Խմորասնկային բջիջների լիզիսը միկրոթիթեղներում՝ բարձր ինտենսիվության ուլտրաձայնային մշակմամբ

Մանրէաբաններն ու կենսագիտության հետազոտողները, որոնք աշխատում են Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, ինչպես նաև այլ խմորասնկային համակարգերի հետ, գիտեն այս դժվարությունը. խմորասնկային բջիջները դիմացկուն են, վերարտադրելի լիզիսի հասնելը կարող է դժվար լինել, իսկ նմուշների ձեռքով քայքայումն արագ դառնում է աշխատանքը սահմանափակող գործոն, երբ անհրաժեշտ է սքրինինգի ենթարկել բազմաթիվ շտամներ, կլոններ, աճեցման պայմաններ կամ էքսպրեսիոն կոնստրուկցիաներ։

Մեծ թվով նմուշների մշակման հնարավորությամբ խմորասնկային լիզիս՝ մանրէաբանության, մոլեկուլային կենսաբանության և սպիտակուցների վերլուծության համար

Hielscher միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային սարքերը, օրինակ՝ UIP400MTP (400 W) և UIP550MTP (550 W), ապահովում են մեծ թվով խմորասնկային բջջային նմուշների մեխանիկական լիզիսի լուծում՝ անմիջապես միկրոթիթեղներում։ Զոնդով նմուշները մեկ առ մեկ մշակելու փոխարեն կարելի է ամբողջական միկրոթիթեղներն ուլտրաձայնով մշակել միատեսակ պայմաններում։ Սա խմորասնկերի ուլտրաձայնային լիզիսը դարձնում է ավելի արագ, ավելի վերարտադրելի և ավելի հեշտ ինտեգրվող ժամանակակից մանրէաբանության, սպիտակուցների էքսպրեսիայի, ֆերմենտների սքրինինգի և օմիքսային աշխատանքային գործընթացներին։
Անկախ նրանից՝ անհրաժեշտ է ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ ազատել P. pastoris բջիջներից, պատրաստել խմորասնկային լիզատներ ֆերմենտային փորձարկումների համար, քայքայել S. cerevisiae բջիջները սպիտակուցների վերլուծության համար, թե զուգահեռաբար սքրինինգի ենթարկել խմորասնկերի տասնյակ կլոններ, Hielscher միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային սարքերն ապահովում են կավիտացիայի վրա հիմնված բջիջների հզոր քայքայում՝ գործընթացի ճշգրիտ վերահսկմամբ։

Ինչու են խմորասնկային բջիջները պահանջում արդյունավետ մեխանիկական լիզիս

Խմորասնկային բջիջներն ավելի դժվար է լիզիսի ենթարկել, քան բազմաթիվ բակտերիալ կամ կաթնասունների բջիջներ, քանի որ դրանք պաշտպանված են կոշտ բջջապատով, որը հիմնականում կազմված է պոլիսախարիդներից, գլյուկաններից, մանոպրոտեիններից և խիտինից։ Այս բջջապատն ապահովում է մեխանիկական կայունություն, սակայն նաև սահմանափակում է ներբջջային սպիտակուցների, նուկլեինաթթուների, մետաբոլիտների և ֆերմենտների ազատումը։
Խմորասնկերի լիզիսի ավանդական մեթոդները ներառում են գնդիկներով մեխանիկական քայքայումը, ֆերմենտային մարսումը, սառեցման–հալեցման ցիկլերը, քիմիական լիզիսը և զոնդային ուլտրաձայնային մշակումը։ Այս մեթոդները կարող են արդյունավետ լինել, սակայն ունեն նաև սահմանափակումներ։ Գնդիկներով մեխանիկական քայքայումը կարող է առաջացնել բեկորներ և տաքացում, ֆերմենտային մարսումը կարող է ավելացնել ծախսերն ու փոփոխականությունը, իսկ առանձին նմուշների զոնդային ուլտրաձայնային մշակումը ժամանակատար է, երբ պետք է մշակել մեծ թվով նմուշներ։
Բարձր ինտենսիվության կենտրոնացված ուլտրաձայնային կավիտացիան հաղթահարում է այս սահմանափակումները՝ խմորասնկային սուսպենզիայի վրա գործադրելով ուժեղ մեխանիկական սահքի ուժեր, ճնշման տատանումներ և միկրոհոսքեր։ Արդյունքը բջջապատերի և թաղանթների արագ քայքայումն է, ներբջջային բաղադրիչների բարելավված ազատումը և թիթեղային ձևաչափով նմուշների խիստ վերարտադրելի պատրաստումը։

Միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակում՝ խմորասնկային նմուշների զուգահեռ պատրաստման համար

Hielscher UIP400MTP և UIP550MTP սարքերը նախատեսված են միկրոթիթեղների, բազմահոր թիթեղների, PCR թիթեղների և նմուշների համապատասխան կանգնակների միատեսակ ուլտրաձայնային մշակման համար։ Ի տարբերություն զոնդային ուլտրաձայնային մշակման՝ նմուշներն առանձին մշակելու անհրաժեշտություն չկա։ Ամբողջ թիթեղը ենթարկվում է վերահսկվող ուլտրաձայնային էներգիայի ազդեցությանը, ինչի շնորհիվ աշխատանքային գործընթացը խիստ հարմար է նմուշների զուգահեռ մշակման համար։

Սա հատկապես օգտակար է հետևյալ նպատակներով.

• Սքրինինգի ենթարկել S. cerevisiae մուտանտները կամ էքսպրեսիոն շտամները
• Լիզիսի ենթարկել P. pastoris / K. phaffii կլոնները՝ ռեկոմբինանտ սպիտակուցի էքսպրեսիայից հետո
• Խմորասնկային լիզատների պատրաստում՝ ֆերմենտային փորձարկումների համար
• Սպիտակուցների էքստրակցիա՝ SDS-PAGE, վեստերն բլոթինգի, ELISA, LC-MS/MS կամ ակտիվության փորձարկման համար
• Ներբջջային մետաբոլիտների ազատում՝ մետաբոլոմիկայի համար
• ԴՆԹ և ՌՆԹ նմուշների պատրաստում՝ հետագա համապատասխան մաքրումից հետո
• Լիզիսի բուֆերների, հավելանյութերի և էքստրակցիայի պայմանների օպտիմալացում՝ մեծ թվով նմուշների մշակմամբ

Ինչպես է ուլտրաձայնային կավիտացիան քայքայում խմորասնկային բջիջները

Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում կենտրոնացված բարձր հզորության ուլտրաձայնը հեղուկ նմուշում առաջացնում է սեղմման և նոսրացման հերթագայվող ցիկլեր։ Բավարար ինտենսիվության դեպքում ճնշման այս տատանումներն առաջացնում են ակուստիկ կավիտացիա։ Կավիտացիոն պղպջակները ձևավորվում են, տատանվում և փլուզվում՝ առաջացնելով տեղային սահքի ուժեր, միկրոշիթեր, տուրբուլենտություն և ճնշման մեծ գրադիենտներ։
Խմորասնկային կախույթներում այս մեխանիկական ազդեցությունները թուլացնում և պատռում են բջջապատն ու բջջաթաղանթը։ Ներբջջային սպիտակուցները, ֆերմենտները, նուկլեինաթթուներն ու մետաբոլիտներն ազատվում են լիզիսի բուֆերի մեջ։ Քանի որ գործընթացը մեխանիկական է, այն կարելի է կիրառել բազմաթիվ տարբեր բուֆերային համակարգերի հետ և համակցել պրոտեազների ինհիբիտորների, վերականգնիչների, դետերգենտների, աղերի կամ մեղմ ֆերմենտային նախամշակման հետ։

Ընդհանուր ընթացակարգ. խմորասնկային բջիջների լիզիսը միկրոափսեներում

Հետևյալ ընթացակարգը գործնական մեկնակետ է խմորասնկային բջիջների լիզիսի համար՝ Hielscher UIP400MTP կամ UIP550MTP միկրոափսեների ուլտրաձայնային սարքի կիրառմամբ։ Պարամետրերը պետք է օպտիմալացնել՝ ըստ խմորասնկի շտամի, բջիջների խտության, թիրախային մոլեկուլի, բուֆերի բաղադրության, ափսեի տեսակի և հետագա անալիզի։

1. Հավաքեք և լվացեք խմորասնկային բջիջները

Մշակման ցանկալի պայմաններում աճեցրեք Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces կամ այլ խմորասնկային շտամ։ Բջիջները հավաքեք ցենտրիֆուգմամբ և հեռացրեք սննդամիջավայրը։ Նստվածքը լվացեք սառը թորած ջրով, PBS բուֆերով կամ լիզիսի ընտրված բուֆերով՝ հեռացնելու համար սննդամիջավայրի մնացորդային բաղադրիչները, որոնք կարող են խանգարել հետագա վերլուծությանը։
Սպիտակուցների էքստրակցիայի համար նմուշները պահեք սառը վիճակում և աշխատեք արագ։ Եթե պրոտեազների ազդեցությունը մտահոգություն է առաջացնում, նախապես սառեցրեք բոլոր բուֆերներն ու ծախսանյութերը։

2. Կրկին սուսպենդացրեք բջջային նստվածքը

Խմորասնկային նստվածքը կրկին սուսպենդացրեք լիզիսի համապատասխան սառը բուֆերում։ Սպիտակուցների արդյունավետ ազատման համար բջիջների բարձր խտությունը հաճախ առավելություն է տալիս։ Որպես մեկնակետ՝ օգտագործեք մոտավորապես 10–20% w/v խոնավ բջջային նստվածք կամ խիտ կախույթ, որի OD₆₀₀ > 10 է՝ կախված անալիզից։

Խմորասնկային սպիտակուցների ստացման համար լիզիսի տիպիկ բուֆերը կարող է պարունակել՝

• բուֆերային համակարգ, օրինակ՝ Tris-HCl, ֆոսֆատային բուֆեր կամ HEPES
• աղ, օրինակ՝ NaCl կամ KCl
• պրոտեազների ինհիբիտորների խառնուրդ
• ըստ անհրաժեշտության՝ վերականգնիչ, օրինակ՝ DTT կամ β-մերկապտոէթանոլ
• ըստ անհրաժեշտության՝ դետերգենտ, օրինակ՝ Triton X-100, NP-40, SDS կամ CHAPS՝ կախված հետագա գործընթացների հետ համատեղելիությունից
• ըստ անհրաժեշտության՝ ֆոսֆատազների ինհիբիտորներ՝ ֆոսֆորիլացման ուսումնասիրությունների համար

Դժվար լիզվող խմորասնկային շտամների կամ սպիտակուցների շատ մեղմ էքստրակցիայի դեպքում ուլտրաձայնային մշակումից առաջ կարելի է կիրառել կարճատև նախամշակում՝ օգտագործելով Zymolyase, Lyticase կամ բջջապատը քայքայող այլ ֆերմենտ։ Այս ֆերմենտային նախամշակումը պարտադիր չէ, սակայն կարող է բարձրացնել լիզիսի արդյունավետությունը կամ նվազեցնել ուլտրաձայնի պահանջվող ինտենսիվությունը։

3. Նմուշները տեղափոխեք համապատասխան միկրոափսեի մեջ

Խմորասնկային կախույթը բաշխեք ուլտրաձայնային մշակման հետ համատեղելի միկրոափսեի մեջ։ Հաճախ նախընտրելի են կլոր հատակով ափսեները, քանի որ դրանք բարելավում են նմուշի հավաքումը և նվազեցնում մեռյալ գոտիները։ Վերարտադրելիությունը բարելավելու համար բոլոր հորերում օգտագործեք նմուշի հավասար ծավալներ։
Ափսեն հերմետիկ փակեք համապատասխան հերմետիկացնող գորգիկով կամ թաղանթով՝ կանխելու գոլորշիացումը, աերոզոլների առաջացումը և խաչաձև աղտոտումը։ Համոզվեք, որ հերմետիկացնող նյութը համատեղելի է ընտրված ջերմաստիճանի և ուլտրաձայնային մշակման պայմանների հետ։
Տիպիկ աշխատանքային ծավալները կախված են ափսեի ձևաչափից և կիրառությունից։ Տարածված ձևաչափերն են 96 հորով ափսեները, խորահոր ափսեները, PCR ափսեները կամ փորձանոթների համապատասխան հենակները։

4. Ապահովեք սառեցումը

Խմորասնկային բջիջների լիզիսը պահանջում է ուլտրաձայնի բարձր ինտենսիվություն, իսկ մեխանիկական քայքայումն առաջացնում է ջերմություն։ Հետևաբար ջերմաստիճանի վերահսկումը վճռորոշ նշանակություն ունի, հատկապես սպիտակուցների, ֆերմենտների, ՌՆԹ-ի կամ ֆոսֆորիլացման վերլուծության համար։

Կիրառեք սառեցման համապատասխան եղանակ, օրինակ՝

• լիզիսի նախապես սառեցված բուֆեր
• նախապես սառեցված միկրոափսեներ
• սառեցման դադարներ ուլտրաձայնային մշակման միջակայքների միջև
• ուլտրաձայնային մշակման հարթակի արտաքին սառեցում, երբ կիրառելի է

Նպատակն է նմուշը պահել բավականաչափ սառը վիճակում՝ կանխելու սպիտակուցների դենատուրացիան, ֆերմենտների ապաակտիվացումը, ՌՆԹ-ի քայքայումը և ջերմությամբ պայմանավորված նմուշների փոփոխականությունը։

5. Խմորասնկային կախույթը ենթարկեք ուլտրաձայնային մշակման

Հերմետիկ փակված միկրոթիթեղը տեղադրեք Hielscher UIP400MTP կամ UIP550MTP միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակման սարքի մեջ և ընտրեք իմպուլսային ուլտրաձայնային մշակման ծրագիր։ Իմպուլսային ռեժիմը խորհուրդ է տրվում, քանի որ միացված փուլերում այն ապահովում է մեխանիկական քայքայում, իսկ անջատված փուլերում՝ ջերմության ցրում։
Որպես խմորասնկային բջիջների լիզիսի մեկնարկային պայմաններ՝

Խիստ դիմացկուն խմորասնկային կախույթների, P. pastoris խմորասնկի խիտ կենսազանգվածի կամ ռեկոմբինանտ սպիտակուցների դժվար էքստրակցիայի դեպքում միացված փուլերի գումարային տևողությունն ավելացրեք աստիճանաբար։ Ջերմազգայուն սպիտակուցների կամ ֆերմենտային փորձարկումների համար կիրառեք ավելի կարճ իմպուլսներ, սառեցման ավելի երկար դադարներ և ավելի ցածր մեկնարկային ամպլիտուդ։

Խմորասնկերի բարձր թողունակությամբ լիզիս բազմահորիկ միկրոթիթեղներում՝ UIP400MTP սարքով

6. Պարզեցրեք լիզատը

Ուլտրաձայնային մշակումից հետո ցենտրիֆուգեք միկրոթիթեղը կամ նմուշները տեղափոխեք փորձանոթների մեջ՝ ցենտրիֆուգման համար։ Բջջային բեկորները հեռացրեք համապատասխան արագությամբ և ջերմաստիճանում ցենտրիֆուգմամբ։ Հավաքեք վերնստվածքային հեղուկը՝ հետագա վերլուծության համար։

Կիրառությունից կախված՝ լիզատը կարող է օգտագործվել հետևյալի համար՝

• սպիտակուցների քանակական որոշում
• ֆերմենտային ակտիվության փորձարկումներ
• SDS-PAGE և վեստերն բլոթինգ
• ELISA և իմունաբանական փորձարկումներ
• LC-MS/MS պրոտեոմիկա
• մետաբոլիտների վերլուծություն
• ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի մաքրում

7. Օպտիմալացրեք և փաստագրեք մեթոդը

Խմորասնկերի վերարտադրելի լիզիս ապահովելու համար փաստագրեք բոլոր համապատասխան պարամետրերը՝ ներառյալ շտամը, աճեցման պայմանները, OD₆₀₀, բջիջների թաց զանգվածը, բուֆերի բաղադրությունը, միկրոթիթեղի տեսակը, նմուշի ծավալը, ամպլիտուդը, իմպուլսային ցիկլը, միացված փուլերի գումարային տևողությունը, սառեցման մեթոդը և նմուշի վերջնական ջերմաստիճանը։
Եթե Hielscher ուլտրաձայնային մշակման սարքն ունի տվյալների ավտոմատ գրանցման գործառույթ, գործընթացի տվյալները կարող են օգտագործվել փաստագրման, մեթոդի մշակման, մասշտաբի մեծացման և որակի վերահսկման համար։

Խմորասնկերի լիզիսի օպտիմալացման խորհուրդներ

Սպիտակուցների առավելագույն ազատման համար օգտագործեք խմորասնկերի խիտ կախույթներ, ուլտրաձայնի բարձր ինտենսիվություն և միացված փուլերի բավարար գումարային տևողություն։ Զգայուն սպիտակուցների համար նվազեցրեք ամպլիտուդը, երկարացրեք սառեցման դադարները և միկրոթիթեղը պահեք սառը վիճակում մշակման ողջ ընթացքում։
Եթե լիզիսն ամբողջական չէ, աստիճանաբար ավելացրեք ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը, փորձարկեք ֆերմենտային նախամշակում, նվազեցրեք նմուշի մածուցիկությունը կամ օպտիմալացրեք բուֆերը։ Եթե սպիտակուցները քայքայվում են կամ կորցնում ակտիվությունը, բարելավեք սառեցումը, կրճատեք միացված փուլերի տևողությունը, ավելացրեք արգելակիչներ և ստուգեք, որ դետերգենտային համակարգը համատեղելի է թիրախային սպիտակուցի հետ։
Քանի որ խմորասնկերի շտամները զգալիորեն տարբերվում են բջջապատի կառուցվածքով, աճի փուլով, էքսպրեսիայի համակարգով և կենսազանգվածի խտությամբ, խորհուրդ է տրվում կիրառել օպտիմալացման փոքր փորձարարական մատրից։ Օրինակ՝ փորձարկեք ամպլիտուդի երեք արժեք, երկու իմպուլսային ցիկլ և միացված փուլերի ընդհանուր տևողության երկու արժեք, ապա գնահատեք լիզիսի արդյունավետությունն ու սպիտակուցների ամբողջականությունը։

Hielscher միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակման սարքերի առավելությունները խմորասնկերի լիզիսի համար

Hielscher միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակման սարքերն իդեալական են այն լաբորատորիաների համար, որոնց անհրաժեշտ է վերարտադրելի լիզիս բազմաթիվ նմուշներում։ Դրանք վերացնում են զոնդով ուլտրաձայնային մշակման ժամանակ նմուշները հերթով մշակելու դանդաղ ընթացքը և նվազեցնում զոնդի ձեռքով դիրքավորումից, ընկղմման խորությունից ու առանձին նմուշների մշակման տարբերություններից առաջացող փոփոխականությունը։

Հիմնական առավելություններն են՝

• Բարձր թողունակությամբ մշակում. Ուլտրաձայնով զուգահեռ մշակեք խմորասնկերի բազմաթիվ նմուշներ միկրոթիթեղներում կամ նմուշների համատեղելի կանգնակներում։
• Վերարտադրելի պայմաններ. Ուլտրաձայնային մշակման նույն պայմանները բոլոր հորիկներում՝ լիզիսի միատեսակ և համադրելի արդյունքների համար։
• Զոնդով պայմանավորված խաչաձև աղտոտման բացակայություն. Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում նմուշները մնում են հերմետիկ փակված՝ նվազեցնելով նյութի փոխանցումը մի նմուշից մյուսը և մաքրման քայլերի քանակը։
• Հարմար են դիմացկուն բջիջների համար. Բարձր ինտենսիվության ուլտրաձայնը նպաստում է խմորասնկային բջիջների պատերի քայքայմանը։
• Արդյունավետ աշխատանքային գործընթաց. Իդեալական է շտամների, կլոնների, էքսպրեսիայի պայմանների և լիզիսի բուֆերների սկրինինգի համար։
• Արդյունավետ աշխատանքային գործընթաց. Ծրագրավորվող կարգավորումներ, տվյալների ավտոմատ գրանցում և պիտանիություն լաբորատոր ավտոմատացման համար։

Կիրառություններ խմորասնկային կենսատեխնոլոգիայում և կենսաբանական գիտությունների հետազոտություններում

Միկրոթիթեղներում խմորասնկերի ուլտրաձայնային լիզիսն աջակցում է բազմաթիվ հետազոտական և սկրինինգային աշխատանքային գործընթացների։ Ռեկոմբինանտ սպիտակուցների էքսպրեսիայի դեպքում P. pastoris և S. cerevisiae տեսակների կլոնները կարելի է զուգահեռ լիզիսի ենթարկել՝ էքսպրեսիայի մակարդակները կամ ֆերմենտային ակտիվությունը համեմատելու համար։ Համակարգային կենսաբանության և օմիքսի ոլորտներում ստանդարտացված լիզիսը բարելավում է տարբեր պայմաններում ստացված արդյունքների համադրելիությունը։ Մանրէաբանության մեջ ուլտրաձայնային մշակումն աջակցում է տարբեր շտամներից, սննդամիջավայրի տարբեր պայմաններից կամ սթրեսային մշակումներից լիզատների արագ պատրաստմանը։
Կիրառության բնորոշ ոլորտներն են.

• խմորասնկերի սպիտակուցների էքստրակցիա
• ռեկոմբինանտ սպիտակուցների սկրինինգ
• ֆերմենտային ակտիվության սկրինինգ
• տրանսֆորմացիայից հետո կլոնների ընտրություն
• ֆերմենտացման օպտիմալացում
• նմուշների պատրաստում պրոտեոմիկայի համար
• նմուշների պատրաստում մետաբոլոմիկայի համար
• բջջապատի քայքայման ուսումնասիրություններ
• մեծ թվով նմուշների մշակմամբ մանրէաբանական փորձարկումներ

Խմորասնկերի հուսալի լիզիսը սկսվում է վերահսկվող ուլտրաձայնային մշակումից

Խմորասնկերի լիզիսը կարող է դժվարանալ նմուշների քանակի ավելացման դեպքում, սակայն Hielscher միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակիչները գործընթացը դարձնում են ավելի արագ, ավելի մաքուր և ավելի վերարտադրելի։ UIP400MTP և UIP550MTP սարքերը հետազոտողներին հնարավորություն են տալիս ամբողջական թիթեղները մշակել սահմանված ուլտրաձայնային պայմաններում՝ բարձրացնելով նմուշների մշակման արտադրողականությունը և միաժամանակ նվազեցնելով ձեռքով կատարվող գործողությունները։
Մանրէաբանների, մոլեկուլային կենսաբանների, սպիտակուցների հետազոտողների և կենսատեխնոլոգիական լաբորատորիաների համար միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային մշակումը հզոր գործիք է՝ խմորասնկերի ներբջջային բաղադրիչներն արդյունավետ և վերարտադրելի կերպով ազատելու համար։

Գրականություն / Հղումներ

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.