Պրոտեոմիկայի արձանագրություն․ անհպում ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է պեպտիդային նմուշների պատրաստումը MS վերլուծության համար

Ստորից վեր պրոտեոմիկան դարձել է ժամանակակից բիոմարկերների հայտնաբերման, կառուցվածքային կենսաբանության և կլինիկական ախտորոշման հիմնաքարերից մեկը։ Զանգվածային սպեկտրաչափական (MS) վերլուծությունից առաջ սպիտակուցները պեպտիդների ճեղքելով՝ հետազոտողները կարող են հասնել հաջորդականության ավելի խոր ընդգրկման և ավելի հուսալի քանակական որոշման։ Սակայն բարձր բարդության կենսաբանական նմուշների պատրաստումը MS վերլուծության համար տեխնիկապես բարդ խնդիր է մնում։ Մեթոդաբանական վերջին առաջընթացներն ընդգծում են, թե ինչպես կարող է վերահսկվող ուլտրաձայնային մշակումը – մասնավորապես՝ անհպում VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային սարքի և UIP400MTP միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային սարքի միջոցով – զգալիորեն պարզեցնել այս աշխատանքային ընթացքը, բարելավել վերարտադրելիությունը և կանխել գործիքային աշխատանքի տարածված խոչընդոտները։
Ծանոթացեք նմուշների պատրաստման մանրամասն արձանագրությանը՝ MS վերլուծության համար համապատասխան չափի պեպտիդներ ստանալու նպատակով։

Ովքե՞ր պետք է կիրառեն անհպում ուլտրաձայնային մշակում պեպտիդային նմուշների պատրաստման համար։

• Ստորից վեր պրոտեոմիկայի և հայտնաբերման լաբորատորիաներ․ Հետազոտողներ, որոնք պատրաստում են բարձր բարդության նմուշներ LC-MS կամ MALDI աշխատանքային ընթացքների համար և կարիք ունեն տարբեր կենսաբանական մատրիցներից պեպտիդների կայուն, բարձր ելքով ստացման։
• S-Trap™ և սուսպենզիայում որսման մեթոդի օգտագործողներ․ Թիմեր, որոնք հիմնվում են միկրոսյունակով մաքրման վրա և կարիք ունեն ԴՆԹ-ի վերահսկվող մեխանիկական մասնատման՝ սյունակի խցանումը կանխելու և նմուշի սահուն բեռնումն ու ճեղքումն ապահովելու համար։
• Կլինիկական և տրանսլյացիոն հետազոտությունների խմբեր․ Հյուսվածք, բջիջներ, պլազմա, շիճուկ կամ ողնուղեղային հեղուկ մշակող լաբորատորիաներ, որոնց համար վճռորոշ նշանակություն ունեն խմբաքանակից խմբաքանակ վերարտադրելիությունը և նմուշի ամբողջականությունը։
• Քանակական և թիրախային MS վերլուծության թիմեր․ Խիստ համեմատական հետազոտություններ իրականացնող լաբորատորիաներ, որոնց աշխատանքում զոնդային ուլտրաձայնային սարքերը խաչաձև աղտոտման ռիսկեր են առաջացնում, որոնք կարող են խաթարել ցածր պարունակությամբ պեպտիդների քանակական որոշումը։
• Համատեղ օգտագործման կենտրոններ և բարձր թողունակությամբ աշխատանքներ․ Միաժամանակ մի քանի կենսաբանական կրկնություններ մշակող խմբեր, որոնք օգտվում են VialTweeter սարքով փակ փորձանոթներում իրականացվող բազմափորձանոթային բլոկային ուլտրաձայնային մշակման առավելություններից․ այն վերացնում է զոնդի մաքրման անհրաժեշտությունը, նվազեցնում է ձեռքով աշխատանքի ժամանակը և պահպանում ասեպտիկ պայմանները։
• Հետտրանսլյացիոն մոդիֆիկացիաների (PTM) և սպիտակուցների կառուցվածքի հետազոտողներ․ Հետազոտողներ, որոնց անհրաժեշտ է մեղմ, ջերմաստիճանային վերահսկմամբ մշակում՝ բջիջների լիզիսի և հոմոգենացման ընթացքում անկայուն մոդիֆիկացիաները պահպանելու և հաջորդականության ընդգրկումն առավելագույնի հասցնելու համար։

Արձանագրության ակնարկ․ հյուսվածքից և բջիջներից մինչև MS վերլուծության համար պատրաստ պեպտիդներ

Wojtkiewicz և համահեղինակների նկարագրած՝ լայնորեն ընդունված ստորից վեր պրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացքն ապահովում է հուսալի, մասշտաբի մեծացման հնարավորություն տվող մեթոդ՝ տարբեր կենսաբանական մատրիցներից պեպտիդային նմուշներ պատրաստելու համար։ Սկսելով արագ սառեցված հյուսվածքի 50–100 mg քանակից կամ 1–20 միլիոն բջջից՝ արձանագրությունը ներառում է սուսպենզիայում որսման (S-Trap™) տեխնոլոգիան՝ ֆերմենտային ճեղքումից առաջ դետերգենտները, աղերն ու աղտոտիչները արդյունավետորեն հեռացնելու համար։
Լիզիսից, սպիտակուցների քանակական որոշումից, վերականգնումից և ալկիլացումից հետո նմուշը թթվեցվում է և բեռնվում S-Trap™ ցենտրիֆուգային սյունակի վրա, որտեղ տեղի է ունենում տրիպսինով/lysC-ով ճեղքումը։ Ստացված պեպտիդները էլյուցվում են, չորացվում և ենթարկվում LC-MS վերլուծության։ Մարդու սրտի հյուսվածքի 50 mg քանակի նկատմամբ կիրառվելիս այս աշխատանքային ընթացքը հետևողականորեն ապահովում է 30–40 ներարկման համար բավարար պեպտիդներ՝ յուրաքանչյուր վերլուծական գործարկման ընթացքում նույնականացնելով ավելի քան 4 000 եզակի սպիտակուց։ Թեև քիմիական գործընթացները և սյունակով մաքրումը հստակ սահմանված են, ամբողջ գործընթացի հաջողությունը մեծապես կախված է սկզբնական ֆիզիկական քայքայման և ԴՆԹ-ի մշակման քայլերից։
Արձանագրությունը խորհուրդ է տալիս օգտագործել VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային սարքը՝ ուլտրաձայնով բջիջների լիզիս և ԴՆԹ-ի մեխանիկական մասնատում իրականացնելու համար․ երկու քայլերն էլ վճռորոշ նշանակություն ունեն պեպտիդների վերլուծության համար։

Բջիջների և հյուսվածքների ուլտրաձայնային լիզիս՝ սպիտակուցների արդյունահանման համար

«Ներքևից վեր» պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացում ուլտրաձայնային մշակումը բջջային նմուշների լիզիսի առանցքային փուլ է՝ հետագա զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծության համար սպիտակուցներ կորզելու նպատակով։ Բջջային նստվածքին SDS պարունակող բջջային լիզիսի բուֆեր ավելացնելուց հետո նմուշները ենթարկվում են ուլտրաձայնային մշակման՝ VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային սարքի միջոցով։ Արձանագրությամբ օգտագործվում են 1,5 mL միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթներ, և սահմանվում է սարքի աշխատանքը 30% հզորությամբ՝ 10 վայրկյան միացված և 10 վայրկյան անջատված վիճակների հերթագայությամբ, որը կրկնվում է 3 ցիկլի ընթացքում։ 1 րոպե սպասելուց հետո ցիկլը կրկնվում է ևս երկու անգամ։ Նմուշներն անընդհատ սառեցվում են սառույցով։
Այս գործընթացը ոչ միայն նպաստում է բջիջների քայքայմանը, այլև հատկապես անհրաժեշտ է լիզիսի ընթացքում ազատված գենոմային ԴՆԹ-ի մեխանիկական մասնատման համար։ ԴՆԹ-ի արդյունավետ մեխանիկական մասնատումը վճռորոշ է նմուշի մածուցիկությունը նվազեցնելու և S-Trap™ սյունակների խցանումը կանխելու համար՝ այդպիսով ապահովելով սպիտակուցների օպտիմալ վերականգնում և պեպտիդների հետագա հուսալի ֆերմենտային ճեղքում։

ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային մեխանիկական մասնատման վճռորոշ դերը

S-Trap™ տեխնոլոգիայի վրա հիմնված աշխատանքային գործընթացներում առավել հաճախ հանդիպող խափանումներից մեկը սյունակի խցանումն է, որը գրեթե բացառապես պայմանավորված է բջիջների կամ հյուսվածքների հոմոգենացման ընթացքում ազատված բարձր մոլեկուլային զանգվածով գենոմային ԴՆԹ-ով։ Չմասնատված ԴՆԹ-ն կտրուկ մեծացնում է նմուշի մածուցիկությունը, պահում է պեպտիդները և խցանում S-Trap™ սորբենտի միկրոծակոտկեն շերտը։
Ուլտրաձայնային մշակումը լուծում է այս խնդիրը՝ ԴՆԹ-ն մեխանիկորեն մասնատելով փոքր, լուծելի հատվածների։ Կիրառելով վերահսկվող ակուստիկ էներգիա՝ VialTweeter սարքն արդյունավետորեն մեխանիկորեն մասնատում է նուկլեինաթթուները՝ առանց ավելորդ ջերմություն առաջացնելու կամ օտար աղտոտիչներ ներմուծելու։ Մածուցիկության այս նվազումն ապահովում է նմուշի անխափան բեռնում, միջանցիկ հոսքի կայուն արագություններ և ֆերմենտային ճեղքման անընդհատ կինետիկա։

VialTweeter սարքով ուլտրաձայնային մշակման օպտիմալացված պարամետրերը

Արձանագրությունը սահմանում է բարձր վերարտադրելիությամբ ուլտրաձայնային մշակման ռեժիմ, որն օպտիմալացված է կենսաբանական նմուշի ամբողջականության պահպանման և հետագա MS վերլուծության հետ համատեղելիության համար։ Hielscher VialTweeter անկոնտակտ բլոկային ուլտրաձայնային սարքով 1,5mL միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթներում նմուշ մշակելիս հետևյալ պարամետրերն ապահովում են լիզիս և ԴՆԹ-ի օպտիմալ մեխանիկական մասնատում՝ պահպանելով սպիտակուցի կառուցվածքը.

• Լայնույթ՝ 30% հզորություն
• Ցիկլի սխեմա՝ 10 վայրկյան ՄԻԱՑՎԱԾ / 10 վայրկյան ԱՆՋԱՏՎԱԾ
• Տևողություն՝ 3 ցիկլ (10sec ՄԻԱՑՎԱԾ/10sec ԱՆՋԱՏՎԱԾ) → 1 րոպե դադար սառույցի վրա → կրկնել ևս 2 անգամ
• Ջերմաստիճանի կառավարում՝ մշակման ընթացքում նմուշները տեղադրվում են սառույցի վրա՝ ջերմային բնափոխումը և վաղաժամ ֆերմենտային ակտիվությունը կանխելու համար

Իմպուլսային ուլտրաձայնային մշակման այս մոտեցումը կանխում է տեղային գերտաքացումը, նվազագույնի է հասցնում պեպտիդների օքսիդացումը և ապահովում է բոլոր սրվակների միատեսակ ակուստիկ ազդեցությունը։ Փակ փորձանոթներով համակարգը նաև վերացնում է նմուշների միջև զոնդը մաքրելու անհրաժեշտությունը՝ կտրուկ նվազեցնելով ձեռքով աշխատանքի ժամանակը և օպերատորով պայմանավորված փոփոխականությունը։

Հիմնական առավելությունները ժամանակակից պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացների համար

Ձեր «ներքևից վեր» պրոտեոմիկայի աշխատանքային շղթայում VialTweeter սարքի ներառումն ապահովում է մի շարք գործառնական և գիտական առավելություններ.

1. ԴՆԹ-ի կայուն մասնատում. Բոլոր սրվակներին ակուստիկ էներգիայի միատեսակ հաղորդումն ապահովում է մածուցիկության վերարտադրելի նվազում և կանխում S-Trap™ սյունակների բեռնման փոփոխականությունը խմբաքանակից խմբաքանակ։
2. Անկայուն ձևափոխությունների պահպանում. Սառցե բաղնիքում ցածր ջերմաստիճանով մշակումը պաշտպանում է հետտրանսլյացիոն ձևափոխությունները (PTMs) և կանխում ջերմությամբ հարուցված սպիտակուցային ագրեգացումը բջջային լիզիսի ընթացքում։
3. Հետագա մշակման պարզեցում. VialTweeter սարքով մշակված լիզատները կարելի է անմիջապես պարզեցնել ցենտրիֆուգմամբ և ենթարկել քանակական որոշման՝ առանց լրացուցիչ մաքրման փուլերի՝ արագացնելով անցումը S-Trap™ սյունակում ֆերմենտային ճեղքման փուլին։
4. Մասշտաբի մեծացման հնարավորություն և ճկունություն. Ուլտրաձայնային մշակման նույն կարգավորումները կիրառելի են ինչպես բարձր բարդության հյուսվածքային նմուշների, այնպես էլ բջջային կախույթների համար՝ աջակցելով բացահայտմանն ուղղված պրոտեոմիկայի, թիրախային քանակական որոշման և գլիկոպրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացներին։ Hielscher միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային սարքերը թույլ են տալիս հեշտությամբ մեծացնել մշակման մասշտաբը՝ բազմահոր պլանշետներում ավելի մեծ թվով նմուշներ մշակելու համար։

Գրականություն / Հղումներ

• FactSheet VialTweeter — Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.