Միկրոթիթեղներում ուլտրաձայնային մշակում շոթգան պրոտեոմիկայում – կիրառության վերաբերյալ տեղեկագիր
Շոթգան պրոտեոմիկայում բարդ կենսաբանական նյութը LC-MS/MS վերլուծության համար պատրաստ պեպտիդների վերածելու համար անհրաժեշտ է արդյունավետ և վերարտադրելի նմուշապատրաստում։ UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչն աջակցում է այս գործընթացին՝ ապահովելով փոքրածավալ նմուշների ստանդարտացված, զուգահեռ ուլտրաձայնային մշակում և օգնելով լաբորատորիաներին բարելավել քայքայումը, էքստրակցիան և վերալուծումը միկրոթիթեղների վրա հիմնված աշխատանքային ընթացակարգերում։ Այս կիրառական տեղեկագիրը նկարագրում է, թե ինչպես կարելի է UIP400MTP սարքը ներառել պրոտեոմիկական նմուշապատրաստման մեջ՝ որպես լաբորատորիայում փորձարկված օրինակ օգտագործելով PLA2G12A/Th17 հետազոտություններից արտաբջջային վեզիկուլների մշակման հրապարակված ընթացակարգը։
Միկրոթիթեղներում ուլտրաձայնային մշակում՝ ավելի վերարտադրելի շոթգան պրոտեոմիկայի համար
Պրոտեոմիկայի հետազոտողների համար վերարտադրելի նմուշապատրաստումը վճռորոշ նշանակություն ունի բարձրորակ LC-MS/MS տվյալներ ստանալու համար։ UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչն ապահովում է ստանդարտացված, զուգահեռ ուլտրաձայնային մշակում թիթեղների վրա հիմնված և փոքրածավալ նմուշներով ու բարձր թողունակությամբ աշխատանքային ընթացակարգերում։
Այն հատկապես օգտակար է այն լաբորատորիաների համար, որոնք աշխատում են հետևյալի հետ.
- Նմուշների մեծ հավաքածուներ, որոնք պահանջում են միատեսակ մշակում բազմաթիվ փոսիկներում
- Սահմանափակ սկզբնական քանակով նյութ, որի դեպքում անհրաժեշտ է նվազագույնի հասցնել նմուշի կորուստն ու փոփոխականությունը
- Լիպիդներով հարուստ նմուշներ, օրինակ՝ արտաբջջային վեզիկուլներ
- Բարդ կենսաբանական պատրաստուկներ, որոնք պահանջում են արդյունավետ քայքայում, էքստրակցիա կամ վերալուծում
- Համեմատական շոթգան պրոտեոմիկա, որի դեպքում տարբեր պայմանների և կրկնությունների միջև վերարտադրելիությունն էական նշանակություն ունի
Ֆերմենտային ճեղքումից առաջ ներառելով միկրոթիթեղներում ուլտրաձայնային մշակումը՝ հետազոտողները կարող են բարելավել նմուշների պատրաստվածությունը հետևյալի համար.
- Սպիտակուցների էքստրակցիա և վերալուծում
- Ճեղքում տրիպսինով/Lys-C ֆերմենտով
- Տվյալների գրանցում նանո-LC/MS/MS մեթոդով
- Հետագա քանակական պրոտեոմիկական վերլուծություն
Իմացե՛ք, թե ինչպես է միկրոթիթեղներում ուլտրաձայնային մշակումն օգնում նվազեցնել ձեռքով աշխատանքի հետևանքով առաջացող փոփոխականությունը, բարելավել նմուշների քայքայումը և բարդ կենսաբանական նմուշները պատրաստել հուսալի LC-MS/MS վերլուծության համար։
Միկրոթիթեղներում ուլտրաձայնային մշակումը կարող է օգտակար լինել հետևյալների համար.
