Ապապարաֆինացում և սպիտակուցի արդյունահանում FFPE-ից

Հեշտացնել սպիտակուցի արդյունահանումը ֆորմալինի ֆիքսված պարաֆինով ներկառուցված (FFPE) հյուսվածքների հատվածներից՝ օգտագործելով դեպարաֆինացման, լուծույթի և ձայնային ձայնագրման օպտիմիզացված համադրություն VialTweeter բազմախողովակային ուլտրաձայնային սարքով: Այս արձանագրությունն աջակցում է զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վրա հիմնված պրոտեոմիկան և համատեղելի է SP3 մաքրման և ֆերմենտային մարսողության աշխատանքային հոսքերի հետ:

Այս SOP-ը նախատեսված է լաբորատոր անձնակազմի համար, որը ներգրավված է FFPE հյուսվածքների նմուշների պրոտեոմիկ վերլուծության մեջ՝ օգտագործելով բարձր արդյունավետության ձայնային ախտահանում: Այն օպտիմիզացված է VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ի միջոցով զուգահեռ մշակված մինչև տասը FFPE նմուշների համար:

Արձանագրություն. FFPE նմուշներից սպիտակուցի արդյունահանում VialTweeter-ի միջոցով

Նյութեր և ռեակտիվներ

ռեակտիվներ

• Քսիլեն (հյուսվածքաբանության աստիճան)
• Էթանոլ (բացարձակ 96%)
• Լիզիսի բուֆեր.

6 M գուանիդինի հիդրոքլորիդ
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 մՄ TCEP (տրիս(2-կարբոքսիէթիլ) ֆոսֆին)
40 մՄ CAA (2-Քլորացետամիդ)

• Պրոտեազի ինհիբիտոր (ըստ ցանկության, օրինակ՝ cOmplete™ մինի EDTA առանց)

Սարքավորումներ

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1,5 մլ կամ 2,0 մլ ցածր կապող միկրոցենտրիֆուգային խողովակներ
• Ջերմային բլոկ կամ ինկուբատոր (95°C և 80°C պարամետրեր)
• Միկրոկենտրիֆուգ
• Թերմոմիքսեր (ըստ ցանկության, բայց խորհուրդ է տրվում)

Նմուշի մուտքագրում

• 1-2 հատված 10 մկմ հաստությամբ FFPE հյուսվածքի մեկ նմուշի համար (այսինքն՝ մեկ սրվակի համար)

կամ

• Ընդհանուր ~100 մկգ հյուսվածք մեկ նմուշի համար (այսինքն, մեկ սրվակի համար)

Նշում. Օգտագործեք թարմ շեղբեր միկրոտոմի համար՝ նվազագույնի հասցնելու պարաֆինի բեկորների աղտոտումը:

Ընթացակարգը

1. դեպարաֆինացում
   1. Տեղափոխեք FFPE հատվածները ցածր կապող միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ:
   2. Ավելացնել 1 մլ քսիլեն, հակիրճ պտտեցնել։
   3. Ինկուբացնել 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում։
   4. Ցենտրիֆուգ 14000 × գ 2 րոպե; վերացնել վերին նյութը:
   5. Կրկնեք քսիլենով լվացումը ևս մեկ անգամ (Քայլեր 2–4):
   6. Գնդիկը լվանալ 1 մլ 96% էթանոլով, պտտեցնել, ապա ցենտրիֆուգել 14000 × գ 2 րոպեով: Հեռացրեք վերին նյութը:
   7. Կրկնել էթանոլով լվացումը ևս մեկ անգամ (ընդհանուր 2 էթանոլային լվացում):
   8. Գնդիկը չորացրեք օդով 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում բաց կափարիչներով՝ մնացորդային էթանոլը գոլորշիացնելու համար:
2. Սպիտակուցի արդյունահանում և արտազատում
   1. Յուրաքանչյուր չոր գնդիկի վրա ավելացրեք 200 µL լիզի բուֆեր:
      Ծանոթագրություն. Թեև ձայնային սարքը տեղավորում է մինչև 1 մլ, 200 µL-ն օպտիմալ է ներքևում մշակման համար:

   2. Խառնում ենք պտտեցնելով կամ նուրբ պիպերթինգով:
3. Առաջին ջերմային ինկուբացիա
   1. Խողովակները ինկուբացնում են 95 °C ջերմաստիճանում 30 րոպե, խառնելով 400 պտույտ/րոպեում, օգտագործելով ջերմախառնիչ կամ ջերմային բլոկ:
   2. Թող նմուշները սառչեն սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե:
4. Առաջին Sonication-ը VialTweeter-ով
   1. Տեղադրեք խողովակները VialTweeter-ի մեջ:
   2. Սահմանեք VialTweeter UP200St-ը ստորև նշված արժեքների վրա և կատարեք ձայնային ազդանշան:
Sonicator-ի կարգավորումներ
• Սահմանել ամպլիտուդը (A) 100%
• Պուլսացիայի ռեժիմը (C) սահմանեք 100%
• Ժամանակահատվածի ժամացույց՝ միացված
• Ժամանակին` 60-ական թթ
• Անջատման ժամանակը՝ 30 վրկ
• Սահմանային արժեքը՝ 15 րոպե (համապատասխանում է 10 ցիկլին)
(Հաշվարկային նշում. (60 վ միացված + 30 վրկ անջատված) × 10 ցիկլ = 900 վ = 15 րոպե)
5. Երկրորդ ջերմային ինկուբացիա
   Հեռացրեք խողովակները և նորից ինկուբացրեք 95 °C ջերմաստիճանում 15 րոպե, 400 պտ/րոպ.
6. Երկրորդ Sonication
   Կրկնեք Sonication-ը VialTweeter-ի վրա՝ օգտագործելով նույն կարգավորումները (ինչպես վերևում) ևս 10 ցիկլով (ընդհանուր 15 րոպե):
7. Լիզատի պարզաբանում
   1. Ցենտրիֆուգեք նմուշները 13000 × գ 10 րոպե 23°C-ում (սենյակային ջերմաստիճանում):
   2. Զգուշորեն հավաքեք վերին նյութը նոր 2,0 մլ Safe-lock Eppendorf խողովակի մեջ: Խուսափեք գնդիկի խանգարումից:
8. Վերամշակում
   Լիզատն այժմ պատրաստ է SP3 մաքրման և ֆերմենտային մարսողության համար:

Նշումներ և լավագույն պրակտիկա

1. Ձայնային արտանետման ժամանակ գերտաքացման ռիսկը մեղմվում է ծրագրավորված ON/OFF հեծանիվով:
2. Խուսափեք պտտվելուց հետո-ձայնացումից՝ սպիտակուցների կուտակումը կանխելու համար:

Թափոնների հեռացում և անվտանգություն

Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր լաբորատոր չափի ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորությունը.