են որակի և նախագծման իրենց ամենաբարձր չափանիշներով։ Ամրությունն ու շահագործման պարզությունը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերն անխափան ինտեգրել արդյունաբերական կայանքներին։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հեշտությամբ դիմանում են ծանր պայմաններին և պահանջկոտ միջավայրերին։

Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ISO հավաստագրում և հատուկ ուշադրություն է դարձնում առաջադեմ տեխնոլոգիայով ու օգտագործման հարմարավետությամբ օժտված բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքերին։ Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են CE չափանիշներին և բավարարում են UL, CSA և RoHs պահանջները։