Պարաֆինազերծում և սպիտակուցների էքստրակցիա FFPE հյուսվածքներից

Հեշտացրեք սպիտակուցների էքստրակցիան ֆորմալինով ֆիքսված և պարաֆինում ներառված (FFPE) հյուսվածքային կտրվածքներից՝ կիրառելով պարաֆինազերծման, լուծելիացման և VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային մշակիչով մշակման օպտիմալացված համակցություն։ Այս արձանագրությունն աջակցում է հետագա՝ զանգվածային սպեկտրաչափության վրա հիմնված պրոտեոմիկային և համատեղելի է SP3 մաքրման ու ֆերմենտային մարսման աշխատանքային ընթացակարգերի հետ։

Այս ստանդարտ գործառնական ընթացակարգը (SOP) նախատեսված է լաբորատոր անձնակազմի համար, որը կատարում է FFPE հյուսվածքային նմուշների պրոտեոմային վերլուծություն՝ կիրառելով բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային մշակում։ Այն օպտիմալացված է մինչև տասը FFPE նմուշի զուգահեռ մշակման համար՝ VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային մշակիչի կիրառմամբ։

Արձանագրություն. սպիտակուցների էքստրակցիա FFPE նմուշներից՝ VialTweeter սարքի կիրառմամբ

Նյութեր և ռեագենտներ

Ռեագենտներ

• Քսիլոլ (հյուսվածաբանական մաքրության)
• Էթանոլ (բացարձակ 96%)
• Լիզիսի բուֆեր.

6 M գուանիդինի հիդրոքլորիդ
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (տրիս(2-կարբօքսիէթիլ)ֆոսֆին)
40 mM CAA (2-քլորացետամիդ)

• Պրոտեազի ինհիբիտոր (ըստ ցանկության, օրինակ՝ cOmplete™ mini EDTA-free)

Սարքավորումներ

• VialTweeter բազմափորձանոթային ուլտրաձայնային մշակիչ
• 1,5 mL կամ 2,0 mL միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթներ՝ նյութերի ցածր կապմամբ
• Տաքացնող բլոկ կամ ինկուբատոր (95°C և 80°C կարգավորումներով)
• Միկրոցենտրիֆուգ
• Թերմոմիքսեր (ըստ ցանկության, սակայն խորհուրդ է տրվում)

Նմուշի սկզբնական քանակը

• Յուրաքանչյուր նմուշի (այսինքն՝ յուրաքանչյուր սրվակի) համար՝ 10 µm հաստությամբ FFPE հյուսվածքի 1–2 կտրվածք

ԿԱՄ

• Յուրաքանչյուր նմուշի (այսինքն՝ յուրաքանչյուր սրվակի) համար՝ ընդհանուր առմամբ ~100 µg հյուսվածք

Նշում. միկրոտոմային կտրվածքներ պատրաստելիս օգտագործեք նոր շեղբեր՝ պարաֆինի մնացորդներով աղտոտումը նվազագույնի հասցնելու համար։

Ընթացակարգ

1. Պարաֆինազերծում
   1. FFPE կտրվածքները տեղափոխեք նյութերի ցածր կապմամբ միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթների մեջ։
   2. Ավելացրեք 1 mL քսիլոլ և կարճատև խառնեք վորտեքսով։
   3. Ինկուբացրեք 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում։
   4. Ցենտրիֆուգեք 14 000 × g պայմաններում 2 րոպե, ապա հեռացրեք վերնստվածքային հեղուկը։
   5. Կրկնեք քսիլոլով լվացումը ևս մեկ անգամ (քայլեր 2–4)։
   6. Նստվածքը լվացեք 1 mL 96% էթանոլով, խառնեք վորտեքսով, ապա ցենտրիֆուգեք 14 000 × g պայմաններում 2 րոպե։ Հեռացրեք վերնստվածքային հեղուկը։
   7. Կրկնեք էթանոլով լվացումը ևս մեկ անգամ (ընդհանուր առմամբ՝ 2 լվացում էթանոլով)։
   8. Նստվածքը չորացրեք օդում 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում՝ կափարիչները բաց թողնելով, որպեսզի մնացորդային էթանոլը գոլորշիանա։
2. Սպիտակուցների էքստրակցիա և ուլտրաձայնային մշակում
   1. Յուրաքանչյուր չոր նստվածքին ավելացրեք 200 µL լիզիսի բուֆեր։

      Նշում. թեև ուլտրաձայնային մշակիչը տեղավորում է մինչև 1 mL, հետագա մշակման համար օպտիմալ է 200 µL ծավալը։

   2. Խառնեք վորտեքսով կամ պիպետով զգուշորեն ներծծելով ու արտամղելով։
3. Առաջին ջերմային ինկուբացում
   1. Փորձանոթներն ինկուբացրեք 95 °C ջերմաստիճանում 30 min՝ թերմոմիքսերի կամ տաքացնող բլոկի միջոցով թափահարելով 400 rpm արագությամբ։
   2. Թողեք, որ նմուշները սառչեն սենյակային ջերմաստիճանում 5 min։
4. Առաջին ուլտրաձայնային մշակում՝ VialTweeter սարքով
   1. Փորձանոթները տեղադրեք VialTweeter սարքի մեջ։
   2. VialTweeter UP200St սարքի համար սահմանեք ստորև նշված արժեքները և կատարեք ուլտրաձայնային մշակում։
Ուլտրաձայնային մշակիչի կարգավորումներ
• Ամպլիտուդը (A) սահմանեք 100%
• Պուլսացիայի ռեժիմը (C) սահմանեք 100%
• Պարբերաշրջանի ժամաչափ՝ միացված
• Միացման տևողություն՝ 60s
• Անջատման տևողություն՝ 30s
• Սահմանային արժեք՝ 15 min (համապատասխանում է 10 ցիկլի)
(Հաշվարկի նշում. (60 s միացված + 30 s անջատված) × 10 ցիկլ = 900 s = 15 min)
5. Երկրորդ ջերմային ինկուբացում
   Հանեք փորձանոթները և կրկին ինկուբացրեք 95 °C ջերմաստիճանում 15 min՝ 400 rpm արագությամբ։
6. Երկրորդ ուլտրաձայնային մշակում
   Կրկնեք ուլտրաձայնային մշակումը VialTweeter սարքով՝ նույն կարգավորումներով (ինչպես վերևում), ևս 10 ցիկլ (ընդհանուր՝ 15 min)։
7. Լիզատի պարզեցում
   1. Նմուշները ցենտրիֆուգեք 13 000 × g պայմաններում 10 min՝ 23°C ջերմաստիճանում (սենյակային ջերմաստիճան)։
   2. Վերնստվածքային հեղուկը զգուշորեն հավաքեք նոր 2,0 mL Safe-lock Eppendorf փորձանոթի մեջ։ Խուսափեք նստվածքը խախտելուց։
8. Հետագա մշակում
   Լիզատն այժմ պատրաստ է SP3 մաքրման և ֆերմենտային մարսման համար։

Նշումներ և լավագույն գործելակերպեր

1. Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում գերտաքացման ռիսկը նվազեցվում է միացման և անջատման ծրագրավորված ցիկլերով։
2. Ուլտրաձայնային մշակումից հետո խուսափեք վորտեքսով խառնելուց՝ սպիտակուցների ագրեգացումը կանխելու համար։

Թափոնների հեռացում և անվտանգություն

Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր լաբորատոր չափերի ուլտրաձայնային մշակիչների մոտավոր մշակման կարողության մասին.