- Պրոտեոմիկայի կենտրոնական ծառայությունների լաբորատորիաներ
- Արտաբջջային վեզիկուլների (EV) հետազոտական լաբորատորիաներ
- Իմունաբանության և բջջային կենսաբանության լաբորատորիաներ
- Տրանսլյացիոն հետազոտական խմբեր
- Կենսագիտության ոլորտի թիմեր, որոնք մեծացնում են աշխատանքի ծավալները՝ մեկ նմուշի պատրաստումից անցնելով ավելի բարձր թողունակությամբ աշխատանքային ընթացակարգերի
Բարձր թողունակությամբ նմուշապատրաստում՝ արտաբջջային վեզիկուլների պրոտեոմի վերլուծության համար
Ի՞նչ է շոթգան պրոտեոմիկան։
Շոթգան պրոտեոմիկան դարձել է բարդ կենսաբանական նմուշների բնութագրման հիմնական վերլուծական ռազմավարություններից մեկը՝ ամբողջական բջիջների լիզատներից և հյուսվածքային էքստրակտներից մինչև մաքրված օրգանելներ, արտաբջջային վեզիկուլներ և սահմանափակ սկզբնական քանակով կլինիկական նմուշներ։ Դրա հիմնական առավելությունը սպիտակուցների ճեղքման, բարձր լուծաչափով հեղուկային քրոմատագրության–տանդեմ զանգվածային սպեկտրաչափության և պեպտիդների հիման վրա սպիտակուցների հաշվողական նույնականացման համակցումն է։ Սակայն պրոտեոմի վերջնական տվյալների հավաքածուի որակը որոշվում է նմուշի՝ զանգվածային սպեկտրաչափին հասնելուց շատ առաջ։ Նմուշի արդյունավետ քայքայումը, սպիտակուցների լուծելիացումը, խանգարող նյութերի հեռացումը, վերարտադրելի ֆերմենտային ճեղքումը և պեպտիդների հուսալի վերականգնումը վճռորոշ են ինչպես ընդգրկման խորության, այնպես էլ քանակական հուսալիության համար։
Սահմանափակ քանակով կամ արժեքավոր նմուշներով աշխատող պրոտեոմիկայի հետազոտողների և կենսագիտության լաբորատորիաների համար նմուշապատրաստումը հաճախ գործընթացը սահմանափակող փուլն է։
UIP400MTP սարքն ապահովում է հուսալի նմուշապատրաստում և հեշտ ներառում առկա լաբորատոր աշխատանքային ընթացակարգերում
Արտաբջջային վեզիկուլների հետ կապված դժվարությունները պրոտեոմիկայում
Արտաբջջային վեզիկուլները (EV), օրինակ, նմուշների առանձնապես պահանջկոտ դաս են։ Դրանք թաղանթով սահմանափակված, լիպիդներով հարուստ, նանոմասշտաբային մասնիկներ են՝ սպիտակուցի համեմատաբար ցածր ելքով և լիպիդների, աղերի, դետերգենտների, շիճուկային սպիտակուցների ու մատրիքսի այլ բաղադրիչների ուղեկից փոխանցման բարձր հավանականությամբ։ Այս առանձնահատկությունները կարող են խանգարել ճեղքման արդյունավետությանը, քրոմատագրական աշխատանքին, էլեկտրասփրեյի կայունությանը և պեպտիդների նույնականացմանը։ Ուստի EV պրոտեոմիկայի համար նմուշների նախապատրաստման աշխատանքային ընթացքը պետք է բավականաչափ ազդեցիկ լինի՝ վեզիկուլների կառուցվածքները քայքայելու և դրանց սպիտակուցային պարունակությունը լուծելի դարձնելու համար՝ միաժամանակ համատեղելի մնալով հետագա ֆերմենտային ճեղքման և LC-MS/MS վերլուծության հետ։
Այս համատեքստում միկրոթիթեղների հետ համատեղելի ուլտրաձայնային մշակումը գործնական մոտեցում է նմուշների վերարտադրելի, զուգահեռ մշակման համար։ Hielscher ապրանքանիշի UIP400MTP (400 W) և UIP550MTP (550 W) միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչների մոդելները նախատեսված են բազմահոր թիթեղներում և փոքրածավալ անոթներում նմուշների ուլտրաձայնային մշակման համար՝ ապահովելով նմուշների մշակման ավելի բարձր թողունակությամբ աշխատանքային ընթացքեր, քան սովորական մեկ զոնդով ուլտրաձայնային մշակիչները։ Պրոտեոմիկայի լաբորատորիաների համար այս ձևաչափը գրավիչ է, քանի որ այն կարող է նվազեցնել ձեռքով աշխատանքի փոփոխականությունը, բարելավել բազմաթիվ նմուշների զուգահեռ մշակումը և ավելի բնականորեն ինտեգրվել թիթեղների վրա հիմնված նմուշների նախապատրաստման շղթաներին։
Աշխատանքային ընթացքի օրինակ
PLA2G12A ֆոսֆոլիպազով պայմանավորված Th17 բջիջների կենսաբանության ուսումնասիրություններում արտաբջջային վեզիկուլների պրոտեոմիկայի վերջերս կիրառված աշխատանքային ընթացակարգը օգտակար, լաբորատորիայում փորձարկված օրինակ է, թե ինչպես կարելի է UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչը ներառել շոթգան պրոտեոմիկայի նմուշապատրաստման մեջ։ Այդ հետազոտությունների շարքում EV նմուշները պրոտեոմի վերլուծության համար մշակվել են՝ կիրառելով մեթանոլով մշակում, UIP400MTP սարքով ուլտրաձայնային մշակում, ցենտրիֆուգում, չորացում, trypsin/Lys-C խառնուրդով ճեղքում և նանոհոսքային հեղուկային քրոմատագրություն (LC)՝ զուգակցված բարձր լուծաչափով տանդեմ զանգվածային սպեկտրաչափության (MS) հետ։ Կենսաբանական աշխատանքը 2026 թվականին ներկայացրել են Mochizuki-Ono անունով հեղինակը և գործընկերները։ Այդ աշխատանքում պրոտեոմիկական վերլուծությունն օգնել է բնութագրել, թե ինչպես է PLA2G12A ֆոսֆոլիպազը փոփոխում EV վեզիկուլների սպիտակուցային պարունակությունը՝ ախտածին T բջջային պատասխանների համատեքստում։
UIP400MTP 96-հորանի թիթեղների ուլտրաձայնային մշակիչ՝ սպիտակուցների բարձր թողունակությամբ էքստրակցիայի համար
Ուլտրաձայնային մշակիչ՝ UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչ
Մուտքային քանակ՝ 5 µg սպիտակուցին համարժեք EV քանակ
Ճեղքում՝ Տրիպսին/Lys-C
Չափման մեթոդ՝ Նանո-LC-MS/MS / DIA պրոտեոմիկա
Քայլ առ քայլ հրահանգներ. EV նմուշների նախապատրաստում շոթգան պրոտեոմիկայի համար՝ UIP400MTP սարքի օգնությամբ
Այս աշխատանքային ընթացքը նկարագրում է արտաբջջային վեզիկուլների (EV) փոքր մուտքային քանակով նմուշների նախապատրաստման մեթոդ՝ շոթգան պրոտեոմիկայի համար՝ UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչի կիրառմամբ։ Այն հիմնված է EV պրոտեոմիկայի հրապարակված աշխատանքային ընթացքի վրա, որի ընթացքում EV նմուշները նորմալացվել են, չորացվել, մշակվել մեթանոլով, ենթարկվել ուլտրաձայնային մշակման, ճեղքվել տրիպսին/Lys-C-ով, թթվացվել և վերլուծվել նանո-LC-MS/MS մեթոդով։
Ընթացակարգը նախատեսված է պրոտեոմիկայի հետազոտողների և կենսագիտության լաբորատորիաների համար, որոնք EV կամ այլ փոքրածավալ, լիպիդներով հարուստ կենսաբանական նմուշներ են նախապատրաստում ներքևից վեր մոտեցմամբ շոթգան պրոտեոմիկայի համար։
Աշխատանքային ընթացքի ընդհանուր նկարագիր
| Փուլ | Նպատակ | Հիմնական արդյունք |
|---|---|---|
| EV նմուշների նախապատրաստում | Մեկուսացնել, լվանալ և քանակապես գնահատել EV նմուշները | Նորմալացված EV մուտքային քանակ |
| Նմուշի չորացում | Հեռացնել հեղուկը լուծիչի օժանդակությամբ մշակումից առաջ | Չորացված EV նյութ |
| Մեթանոլով մշակում | Նպաստել լիպիդներով հարուստ EV նյութի քայքայմանը | Մեթանոլով թրջված նմուշ |
| Ուլտրաձայնային մշակում UIP400MTP սարքով | Նպաստել քայքայմանը, էքստրակցիային և հոմոգենացմանը | Մշակված EV նմուշ |
| Ճեղքում | EV սպիտակուցներից ստանալ պեպտիդներ | Տրիպսին/Lys-C-ով ճեղքմամբ ստացված պեպտիդային խառնուրդ |
| LC-MS/MS վերլուծություն | Բաժանել, հայտնաբերել և քանակապես որոշել պեպտիդները | Պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածու |
| Տվյալների վերլուծություն | Նույնականացնել և քանակապես որոշել պեպտիդներն ու սպիտակուցները | Սպիտակուցների մակարդակով արդյունքներ |
Քայլ առ քայլ արձանագրություն
| Քայլ | Հրահանգ | Կրիտիկական պարամետրեր |
|---|---|---|
| 1 | Նախապատրաստեք մաքրված EV նմուշներ՝ կիրառելով լաբորատորիայում հաստատված մեկուսացման աշխատանքային ընթացքը։ | Պրոտեոմիկայի համար նախապատրաստումից առաջ հեռացրեք բջիջները, բջջային բեկորները և հիմնական աղտոտիչները։ |
| 2 | Քանակապես որոշեք EV նմուշների սպիտակուցային պարունակությունը, օրինակ՝ BCA անալիզով։ | Նորմալացրեք բոլոր նմուշները՝ ապահովելով սպիտակուցին համարժեք հավասար մուտքային քանակ։ |
| 3 | Մաքուր PCR փորձանոթների կամ համատեղելի փոքրածավալ փորձանոթների մեջ տեղափոխեք 5 µg սպիտակուցին համարժեք EV քանակ։ | Օգտագործեք ցածր կապողունակությամբ փորձանոթներ, երբ նմուշի կորուստը մտահոգիչ է։ |
| 4 | Ամբողջությամբ չորացրեք EV նմուշները։ | Խուսափեք գերտաքացումից. համոզվեք, որ տեսանելի հեղուկ չի մնացել։ |
| 5 | Յուրաքանչյուր չորացված EV նմուշին ավելացրեք 25 µL մեթանոլ։ | Համոզվեք, որ չորացված նյութն ամբողջությամբ թրջվել է։ |
| 6 | Նմուշները 3 րոպե մշակեք ուլտրաձայնով՝ օգտագործելով UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային սարքը։ | Բոլոր նմուշների համար օգտագործեք ուլտրաձայնային մշակման միանման կարգավորումներ և նմուշների դասավորության նույն տրամաբանությունը։ |
| 7 | Ուլտրաձայնով մշակված նմուշները ցենտրիֆուգեք 19 000 × g պայմաններում՝ 20 րոպե, 4°C ջերմաստիճանում։ | Ցենտրիֆուգումից հետո խուսափեք որևէ նստվածք կամ չլուծվող նյութ խախտելուց։ |
| 8 | Զգուշորեն հեռացրեք վերնստվածքային հեղուկի 20 µL ծավալը։ | Բոլոր նմուշների համար կիրառեք պիպետավորման նույն տեխնիկան։ |
| 9 | Նմուշի մնացած նյութն ամբողջությամբ չորացրեք։ | Անմիջապես անցեք ճեղքմանը կամ պահեք միայն վավերացված պայմաններում։ |
| 10 | Ավելացրեք 4 µL տրիպսին/Lys-C լուծույթ՝ 100 ng/µL կոնցենտրացիայով, 50 mM ամոնիումի բիկարբոնատի լուծույթում։ | Օգտագործումից անմիջապես առաջ պատրաստեք ֆերմենտային լուծույթը կամ օգտագործեք պատշաճ կերպով պահված բաժնեմասեր։ |
| 11 | Կարճատև ուլտրաձայնային մշակում կատարեք՝ չորացված սպիտակուցային նյութը ճեղքման լուծույթում լուծելու համար։ | Ուլտրաձայնային մշակումից հետո ամբողջ հեղուկը հավաքեք փորձանոթի հատակին։ |
| 12 | Ճեղքումը կատարեք 2 ժամ՝ 37°C ջերմաստիճանում, 300 rpm արագությամբ թափահարելով։ | Կափարիչները պահեք ամուր փակված՝ գոլորշիացումը կանխելու համար։ |
| 13 | Ճեղքման արգասիքն թթվեցնելու համար ավելացրեք 1 µL 1,25% TFA։ | Թթվեցումը դադարեցնում է ճեղքումը և պեպտիդները նախապատրաստում LC-MS/MS վերլուծությանը։ |
| 14 | Ճեղքման արգասիքը տեղափոխեք LC-MS վերլուծության հետ համատեղելի սրվակների կամ թիթեղների մեջ։ | Խուսափեք չլուծվող մնացորդները տեղափոխելուց։ |
| 15 | Վերլուծեք nano-LC-MS/MS մեթոդով։ | Օգտագործեք ներարկման միևնույն ծավալը, LC գրադիենտը և MS տվյալների գրանցման կարգավորումները։ |
| 16 | Ելքային տվյալները մշակեք DIA, DDA կամ թիրախային պրոտեոմիկայի ծրագրային ապահովմամբ՝ ըստ նպատակահարմարության։ | Կիրառեք համապատասխան տվյալների շտեմարան, ֆերմենտային սպեցիֆիկություն, մոդիֆիկացիաների կարգավորումներ և FDR շեմեր։ |
(հմմտ. Mochizuki-Ono et al., 2026)
UIP400MTP ուլտրաձայնային սարք՝ բազմահոր թիթեղների համար
Ինչո՞ւ կիրառել միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակում։
UIP400MTP սարքը հնարավորություն է տալիս փոքրածավալ նմուշները ենթարկել ստանդարտացված, զուգահեռ ուլտրաձայնային մշակման։ Սա օգտակար է, երբ կարևոր են վերարտադրելիությունը, նմուշի փոքր սկզբնական քանակը և բազմաթիվ նմուշների մշակման բարձր արտադրողականությունը։
Օգտագործեք ցանկացած ստանդարտ միկրոթիթեղ։ Նմուշների բարձր արտադրողականությամբ նախապատրաստում՝ UIP400MTP սարքով
Վկայակոչված EV պրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացակարգում օգտագործվել են 5 µg սպիտակուցին համարժեք սկզբնական EV նյութ, 25 µL մեթանոլ, UIP400MTP սարքով 3 րոպե ուլտրաձայնային մշակում, տրիպսին/Lys-C ճեղքում, TFA թթվեցում և nano-LC-MS/MS վերլուծություն։
LC-MS/MS վերլուծության և տվյալների վերլուծության առաջարկվող քայլերը
Ճեղքումից և թթվեցումից հետո նմուշները կարելի է վերլուծել նանոհոսքային հակադարձ ֆազային LC մեթոդով՝ զուգակցված բարձր լուծաչափով տանդեմային զանգվածային սպեկտրաչափության հետ։ Հրապարակված աշխատանքային ընթացակարգում պեպտիդները բաժանվել են nano-LC համակարգով և վերլուծվել Orbitrap զանգվածային սպեկտրաչափով՝ տվյալներից անկախ գրանցման եղանակով։
| Փուլ | Առաջարկություն | Նպատակ |
|---|---|---|
| Նմուշի բեռնում | Օգտագործեք C18 որսիչ կամ պեպտիդների բեռնման համարժեք համակարգ։ | Կոնցենտրացնում է պեպտիդները և հեռացնում խիստ բևեռային աղտոտիչները։ |
| Պեպտիդների բաժանում | Օգտագործեք նանոհոսքային հակադարձ ֆազային LC։ | Բարելավում է պեպտիդների բաժանումը և MS զգայունությունը։ |
| MS տվյալների գրանցում | Օգտագործեք DIA, DDA կամ թիրախային MS՝ կախված հետազոտության նախագծից։ | Ստեղծում է պեպտիդների մակարդակի սպեկտրային տվյալներ։ |
| Որոնում տվյալների շտեմարանում | Օգտագործեք տվյալ կենսաբանական տեսակին համապատասխան հղումային տվյալների շտեմարան։ | Նպաստում է պեպտիդների և սպիտակուցների նույնականացմանը։ |
| FDR վերահսկում | Կիրառեք պեպտիդների և սպիտակուցների կեղծ հայտնաբերումների մասնաբաժնի շեմեր։ | Վերահսկում է նույնականացման հավաստիությունը։ |
| Քանակական որոշում | Արտահանեք պեպտիդների, պրեկուրսորների և սպիտակուցների առատության աղյուսակները։ | Հնարավորություն է տալիս վիճակագրական համեմատություն կատարել խմբերի միջև։ |
Որակի վերահսկման ստուգաթերթ
- Հաստատեք, որ բոլոր նմուշներում սկզբնական EV նյութի սպիտակուցին համարժեք քանակը հավասար է։
- Օգտագործեք նմուշների մշակման պատահականացված կամ հավասարակշռված դասավորություններ։
- Մեթանոլի ծավալը, ուլտրաձայնային մշակման ժամանակը, չորացման ժամանակը և ճեղքման ծավալը պահեք միանման։
- Հետևեք պեպտիդների ելքին և սպիտակուցների նույնականացումների ընդհանուր թվին։
- Ստուգեք բաց թողնված ճեղքման տեղամասերի մասնաբաժինը և պեպտիդների երկարության բաշխումը։
- Ուսումնասիրեք քրոմատագրական պիկերի ձևը և պահման ժամանակի վերարտադրելիությունը։
- Ներառեք դատարկ նմուշներ՝ մնացորդային տեղափոխումը վերահսկելու համար։
- Ավելի մեծ հետազոտություններում օգտագործեք միավորված որակի վերահսկման (QC) նմուշներ։
- Գնահատեք կրկնությունների վարիացիայի գործակիցը։
- Օգտագործեք PCA կամ հարակից մեթոդներ՝ խմբաքանակային ազդեցությունները կամ արտառոց նմուշները հայտնաբերելու համար։
Արձանագրման առաջարկություններ
Այս աշխատանքային ընթացակարգը հրապարակելիս կամ փաստագրելիս նշեք սկզբնական EV նյութի քանակը, թիթեղի ձևաչափը, մեթանոլի ծավալը, UIP400MTP սարքի ուլտրաձայնային մշակման ամպլիտուդը և ժամանակը, ցենտրիֆուգման պայմանները, չորացման մեթոդը, ճեղքման բուֆերը, ֆերմենտի կոնցենտրացիան, ճեղքման ժամանակը, թթվեցման պայմանները, LC-MS/MS հարթակը, տվյալների գրանցման ռեժիմը, ծրագրային ապահովման տարբերակը, տվյալների շտեմարանը, FDR շեմը, նորմավորման մեթոդը և վիճակագրական մշակման ընթացակարգը։
Hielscher միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման բոլոր սարքերն ավտոմատ կերպով ներկառուցված SD քարտի վրա CVS ֆայլով գրանցում են գործընթացի կարևոր պարամետրերը, ինչպիսիք են ամպլիտուդը, ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը և ջերմաստիճանը՝ ամսաթվի և ժամի նշումով։ Վերարտադրելիության և որակի վերահսկման համար տվյալների արձանագրումը երբեք այսքան հեշտ չի եղել։
DIA պրոտեոմիկայի համար բոլոր նմուշների դեպքում օգտագործեք տվյալների հավաքագրման միևնույն կարգավորումները և հնարավորության դեպքում ներառեք որակի վերահսկման միավորված նմուշներ։ Հետևեք պրեկուրսորների թվին, պահման ժամանակի կայունությանը և կրկնությունների փոփոխականությանը։
Այս աշխատանքային ընթացակարգը EV պրոտեոմիկայի լաբորատոր պայմաններում փորձարկված օրինակ է։ Այլ տեսակի նմուշների համար օպտիմալացրեք սկզբնական նյութի քանակը, լուծիչի պայմանները, ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը, պրոտեոլիտիկ մարսման ծավալը և LC-MS/MS ներարկման ռազմավարությունը՝ նախքան մասշտաբը մեծացնելով ամբողջական ուսումնասիրության անցնելը։
Ուսումնասիրությունը մանրամասն՝ EV շոթգան պրոտեոմիկան PLA2G12A-ի ուսումնասիրության մեջ
PLA2G12A ֆոսֆոլիպազի ուսումնասիրությունը շոթգան պրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացակարգում UIP400MTP սարքի կիրառման կոնկրետ օրինակ է ներկայացնում։ Կենսաբանական հարցն այն էր, թե ինչպես է արտազատվող PLA2G12A ֆոսֆոլիպազը փոփոխում Th17 բջիջներից առաջացած արտաբջջային վեզիկուլները և դրանով ազդում ախտածին T բջիջների տարբերակման վրա։ Հեղինակները ցույց են տվել, որ PLA2G12A ֆոսֆոլիպազն ազդում է EV թաղանթների վրա՝ առաջացնելով լիզոֆոսֆոլիպիդներ, այդ թվում՝ 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine միացությունը, և որ դրան հաջորդող՝ LPA2 միջոցով իրականացվող լիզոֆոսֆատիդաթթվի ազդանշանային փոխանցումը նպաստում է Th17 բջիջների տարբերակմանը։ Լիպիդային ազդանշանային փոխանցումից բացի, ուսումնասիրություններում հետազոտվել է նաև EV վեզիկուլների պարունակությունը, այդ թվում՝ RNA և սպիտակուցների պարունակությունը, ինչի շնորհիվ շոթգան պրոտեոմիկան դարձել է բնութագրման ռազմավարության կարևոր բաղադրիչ։
EV նմուշների պատրաստման աշխատանքային ընթացակարգում Th17 բջիջները կուլտիվացվել են էկզոսոմներից զրկված պտղային տավարի շիճուկ պարունակող միջավայրում։ Կուլտուրաների վերնստվածքային հեղուկները նախ ցենտրիֆուգվել են՝ բջիջները հեռացնելու համար, ապա զտվել 0,22 µm ֆիլտրով, խտացվել ուլտրաֆիլտրացիայի/ուլտրացենտրիֆուգման միջոցով, լվացվել, կրկին կախույթավորվել PBS լուծույթում և քանակապես գնահատվել BCA սպիտակուցային թեստով։ EV նմուշների պատրաստման այս նախնական փուլն ապահովել է, որ պրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացակարգ հնարավոր լինի ներմուծել EV նյութի՝ սպիտակուցային համարժեքով սահմանված քանակ։
Շոթգան պրոտեոմիկական վերլուծության համար հեղինակներն օգտագործել են 5 µg սպիտակուցային համարժեքին համապատասխանող EV նմուշներ։ Այս նմուշները չորացվել են PCR փորձանոթներում, և ավելացվել է 25 µL մեթանոլ։ Այնուհետև նմուշները 3 րոպե մշակվել են ուլտրաձայնով՝ օգտագործելով UIP400MTP միկրոթիթեղային ուլտրաձայնային մշակիչը։ Ուլտրաձայնային մշակումից հետո նմուշները ցենտրիֆուգվել են 4°C ջերմաստիճանում 20 րոպե՝ 19 000 × g արագացմամբ։ 20 µL վերնստվածքային հեղուկը հեռացնելուց հետո նմուշները ցենտրիֆուգվել են մինչև չորանալը։ Այնուհետև սպիտակուցները լուծվել են ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ 50 mM ամոնիումի բիկարբոնատում պատրաստված 100 ng/µL կոնցենտրացիայով trypsin/Lys-C լուծույթի 4 µL ծավալում։ Ճեղքումն իրականացվել է 2 ժամ՝ 37°C ջերմաստիճանում, 300 rpm արագությամբ թափահարելով։ Ճեղքման արգասիքը թթվեցվել է 1 µL 1,25% տրիֆտորքացախաթթվով և ենթարկվել նանոհոսքային հեղուկային քրոմատագրության (LC)՝ զուգակցված բարձր լուծաչափով տանդեմ զանգվածային սպեկտրաչափության հետ։
Այս աշխատանքային ընթացակարգն ընդգծում է սկզբնական նյութի փոքր քանակով EV պրոտեոմիկայի մի քանի օգտակար սկզբունք։ Նախ՝ սկզբնական նյութի քանակը նորմավորվել է ըստ սպիտակուցային համարժեքի, ինչը կարևոր է տարբեր գենոտիպերից կամ մշակումներից ստացված EV նմուշները համեմատելիս։ Երկրորդ՝ մեթանոլն օգտագործվել է ուլտրաձայնային մշակումից առաջ՝ նպաստելով քայքայմանը և էքստրակցիային՝ միաժամանակ խուսափելով դետերգենտային համակարգերից, որոնք կարող են բարդացնել LC-MS/MS վերլուծությունը։ Երրորդ՝ ուլտրաձայնային մշակման փուլը եղել է կարճատև և ստանդարտացված, ինչը համատեղելի է նմուշների զուգահեռ մշակման հետ։ Չորրորդ՝ trypsin/Lys-C խառնուրդով ճեղքումն իրականացվել է շատ փոքր ծավալում՝ նվազեցնելով նոսրացումը և նպաստելով պեպտիդների վերականգնմանը սկզբնական նյութի փոքր քանակից։ Վերջապես, ճեղքումից անմիջապես թթվեցման և LC-MS/MS վերլուծության անցնելը նվազագույնի է հասցրել անհարկի մշակման քայլերը։
Հետագա LC-MS/MS մեթոդում կիրառվել է նանոհոսքային հակադարձ ֆազային բաժանում՝ զուգակցված Q-Exactive HF Orbitrap զանգվածային սպեկտրաչափի հետ։ Նմուշները որսվել են C18 նախասյունակում, այնուհետև բաժանվել 50 µm ներքին տրամագծով անալիտիկ սյունակում՝ 200 nL/min հոսքի արագությամբ և 40°C ջերմաստիճանում։ 60 րոպեի ընթացքում գրադիենտը փոխվել է օրգանական լուծիչի ցածր պարունակությունից մինչև 35% B լուծիչ, որին հաջորդել են օրգանական լուծիչի բարձր պարունակությամբ լվացումը և վերահավասարակշռումը։ Զանգվածային սպեկտրաչափական (MS) տվյալների գրանցումն իրականացվել է դրական իոնների ռեժիմում՝ տվյալներից անկախ գրանցմամբ և ավելի բարձր էներգիայով բախումային դիսոցմամբ։ DIA չմշակված ֆայլերը վերլուծվել են DIA-NN 1.8 ծրագրով՝ օգտագործելով համակարգչային կանխատեսմամբ ստացված սպեկտրային գրադարան։
Սպիտակուցների բարձր թողունակությամբ էքստրակցիա 96 հորիկով պլանշետների ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP սարքի միջոցով
Հաճախ տրվող հարցեր
Ովքե՞ր են առավել մեծ օգուտ ստանում շոթգան պրոտեոմիկայում միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային մշակումից։
Միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային մշակումը հատկապես օգտակար է բազմաթիվ նմուշներ զուգահեռ մշակող պրոտեոմիկայի լաբորատորիաների համար, այդ թվում՝ համատեղ օգտագործման կենտրոնների, պրոտեոմի հետազոտական խմբերի, իմունաբանական լաբորատորիաների, տրանսլյացիոն հետազոտական թիմերի և կենսագիտության լաբորատորիաների, որոնք անցնում են ավելի բարձր թողունակությամբ LC-MS/MS աշխատանքային ընթացակարգերի։ Այն հատկապես արդիական է, երբ տարբեր նմուշների միջև վերարտադրելիությունը վճռորոշ նշանակություն ունի։
Ինչո՞ւ օգտագործել UIP400MTP սարքը սովորական զոնդային ուլտրաձայնային մշակման սարքի փոխարեն։
Սովորական զոնդային ուլտրաձայնային սարքը սովորաբար նմուշները մշակում է մեկ առ մեկ և պահանջում է մանրակրկիտ մաքրում նմուշների մշակումների միջև՝ մի նմուշից մյուսը նյութի փոխանցումը նվազեցնելու համար։ Միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP և UIP550MTP մոդելներն ապահովում են զուգահեռ ուլտրաձայնային մշակում պլանշետային կամ փոքրածավալ ձևաչափով՝ օգնելով նվազեցնել ձեռքով կատարվող գործողությունները, բարելավել միատեսակությունը և պարզեցնել բազմաթիվ նմուշների նախապատրաստումը։ Դրանք նաև հնարավորություն են տալիս հեշտությամբ ինտեգրվել ավտոմատացված աշխատանքային գործընթացներին։
Շոթգան պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացի ո՞ր փուլում է կիրառվում ուլտրաձայնային մշակումը։
Ուլտրաձայնային մշակումը սովորաբար կիրառվում է նմուշների նախապատրաստման՝ ճեղքմանը նախորդող փուլում։ Այն կարող է նպաստել քայքայմանը, էքստրակցիային, հոմոգենացմանը և կրկնակի լուծելիացմանը՝ տրիպսինով, Lys-C ֆերմենտով կամ տրիպսին/Lys-C խառնուրդով ֆերմենտային ճեղքումից առաջ։
Բացի այդ, ուլտրաձայնային մշակումը կարող է կիրառվել նաև ճեղքման ընթացքում՝ սպիտակուցների ֆերմենտային ճեղքումը զգալիորեն արագացնելու համար։ Բացահայտե՛ք ուլտրաձայնային մշակմամբ սպիտակուցների բարձր թողունակությամբ ճեղքման ներուժը՝ պրոտեոմիկայի արագ աշխատանքային գործընթաց ապահովելու համար։
Արդյո՞ք միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումն օգտակար է արտաբջջային վեզիկուլների պրոտեոմիկայի համար։
Այո՛։ Արտաբջջային վեզիկուլները լիպիդներով հարուստ, թաղանթով սահմանափակված մասնիկներ են, որոնց վերարտադրելի մշակումը կարող է դժվար լինել։ PLA2G12A վերաբերյալ հիշատակված ուսումնասիրություններում EV նմուշները մշակվել են մեթանոլով, ենթարկվել ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP սարքով, չորացվել, ճեղքվել տրիպսին/Lys-C խառնուրդով և վերլուծվել nano-LC/MS/MS մեթոդով։
Նմուշների ո՞ր տեսակների համար կարող է օգտակար լինել միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումը։
Միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումը կարող է օգտակար լինել բջջային լիզատների, օրգանելների ֆրակցիաների, իմունոպրեցիպիտատների, սպիտակուցային ագրեգատների, թաղանթներով հարուստ նմուշների, արտաբջջային վեզիկուլների և այլ փոքրածավալ կենսաբանական պատրաստուկների համար։ Յուրաքանչյուր տեսակի նմուշի համար պետք է օպտիմալացվեն ուլտրաձայնային մշակման ինտենսիվությունն ու տևողությունը, լուծիչի կիրառման պայմանները, սկզբնական նյութի քանակը և ճեղքման ռազմավարությունը։
Արդյո՞ք ուլտրաձայնային մշակումը փոխարինում է ֆերմենտային ճեղքմանը։
Ո՛չ։ Ուլտրաձայնային մշակումն օգնում է նմուշը նախապատրաստել ճեղքման՝ բարելավելով քայքայումը, էքստրակցիան կամ կրկնակի լուծելիացումը։ «Ներքևից վերև» մոտեցմամբ շոթգան պրոտեոմիկայի համար պեպտիդներ ստանալու նպատակով պրոտեոլիտիկ ճեղքումը շարունակում է անհրաժեշտ լինել։
Կարդացե՛ք ավելին պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացներում ուլտրաձայնով խթանվող սպիտակուցային ճեղքման մասին։
Արդյո՞ք UIP400MTP սարքը համատեղելի է փոքր քանակի սկզբնական նյութով պրոտեոմիկայի հետ։
Այո՛, միկրոպլանշետային ձևաչափը լավ է համապատասխանում փոքրածավալ աշխատանքային գործընթացներին, որոնցում կարևոր են նմուշի պահպանումը և միատեսակ մշակումը։ Հրապարակված EV աշխատանքային գործընթացում պրոտեոմիկայի համար նախապատրաստումը կատարվել է 5 µg սպիտակուցին համարժեք սկզբնական EV նյութով։
Կարո՞ղ է միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումը բարելավել վերարտադրելիությունը։
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը նպաստում են վերարտադրելիությանը՝ բազմաթիվ նմուշների համար կիրառելով ուլտրաձայնային մշակման ստանդարտացված պայմաններ։ Սակայն այլ գործոններ ևս, ինչպիսիք են բջիջների կամ EV մեկուսացումը, սկզբնական նյութի քանակի նորմավորումը, ճեղքման արդյունավետությունը, LC-MS/MS կայունությունը, տվյալների մշակումը և վիճակագրական վերլուծությունը, նպաստում են պրոտեոմիկայի ընդհանուր վերարտադրելիությանը։
Արդյո՞ք միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է սպիտակուցների նույնականացման խորությունը։
Այն կարող է նպաստել նույնականացման խորության բարելավմանը, երբ նմուշի քայքայումը կամ կրկնակի լուծելիացումը սահմանափակող գործոն է։ Ազդեցությունը կախված է նմուշի տեսակից, սպիտակուցների քիմիական հատկություններից, մաքրման ռազմավարությունից, ճեղքման պայմաններից և LC-MS/MS մեթոդի արդյունավետությունից։
Ի՞նչ պետք է օպտիմալացնել՝ աշխատանքային գործընթացը կանոնավոր կիրառելուց առաջ։
Հիմնական պարամետրերը ներառում են սկզբնական նմուշի քանակը, բուֆերի կամ լուծիչի բաղադրությունը, պլանշետի ձևաչափը, ուլտրաձայնային ամպլիտուդն ու տևողությունը, չորացման պայմանները, ճեղքման ծավալը, ֆերմենտի կոնցենտրացիան, ինկուբացիայի տևողությունը և LC-MS/MS ներարկման քանակը։ Նախքան աշխատանքային գործընթացն ամբողջ փորձարարական շարքի նկատմամբ կիրառելը խորհուրդ է տրվում կատարել փորձնական ստուգում։
Կարո՞ղ է այս աշխատանքային գործընթացը կիրառվել DIA պրոտեոմիկայի հետ։
Այո՛։ Հիշատակված EV աշխատանքային գործընթացում կիրառվել է տվյալներից անկախ տվյալների հավաքագրում, որին հաջորդել է վերլուծությունը DIA-NN ծրագրով։ Միկրոպլանշետներում ուլտրաձայնային մշակումը նմուշների նախապատրաստման նախնական գործընթացի մաս է և կարող է ինտեգրվել DIA, DDA կամ թիրախային պրոտեոմիկայի մեթոդներին։
Որակի վերահսկման ո՞ր ցուցանիշներին պետք է հետևել։
Որակի վերահսկման առաջարկվող չափանիշները ներառում են պեպտիդների ելքը, նույնականացված պեպտիդների և սպիտակուցային խմբերի քանակը, բաց թողնված ճեղքումների հաճախականությունը, պեպտիդների երկարության բաշխումը, քրոմատագրական պիկերի ձևը, պահման ժամանակի կայունությունը, կրկնությունների վարիացիայի գործակիցը, նմուշների միջև մնացորդային նյութի փոխանցումը և կենսաբանական խմբերի տարանջատումը PCA կամ հարակից մեթոդներով։
Ո՞րն է միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP կամ UIP550MTP մոդելները պրոտեոմիկայի համար նմուշների նախապատրաստման գործընթացում ներառելու հիմնական առավելությունը։
Հիմնական առավելությունը փոքրածավալ նմուշների ստանդարտացված, զուգահեռ մշակումն է։ Սա օգնում է լաբորատորիաներին նվազեցնել ձեռքով կատարվող գործողությունների փոփոխականությունը և ավելի միատեսակ նախապատրաստել բարդ կենսաբանական նմուշները պրոտեոլիտիկ մարսման, LC-MS/MS տվյալների գրանցման և քանակական պրոտեոմիկական վերլուծության համար։
Hielscher միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման սարքերը կարող են սահուն կերպով ինտեգրվել ավտոմատացված աշխատանքային գործընթացներում։
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձրարդյունավետ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափեր։