Միկրոտարելային սոնիկացիա շոթգան պրոտեոմիկայում – Հավելվածի Նշում

Shotgun proteomics depends on efficient, reproducible sample preparation to convert complex biological material into LC-MS/MS-ready peptides. The UIP400MTP microplate sonicator supports this process by enabling standardized, parallel sonication of small-volume samples, helping laboratories improve disruption, extraction, and resolubilization in microplate-based workflows. This application note describes how the UIP400MTP can be integrated into proteomic sample preparation, using a published extracellular-vesicle workflow from PLA2G12A/Th17 studies as a lab-tested example.

Microplate Sonication for More Reproducible Shotgun Proteomics

Պրոտեոմիկայի հետազոտողների համար կրկնօրինակվող նմուշի պատրաստումը կարևոր նշանակություն ունի բարձրորակ LC-MS/MS տվյալների համար։ UIP400MTP միկրապլատային սոնիկատորը աջակցում է ստանդարտացված, զուգահեռ սոնիկացիային տախտակաձև և փոքր ծավալ/բարձր հոսք աշխատանքային հոսքերի մեջ։

Այն հատկապես օգտակար է լաբորատորիաների համար, որոնք աշխատում են՝

• Մեծ նմուշային հավաքածուների հետ, որոնք պահանջում են համաչափ մշակում բազմաթիվ սառույցների միջով
• Սահմանափակ մուտքային նյութերի հետ, երբ անհրաժեշտ է նվազագույնի հասցնել նմուշի կորուստը և փոփոխականությունը
• Լիպիդերով հարուստ նմուշների, օրինակ՝ նորմալցված վեզիկուլների հետ
• Համեմատաբար բարդ կենսաբանական պատրաստուկների հետ, որոնք պահանջում են արդյունավետ խոչընդոտում, արդյունահանում կամ լուծարանք
• Համեմատական շոթգան պրոտեոմիկայի համար, որտեղ պայմանների և կրկնօրինակների միջև կրկնօրինակելիությունը կենսական է

Միկրապլատային սոնիկացիան ինտեգրելով աղաղակի առաջ, հետազոտողները կարող են բարելավել նմուշի պատրաստությունը՝

• Օրինակ՝ սպիտակուցների արդյունահանում և լուծարանք
• Թրիպսին/Լիզ-Կ հոդերի ապահեղացումը
• Նանո-LC/MS/MS ձեռքբերում
• Քանակական հետընդին պրոտեոմիկայի վերլուծություն

 

Մեծ վստահությամբ մասշտաբավորեք ձեր պրոտեոմիկայի նմուշի պատրաստման գործընթացը!
Իմանալով, թե ինչպես միկրոպլատային սոնիկացիան օգնում է նվազեցնել ձեռքի տարբերությունները, բարելավել նմուշի խզումը և պատրաստել բարդ կենսաբանական նմուշներ վստահելի LC-MS/MS վերլուծության համար։

Տեղեկատվության հարցում


Էլփոստի հասցեն (պարտադիր է)


Ապրանք կամ հետաքրքրության ոլորտ



Ես համաձայն եմ Գաղտնիության քաղաքականությանը









Պահանջել տեղեկատվություն

Միկրոպլատային սոնիկացիայի առավելությունները կարող են օգտակար լինել՝

• Պրոտեոմիկայի կենտրոնական լաբորատորիաներ
• EV հետազոտական լաբորատորիաներ
• Իմունոլոգիայի և բջջաբանական լաբորատորիաներ
• Թրանսլացիոն հետազոտական խմբեր
• Կենսաբանության ոլորտի թիմեր, որոնք մասշտաբավորում են մեկ նմուշային պատրաստումից մինչև բարձր հզորությամբ աշխատանքային հոսքեր

High-Throughput Sample Preparation for Extracellular Vesicle Proteome Analysis

What is Shotgun Proteomics?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
Պրոտեոմիկայի հետազոտողների և կյանքի գիտությունների լաբորատորիաների համար, որոնք աշխատում են սահմանափակ կամ արժեքավոր նմուշների հետ, նմուշի պատրաստությունը հաճախ որոշիչ հանգույց է։

Արտաքին վեզիկուլաների մարտահրավերը պրոտեոմիկայում

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
In this context, microplate-compatible ultrasonication offers a practical approach for reproducible, parallelized sample processing. The Hielscher microplate sonicator models UIP400MTP (400 W) and UIP550MTP (550 W) are designed for sonication of samples in multiwell plates and small-volume vessels, supporting higher-throughput workflows than conventional single-probe sonicators. For proteomics laboratories, this format is attractive because it can reduce hands-on variability, improve parallel treatment of multiple samples, and integrate more naturally into plate-based sample preparation pipelines.

Exemplary Workflow

Վերջին ժամանակներում PLA2G12A-ով պայմանավորված Th17-ջրատուպատվածության բջջային բիոլոգիայի մեջ կատարած էքստրացելյուլար վեզիկուլների պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքը տրամադրում է օգտակար, լաբորատոր փորձարկված օրինակ այն մասին, թե ինչպես միկրոլոտայի սոնիկատոր UIP400MTP-ն կարող է ներառվել շոթգան պրոտեոմիկայի նմուշների պատրաստման մեջ: Ըստ այդ հետազոտական սերիայի, EV նմուշները պրոտեոմի վերլուծության համար մշակվել են մեթանոլի բուժման, UIP400MTP սոնիկացիայի, սենտրիֆուգացման, չորացման,տրիպսին/Lys-C հարստացման և նեյրո-ֆլո LC-բարձր հզորությամբ տանդեմ MS-ի միջոցով: Արդյունքն առաջին անգամ հաղորդվել էր որպես bioRxiv նախապրնտ և հետագայում հրապարակվել է Cell Reports-ում, որտեղ պրոտեոմիկայի վերլուծությունը օգնել է նկարագրել, թե ինչպես PLA2G12A-ն փոխում է EV բեռնարկղային պրոտեինների կազմը հիվանդական T-բջջային արձագանքների համատեքստում:

Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP

Why microplate sonication?
UIP400MTP-ն հնարավորություն է տալիս ստանդարտացված, պարալելային սոնիկացիա փոքր ծավալի նմուշների համար: Սա օգտակար է, երբ կարևոր են կրկնելիությունը, նմուշի փոքր մուտքաթվականը և բազմանմուշի throughput-ը.


Որակի վերահսկման ցուցակ

• Հաստատեք, որ բոլոր նմուշներում EV սպիտակուցային-հավասարությունով մուտքային պայմանն նույնն է։
• Օգտագործեք հարմարեցված կամ հավասարակշռված նմուշների մշակման դասակարգումներ։
• Պահեք մեթանոլի ծավալը, սոնիկացիայի ժամանակը, չորացման ժամանակը և հարստացման ծավալը նույնը։
• Հետևեք պեպտիդի բերքատվությանը և սպիտակուցների ընդհանուր նույնականացումներին։
• Ստուգեք բաց թողված քայքայման տոկոսը և պեպտիդների երկարության բաշխումը։
• Ստուգեք քրոմատոգրաֆիկ գագաթի ձևը և պահման-ժամանակների վերարտադրելիությունը։
• Մուտքագրեք դատարկ նմուշներ փոխանցման վերահսկման համար։
• Օգտագործեք միավորված QC նմուշները ավելի մեծ ուսումնասիրությունների համար։
• Անվտանգ կերպ գնահատեք կրկնօրինակների փոփոխականության գործակիցը։
• Օգտագործեք PCA կամ առնչվող մեթոդներ խմբային ազդեցությունները կամ բացառիկ նմուշները նույնականացնելու համար։

Պրոտոկոլային առաջարկություններ

Այս աշխատանքային հոսքը հրապարակելիս կամ փաստաթղթավորելիս նշեք EV-ի մուտքային չափը, հանդերձանքի ֆորմատը, մեթանոլի ծավալը, UIP400MTP-ի амպլիտուդան և սոնիկացիայի տևողությունը, կենտրոնացման պայմանները, չորացման մեթոդը, հարստացման缓冲չափը, անզենիմի կոնցենտրացիան, հարստացման տևողությունը, թթվայնացման պայմանները, LC-MS/MS հարթակը, ձեռքբերման ռեժիմը, ծրագրային ապահովման տարբերակը, տվյալների բազան, FDR շեմը, նորմալացման մեթոդը և վիճակագրական աշխատանքային հոսքը։
Բոլոր Hielscher միկրապլատֆորմային սոնիկատորները ավտոմատ կերպով գրանցում են կարևոր գործընթացի պարամետրերը, ինչպիսիք են ամպլիտուդան, սոնիկացիայի տևողությունն ու ջերմաստիճանը՝ նշված ամսաթվով և ժամով, որպես CVS ֆայլ ինտեգրված SD-քարտում։ Տվյալների արձանագրումը վերարտադրելիության և որակի վերահսկման համար երբեք այսքան հեշտ չէր։

Ուսումնասիրությունը մանրամասն. EV Shotgun Proteomics PLA2G12A ուսումնասիրության մեջ

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
The downstream LC-MS/MS method used nano-flow reversed-phase separation coupled to a Q-Exactive HF Orbitrap mass spectrometer. Samples were trapped on a C18 pre-column, then separated on a 50 µm inner-diameter analytical column at 200 nL/min and 40°C. The gradient ran from low organic solvent to 35% solvent B over 60 minutes, followed by high-organic washing and re-equilibration. MS acquisition was performed in positive-ion mode using data-independent acquisition with higher-energy collisional dissociation. DIA raw files were analyzed using DIA-NN 1.8 with an in silico predicted spectral library.