Պրոտեոմիկայի արձանագրություն. Հեռակա sonication-ը բարելավում է պեպտիդների նմուշի պատրաստումը MS-ի համար
Ներքևից վեր պրոտեոմիկան դարձել է ժամանակակից բիոմարկերների հայտնաբերման, կառուցվածքային կենսաբանության և կլինիկական ախտորոշման անկյունաքարը: Մարսելով սպիտակուցները պեպտիդների մեջ՝ նախքան զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) վերլուծությունը, հետազոտողները կարող են հասնել հաջորդականության ավելի խորը ծածկույթի և ավելի հուսալի քանակականացման: Այնուամենայնիվ, MS-ի համար բարձր բարդության կենսաբանական նմուշների պատրաստումը տեխնիկապես պահանջկոտ է: Վերջին մեթոդաբանական առաջընթացը ընդգծում է, թե ինչպես է վերահսկվում ուլտրաձայնային մշակումը – հատկապես ոչ կոնտակտային VialTweeter Multi-Tube sonicator-ի և UIP400MTP Microplate sonicator-ի հետ – կարող է զգալիորեն պարզեցնել այս աշխատանքային հոսքը, բարելավել վերարտադրելիությունը և կանխել սովորական գործիքների խցանումները:
Գտեք նմուշի պատրաստման մանրամասն արձանագրություն՝ MS-ի կողմից վերլուծության համար համապատասխան չափի պեպտիդներ ստանալու համար:
Ով է պետք օգտագործի առանց շփման սոնիկացիան պեպտիդների նմուշների պատրաստման համար?
- Բոտոմ-Ափ պրոտեոմիկա & Բանաձևող լաբորատորիաներ: Հետազոտողներ, որոնք պատրաստում են բարձր համալիր նմուշներ LC-MS կամ MALDI աշխատանքային հոսքերի համար, ովքեր պահանջում են միատարր, բարձր եկամտաբեր պեպտիդների վերականգնում տարբեր կենսաբանական մատրիցներում.
- S-Trap™ & Սևունդների Փաթինգի օգտագործողներ: Միջոցառումներ, որոնք հենվում են միկրո-բավերների մաքրության վրա, ովքեր կարիք ունեն DNA-ի վերահսկվող կտրման՝ բավարանման խցանման կանխարգելման և նմուշի հեշտ լեյավորմանն ու դիգեստի ապահովման համար.
- կլինիկական & Թրանսլացիոն Հետազոտական Խմբեր: Լաբորատորիաներ, որոնք մշակють հյուսվածքներ, բջիջներ, պլազմա, սերոմա կամ ուղեղային հեղուկ, որտեղ խմբից-խմբի վերարտադրելիությունն ու նմուշի ամբողջականությունը կարևոր են.
- Քանակական & Նախորոշված MS Գիտնականներ: Լաբորատորիաներ, որոնք իրականացնում են խստիվ համեմատական ուսումնասիրություններ, որտեղ կրկնակի օգտագործվող probe սոնիկատորները կարող են ներկայացնել խաչաձև աղտոտման ռիսկեր, որոնք կարող են վտանգել ցածր քանակությամբ պեպտիդների քանակավորումը.
- Կենտրոնական Հիմնարար Աջակցություններ & Բարձր թռիչքային գործողություններ՝ Խումբեր, որոնք միաժամանակ մշակում են բազմաթիվ կենսաբանական կրկնօրինակներ եւ օգտվում են VialTweeter-ով փակ խողովակով, բազմախողովակային բլոկային սոնիկացիայից, ինչը վերացնում է պրոբի մաքրումը, նվազեցնում է ձեռքի աշխատանքը եւ պահպանվում են ասեպտիկ պայմանները։
- PTM & Ստրուկտուրային սպիտակուցների հետազոտողներ՝ Հետազոտողներ, որոնք պահանջում են նուրբ, ջերմաստիճան վերահսկվող մշակմամբ այնպիսի փոփոխությունների պահպանման համար, որոնք հեշտ են վատնում և առավելացնող հաջորդականության ծածկույթը բջջային լիզիսի ու հոմոգենացման ընթացքում։
Multi-Sample Sonicator “VialTweeter” Պրոտեոմիկայի համար մի քանի փակ փաթեթների ոչ կոնտակտ նմուշ պատրաստելու համար
Прոտոկոլի Մանրամասն Արդյունաբերություն՝ Մասնիկներից և բջիջներից MS-հարմար պեպտիդների
Լայնորեն ընդունված ներքևից վեր պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքը, որը նկարագրված է Վոյտկևիչի և այլոց կողմից: ապահովում է տարբեր կենսաբանական մատրիցներից պեպտիդների նմուշներ պատրաստելու կայուն, մասշտաբային մեթոդ: Սկսած 50–100 մգ արագ սառեցված հյուսվածքից կամ 1–20 միլիոն բջիջից՝ արձանագրությունը ինտեգրում է կասեցման թակարդի (S-Trap™) տեխնոլոգիան՝ արդյունավետորեն հեռացնելու լվացող միջոցները, աղերը և աղտոտիչները նախքան ֆերմենտային մարսումը:
Լիզիզից, սպիտակուցի քանակականացումից, կրճատումից և ալկիլացումից հետո նմուշը թթվացվում է և բեռնվում S-Trap™ սպին սյունակի վրա, որտեղ տեղի է ունենում տրիպսին/lysC-ի մարսում: Ստացված պեպտիդները զտվում են, չորանում և ենթարկվում LC-MS վերլուծության: Երբ կիրառվում է 50 մգ մարդու սրտի հյուսվածքի վրա, այս աշխատանքային հոսքը հետևողականորեն տալիս է բավարար պեպտիդներ 30-40 ներարկումների համար՝ բացահայտելով ավելի քան 4000 եզակի սպիտակուցներ մեկ վազքի համար: Թեև քիմիայի և սյունակի վրա հիմնված մաքրումը հստակորեն սահմանված են, խողովակաշարի հաջողությունը մեծապես կախված է սկզբնական ֆիզիկական խափանումներից և ԴՆԹ-ի կառավարման քայլերից:
Արձանագրությունը խորհուրդ է տալիս օգտագործել VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ը բջիջները լիզելու և ԴՆԹ-ի կտրման համար: – երկու քայլերն էլ կարևոր են պեպտիդների վերլուծության համար:
VialTweeter-ը շարունակում է սոնիկացնել 1.0, 1.5 և 2.0 մլ Eppendorf խողովակներ, ինչպես նաև տարբեր NUNC մանրափաթեթներ
Սպիտակուցների հանում՝ բջիջների և հյուսվածքների զսպման ալտրաձայնային մեթոդի միջոցով
Ցածր-լարված պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացում, սոնիկացումը կարևոր քայլ է բջիջների նմուշների լիզիսի համար՝ սպիտակուցները հետագա զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վերլուծության համար ստանալու նպատակով: Սելլյուլոզային լիզիսի հավելոց SDS-ի ավելացումից հետո նմուշները ենթարկվում են ալտրաձայնային մշակում VialTweeter բազմախողովակային սոնիկատորով: Կարգը օգտագործում է 1.5 մլ միկրոֆյուրաժի խողովակներ և նշել է սոնիկատորը աշխատացնել 30% ունակությամբ՝ 10 վայրկյան աշխատում, 10 վայրկյան դադար, կրկնվելով 3 ցիկլով: 1 րոպե սպասնելուց հետո ցիկլը կրկնվում է ևս երկու անգամ: Նմուշները շարունակաբար սառեցվում են մածուկի վրա.
Այս գործընթացը ոչ միայն օգնում է բջիջների պառակտմանը, այլ նաև հատուկ անհրաժեշտ է լիզիսի ընթացքում ազատված գենոմային ԴՆԹ-ի կտրման համար։ Արդյունավետ ԴՆԹ-ի կտրումը կարևոր է նմուշի հեղուկայնությունը նվազեցնելու և S-Trap™ սյունակների խցանումը կանխելու համար, դա ապահովելով օպտիմալ սպիտակուցների վերականգնում և վստահելի հաջորդական պեպտիդների մարսում։
Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի կտրումի կարևոր դերը
S-Trap™-ի վրա հիմնված աշխատանքային հոսքերի ամենամեծ հաճախակի ձախողություններից մեկը սյունակի խցանումն է, որն ապրում է գրեթե բացառապես բջիջների կամ հյուսվածքի հոմոգենացման ընթացքում ազատված բարձր մոլեկուլային գենոմային ԴՆԹ-ի հետևանքով։ Անփոփոխ ԴՆԹ-ն դրված նմուշի հեղուկայնությունը զգալիորեն բարձրացնում է, ֆիքսում պեպտիդները և բլոկավորում է միկրո-պորոզ S-Trap™ սորբենտային հիմքը։
Ուլտրաձայնային մշակումն այս խնդիրն լուծում է մեխանիկականորեն DNA-ն փոքր, լուծելի հատվածների վերածելով։ Կառավարվող ակուստիկ էներգիա կիրառելով՝ VialTweeter-ը արդյունավետ կերպով կտրտում է նուկլեինաթթուները առանց ավելորդ ջերմություն գեներացնելու կամ արտաքին աղտոտիչ նյութեր ներմուծելու։ Այս պայմանն ապահովում է նմուշի հարթ լիցքում, միատեսակ հոսքի արագություններ և խնավար չունեցող խմորման կինետիկա։
Օպտիմացրած VialTweeter Սոնիկացիոն Պարամետրեր
Պրոտոկոլը նշում է բարձր վերարտադրելի սոնիկացիոն ռեժիմ, որը օպտիմացված է կենսաբանական նմուշների ամբողջականության և հետագայում ՄՍ-ի համապատասխանության համար։ 1.5 մլ միկրոցենտրիֆուգային շշերի մեջ գտնվող նմուշների համար՝ օգտագործելով Hielscher VialTweeter ոչ-կապակցված բլոկային սոնիկատորը, հետևյալ պարամետրերը ապահովում են լիզիս և DNA-ի օպտիմալ կտրտում՝ պահպանելով սպիտակուցների կառուցվածքը։
- Ամպլիտուդ: 30% հզորություն
- Ցիկլի օրինակը: 10 վայրկյան ON / 10 վայրկյան OFF
- Duration: 3 cycles (10sec ON / 10sec OFF) → 1-րոպե հանգիստ սառույցի վրա → կրկնել եւս 2 անգամ
- Ջերմաստիճանի կառավարում: Նմուշները տեղադրվում են սառույցի ընթացքում մշակման կանխելու ջերմային denaturation եւ վաղաժամ ֆերմենտային գործունեություն
Այս իմպուլսային sonication մոտեցումը կանխում է տեղայնացված գերտաքացումը, նվազեցնում է պեպտիդային օքսիդացումը, եւ ապահովում է միասնական ակուստիկ ազդեցություն բոլոր vials. Փակ խողովակի կարգավորումը նաեւ վերացնում է նմուշների միջեւ զոնդի մաքրման անհրաժեշտությունը՝ կտրուկ նվազեցնելով ձեռքի ժամանակը եւ օպերատորի փոփոխականությունը:
Ժամանակակից պրոտեոմիկայի աշխատանքի գրանցված հիմնական առավելությունները
VialTweeter-ի ինտեգրումը ձեր բոտմ-ափ պրոտեոմիկայի գործընթացում առաջարկում է մի շարք գործառնական և գիտական առավելություններ։
- ԴՆԹ-ի միասնական մասերի ջacksonաթյուն Բոլոր վիալներում акуստիկ էներգիայի համաչափ փոխանցումը ապահովում է զգայունության հստակ նվազում և կանխում է S-Trap™ լիցքավորման խմբային փոփոխությունը։
- Մարզական փոփոխությունների պահպանություն Ցածր ջերմաստիճանում սառցե լոգանքում մշակման գործընթացը պաշտպանում է տրանսլացիայի հետՄ փոխարինումները (PTMs) և կանխում է ջերմային ազդեցությամբ սպիտակուցների ագրեգացիան երբ բջիջների լուծում է։
- Ներքևում գործող գործընթացների հարմարեցում VialTweeter-ով մշակված լիզատները կարող են անմիջապես զտվել կենտրոնացումով և քանակավորվել առանց լրացուցիչ մաքրման քայլերի, արագացնելով ուղին դեպի S-Trap™ խայթում։
- Մասշտաբայնություն & Ճկունություն: Նույն սոնիկացման կարգավորումները կիրառելի են ինչպես բարձր բարդության հյուսվածքային նմուշների, այնպես էլ բջջային сусպենզիաների դեպքում, աջակցելով հայտնաբերման պրոտեոմիկայի, թիրախավորված քանակական չափումների և գլիկոպրոտեոմիկայի գործ flows-ներին։ Hielscher միկրոփլեյթի սոնիկատորները թույլ են տալիս հեշտորեն չափալցնել նմուշների մեծ թվաքանակը բազմափոսային ակնակետերում.
Ափերի հետ չմակաբերվող Multi-Tube Sonicator VialTweeter-ը կարող է գործարկվել սառեցված պահարաններում.
Սոնիկատորներ պրոտեոմիկ նմուշների նախապատրաստման համար.
Բարձրորակ պեպտիդային նմուշների պատրաստումը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի համար պահանջում է ավելի քան արդյունավետ լիզիսի – այն պահանջում է ճշգրիտ վերահսկողություն ԴՆԹ-ի կտրման, ջերմաստիճանի և աղտոտման կանխարգելման նկատմամբ: Ներառելով Hielscher VialTweeter-ը ձեր ներքևից վեր պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացում՝ դուք կարող եք վերացնել S-Trap™ խցանումը, ապահովել սպիտակուցի վերարտադրելի վերականգնում և պահպանել զգայուն MS վերլուծությունների համար պահանջվող մաքրությունը: Անկախ նրանից, թե դուք մշակում եք մարդու հյուսվածք, մշակված բջիջներ կամ բարդ լիզատներ, ուլտրաձայնային բլոկների մշակումն ապահովում է հուսալիություն, մասշտաբայնություն և գործընթացի վերահսկում, որը պահանջում են ժամանակակից պրոտեոմիկայի լաբորատորիաները:
Նմուշների ավելի բարձր թվերի մասշտաբների համար օգտվեք Hielscher-ի կենտրոնացված, ոչ կոնտակտային միկրոպլատային սոնիկատորի UIP400MTP և UIP550MTP մոդելներից: Մշակեք ցանկացած ստանդարտ բազմահոր ափսե՝ բարձր թողունակության պրոտեոմիկայի համար:
Closed-Tube Processing ընդդեմ ավանդական զոնդ Sonicators
Պատմականորեն, ԴՆԹ-ի կտրման համար հետազոտողները հիմնվել են ուղիղ շփման զոնդերի ձայնային սարքերի վրա: Արդյունավետ լինելով հանդերձ, զոնդային համակարգերը ներկայացնում են մի քանի կարևոր սահմանափակումներ պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքերում.
- Խաչաձեւ աղտոտման ռիսկ. Բազմաթիվ նմուշների վրա զոնդի կրկնակի օգտագործումը ստեղծում է աերոզոլային փոխադրումներ և ներմուծում խաչաձեւ աղտոտիչներ, որոնք շեղում են MS-ի քանակական արդյունքները:
- Նմուշի կորուստ. Ուղղակի ներդիրը կարող է հանգեցնել ցայտելու, գոլորշիացման և թանկարժեք պեպտիդների կպչմանը զոնդի մակերեսին:
- Մաքրում: Փորձարկումների միջև մանրակրկիտ ախտահանումը ժամանակատար և հաճախ թերի է, ինչը վտանգում է ցածր առատությամբ սպիտակուցների ուսումնասիրությունները:
VialTweeter բլոկ-սոնիկատորը նմուշները մշակում է ամբողջությամբ կնքված միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ: Փակ համակարգի այս դիզայնը վերացնում է զոնդից նմուշի շփումը, կանխում է աերոզոլի առաջացումը և պահպանում է խիստ ասեպտիկ պայմաններ միատարրացման և լիզի ընթացքում: Բարձր բարդության հյուսվածքների լիզատների կամ բազմաթիվ բջջային գծերի մշակման լաբորատորիաների համար դա նշանակում է ավելի մաքուր MS տվյալներ, ավելի բարձր պեպտիդների վերականգնում և ավելի հուսալի կենսաբանական կրկնօրինակումներ:
Սանդղակ մինչև բարձր թողունակության նմուշի պատրաստում Multiwell Plates-ում
Microplate Sonicator UIP400MTP և UIP550MTP մոդելներով, խողովակի մշակումը կարող է հեշտությամբ չափվել մինչև բարձր թողունակության նմուշի մշակումը ցանկացած ստանդարտ բազմաբնակարան ափսեի մեջ:
Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP նմուշներից բարձր արտադրողականության սպիտակուցի արդյունահանման համար
Հաճախ տրվող հարցեր պեպտիդների նմուշների պատրաստման համար սոնիկացիայի մասին
Ինչու է անհրաժեշտ սոնիկացիան S-Trap™ պեպտիդների մշակման համար?
Սոնիկացիան անհրաժեշտ է բարձր մոլեկուլային քաշով Գենոմիկ ԴՆԹ-ի շերտազատման համար, որը ազատվում է բջիջների կամ հյուսվածքների լիզիսի ընթացքում: Ամբողջական ԴՆԹ-ն զգալիորեն մեծացնում է նմուշի ծավալային խտությունը, ինչը կարող է խցանել S-Trap™ միկրոկոլոնն ու ձերէկ պահել պեպտիդները՝ լրջորեն նվազեցնելով վերականգնման և MS-ի համապատասխանությունը.
Ինչպես է VialTweeter բլոկ սոնիկատորը բարելավում նմուշի պատրաստումը համեմատած ավանդական probe սոնիկատորների հետ?
Օրինակ, անմիջական կապի պրոբային սոնիկատորների հետ, որոնք պահանջում են զգույշ մաքրում յուրաքանչյուր օգտագործումից հետո և վտանգում են աերոզոլների փոխանցումը, VialTweeter-ը պատրաստում է նմուշները ամբողջությամբ կցված շշերում և միկրոցենտրիֆուգայինURITY թուբերում։ Այս փակ-թուբային դիզայնը բացառում է խաչաձև աղտոտումը, կանխում նմուշի կորուստը և պահպաննում խստորեն ասեպտիկ պայմանները հոմոգենացման և բջջային քայքայման ողջ ընթացքում.
Պրոտեոմիկայի նմուշների պատրաստման համար օպտիմալ սոնիկացիոն պարամետրերը ո՞րն են:
Բիոլոգիական նմուշների, ինչպես բջիջների և հյուսվածքների, համար առաջարկվող պրոտոկոլը օգտագործում է VialTweeter սոնիկատորը 30% հզորությամբ՝ 10 վայրկյան միացված / 10 վայրկյան անջատված ցիկլով, կրկնվելու դեպքում 3 անգամ: Նմուշները պետք է պահվեն սառույցի վրա մշակման ընթացքում, և եթե մշակվում է ≥5 միլիոն բջիջ, ցիկլը կրկնեք ևս 2 անգամ: (cf. Wojtkiewicz et al., 2021)
Ինչ պետք է անեմ, եթե իմ S-Trap™ սյունակը կլանվի նմուշի լիցքավորման ժամանակ?
Սյունակի կլանումը սովորաբար առաջանում է դՆԹ-ի բարձր ջերմաստիճանից կամ անբավարար սաղաթումից: Յուրաքանչյուր չափիչի առաջացումը կանխելու համար լիզատը մանրակրկիտ մագլցեք նախքան պիպետավորելը և ապահովեք, որ դՆԹ-ն բավականաչափ շոշափված է սոնիկացիայի միջոցով.
Ինչ օգուտ է բերում ոչ շփվող սոնիկացիան քվանտիտատիվ պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքերի համար?
Քվանտիտատիվ հետազոտություններում նույնիսկ նմուշների միջև միկրոկոնտամինացիան կարող է խախտել ցածր խտության պեպտիդների հաշվարկները: VialTweeter-ի փակ-խողովակ և բազմախողովակային մշակումը վերացնում է probe-ի ներմուծումը, ապահովում է խմբից խմբին վերաբաշխման համընդհանուրություն և պահպանում նմուշի ամբողջականությունը ճշգրիտ համեմատական վերլուծությունների համար.
Ինչ պրոտեինի եկամուտ և MS խորություն կարող եմ սպասել այս պրոտոկոլից?
Սկսած 50 մգ մարդու սրտի հյուսվածքից կամ 5 միլիոն բջիջից՝ S-Trap™ աշխատանքային հոսքը սովորաբար տալիս է բավարար պեպտիդներ 30–50 LC-MS ներարկումների համար՝ հետևողականորեն նույնականացնելով ավելի քան 4000 եզակի սպիտակուցներ յուրաքանչյուր վազքի ընթացքում: (տես Wojtkiewicz et al., 2021)
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics-ը մատակարարում է հզոր ոչ կոնտակտային sonicators նմուշների պատրաստման և կլինիկական վերլուծության համար: Multi-well plate sonicator UIP400MTP-ը, VialTweeter-ը, CupHorn-ը և GDmini2 flow sonicator-ը նմուշները մշակում են առանց դրանց դիպչելու: