FFPE բարձր թողունակության նմուշի նախապատրաստում. սպիտակուցի արդյունահանում և նուկլեինաթթվի կտրում

ՀՏՀ
Ստորև մենք պատասխանում ենք հաճախակի տրվող հարցերին, որոնք վերաբերում են FFPE հյուսվածքների պատրաստմանը և FFPE նմուշների ուլտրաձայնային ախտորոշմանը:

Ինչպե՞ս է պատրաստվում FFPE հյուսվածքը:

FFPE հյուսվածքի պատրաստման քայլեր. Թարմ հյուսվածքի մանրակրկիտ մշակումն ու մշակումը կարևոր նշանակություն ունեն բարձրորակ FFPE նմուշներ ստեղծելու համար: Բջջային ճարտարապետության, նուկլեինաթթուների և սպիտակուցների պահպանման ապահովումը կարևոր է ճշգրիտ ներքևի վերլուծության համար: Յուրաքանչյուր քայլ՝ հավաքումից մինչև ներկառուցում, պահանջում է ճշգրտություն՝ տարբեր անալիզների համար նմուշի ամբողջականությունը պահպանելու համար, ներառյալ հյուսվածաբանական հետազոտությունը, իմունոհիստոքիմիան և մոլեկուլային հետազոտությունները: Պատշաճ կերպով կատարված այս ամրագրման և ներկառուցման գործընթացը երաշխավորում է, որ պահպանված հյուսվածքը ճշգրիտ արտացոլում է in vivo վիճակը՝ հնարավորություն տալով հուսալի ախտորոշման և հետազոտական արդյունքների:
Մենք ձեզ ուղեկցում ենք FFPE հյուսվածքների նմուշների ներկառուցման գործընթացի 6 հիմնական քայլերով:

• Հյուսվածքների հավաքածու
  Կենդանի կաթնասունների և հյուսվածքային կուլտուրաների բիոպսիան երկուսն էլ կենսունակ աղբյուրներ են FFPE նմուշի պատրաստման համար թարմ հյուսվածք ստանալու համար:
  Կարևոր է օգտագործել ասեպտիկ տեխնիկա. աղտոտումից խուսափելու համար օգտագործեք ստերիլ գործիքներ և ձեռնոցներ: Իդեալում, հյուսվածքները հավաքեք ստերիլ միջավայրում, ինչպիսին է վիրաբուժական հավաքածուն կամ շերտավոր հոսքի գլխարկը:
  Քանի որ նմուշը շատ փխրուն է, դրա զգայուն մշակումը կարևոր է. նվազագույնի հասցրեք մշակման հետաձգումները և անմիջապես սկսեք հյուսվածքի հետագա մշակումը հեռացումից հետո: Սա շատ կարևոր է ավտոլիզի և դեգրադացիայի կանխարգելման համար: Հյուսվածքը պահել սենյակային ջերմաստիճանում; խուսափեք սառցակալումից, քանի որ այն կարող է առաջացնել սառցե բյուրեղների ձևավորում և հյուսվածքների վնասում:
• Հյուսվածքների ֆիքսացիա
  Նախ, հյուսվածքը մշակվում է ֆիքսող լուծույթով. Օգտագործեք 10% չեզոք բուֆերացված ֆորմալին (NBF), որը համարժեք է 4% ֆորմալդեհիդին ջրի մեջ, բուֆերացված մինչև չեզոք pH:
  Հյուսվածքն ամբողջությամբ ընկղմեք ֆորմալինի մեջ։ Ապահովեք ֆիքսատորի և հյուսվածքի ծավալի հարաբերակցությունը առնվազն 10:1: Ֆիքսման ժամանակը սովորաբար տատանվում է 6-ից 24 ժամ՝ կախված հյուսվածքի տեսակից և չափից: Կարևոր է, որ ֆիքսատորը կարողանա մանրակրկիտ ներթափանցել հյուսվածքի մեջ: Այնուամենայնիվ, չափից ավելի ամրացումը կարող է հանգեցնել խաչաձև կապի, որը բարդացնում է անտիգենների որոնումը, մինչդեռ անբավարար ամրագրումը կարող է հանգեցնել հյուսվածքների վատ պահպանման:
• Հյուսվածքների կտրում
  Երկրորդ, հյուսվածքը կտրեք մոտ 3-5 մմ հաստությամբ, որպեսզի թույլ տա ֆիքսատորի համապատասխան ներթափանցումը: Ապահովել հյուսվածքի ճիշտ կողմնորոշումը համապատասխան հյուսվածքաբանական կառուցվածքները գրավելու համար: Սա հեշտացնում է արդյունահանման գործընթացը, երբ հյուսվածքը հետագայում օգտագործվում է վերլուծության համար:
• Ֆիքսված նմուշի մշակում
  Այժմ ֆիքսված հյուսվածքը պետք է ջրազրկվի. ամրացումից հետո հյուսվածքը պետք է ջրազրկվի՝ պարաֆին մոմով մանրակրկիտ ներթափանցումն ապահովելու համար: Անցեք հյուսվածքը էթանոլի աստիճանավորված շարքի միջով (70%, 80%, 90% և 100%) ջուրը հեռացնելու համար:
  Քլիրինգ քսիլենով. պարաֆինային մոմը ջրի մեջ չի լուծվում, բայց քսիլենում լուծելի է: Հետեւաբար, հյուսվածքի ջուրը պետք է փոխարինվի քսիլենով: Այնուամենայնիվ, քսիլենն ինքնին ջրում անլուծելի է, բայց լուծվում է ալկոհոլի մեջ, ինչը պահանջում է միջանկյալ քայլ, որտեղ ջուրը սկզբում փոխարինվում է սպիրտով: Ընկղմեք հյուսվածքը քսիլենի կամ քսիլենի փոխարինիչի մեջ՝ էթանոլը հեռացնելու և հյուսվածքը պատրաստելու պարաֆին ներթափանցելու համար:
  Ներծծում պարաֆինով. Ներդրեք հյուսվածքը հալած պարաֆին մոմում, ապահովելով ամբողջական ներթափանցումը: Այս քայլը սովորաբար ներառում է պարաֆինի մի քանի փոփոխություն՝ մանրակրկիտ ներծծում ապահովելու համար:
• Հյուսվածքի ներկառուցում
  Այս քայլով հյուսվածքը ձևավորվում է հյուսվածքի բլոկի մեջ. Տեղադրեք հյուսվածքը ցանկալի կողմնորոշմամբ կաղապարի մեջ և վրան լցրեք հալած պարաֆին: Թույլ տվեք, որ պարաֆինն ամրանա՝ սառչելով սենյակային ջերմաստիճանում կամ սառը ափսեի վրա։
• Բաժանում և տեղադրում
  Միկրոտոմիա. Ներկառուցված հյուսվածքը կտրատելու համար օգտագործեք միկրոտոմա՝ պարաֆինային բլոկից բարակ հատվածներ (սովորաբար 4-5 միկրոմետր) կտրելու համար: Այնուհետև նմուշը տեղադրվում է, հատվածները տեղադրելով ապակե սլայդների վրա՝ հետագա ներկման և մանրադիտակային վերլուծության համար:
  Վերջապես, ստուգեք հիստոլոգիայի որակը. Գնահատեք առաջին հատվածները մանրադիտակի տակ՝ ապահովելու պատշաճ ամրագրում և մշակում: Կարգավորեք արձանագրությունները ըստ անհրաժեշտության՝ հիմնվելով հյուսվածքի տեսակի և դիտարկվող որակի վրա:

 
FFPE հյուսվածքները կարող են օգտագործվել ՌՆԹ, ԴՆԹ և սպիտակուցներ վերականգնելու, ինչպես նաև քաղցկեղի կամ այլ հիվանդության նշաններ հայտնաբերելու համար: Դրանք կարող են պահպանվել տարիներ շարունակ և հանդիսանում են էական մասն այն բանի, թե ինչպես են հետազոտողները և բժիշկները օգտագործում հյուսվածքների նմուշները ախտորոշման և հետազոտության համար:

Որո՞նք են ընդհանուր խնդիրներն ու մարտահրավերները FFPE հյուսվածքի հետ:

Ֆորմալինով ֆիքսված, պարաֆինով ներկառուցված (FFPE) հյուսվածքների նմուշները լայնորեն օգտագործվում են հետազոտության և ախտորոշման մեջ, սակայն դրանք ներկայացնում են մի քանի մարտահրավերներ և ընդհանուր խնդիրներ.

• Կենսամոլեկուլների քայքայումը. Երկարատև ֆիքսումը կարող է հանգեցնել ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և սպիտակուցների քայքայմանը, ինչը դժվարացնում է բարձրորակ նուկլեինաթթուների կամ սպիտակուցների արդյունահանումը հոսանքով ներքևի կիրառման համար: Հյուսվածքների պահպանման համար էական նշանակություն ունի ճիշտ ֆիքսացիան (խուսափելով թերի և ավելորդ ամրացումից):

Խաչաձև կապ. Ֆորմալինի ֆիքսացիան առաջացնում է սպիտակուցների և նուկլեինաթթուների խաչաձև կապ, ինչը կարող է խանգարել մոլեկուլային վերլուծությանը և ազդել իմունոհիստոքիմիայի և այլ վերլուծությունների ճշգրտության վրա:

• Հակագենային դիմակավորում. Ֆիքսացման գործընթացը կարող է քողարկել հակագենային տեղամասերը՝ նվազեցնելով հակամարմինների կապակցման արդյունավետությունը իմունոհիստոքիմիայի և այլ իմունոլոգիական վերլուծությունների ժամանակ: Սա հաճախ պահանջում է անտիգենի որոնում, ընթացակարգ, որի միջոցով էպիտոպի քողարկումը հակադարձվում է և էպիտոպ-հակամարմին կապը վերականգնվում է: Այնուամենայնիվ, լիարժեք հակագենիկությունը միշտ չէ, որ կարող է վերականգնվել:
• Փոփոխական ամրագրման որակ. Ֆիքսման ժամանակների և պայմանների տարբերությունները կարող են հանգեցնել նմուշի որակի անհամապատասխանության՝ ազդելով արդյունքների վերարտադրելիության և համեմատելիության վրա: Օգտագործեք հուսալի ամրագրման արձանագրություններ և խուսափեք թերևս ամրագրումից:
• ԴՆԹ-ի վնաս և մասնատում. FFPE նմուշների ֆորմալինի ֆիքսացիան կարող է առաջացնել ԴՆԹ-ի տարբեր տեսակի վնասներ, այդ թվում՝ ցիտոզինի դեզամինացիա (C-ից T մուտացիաներ), օքսիդատիվ վնաս (օրինակ՝ 8-օքսո-գուանին, որը հանգեցնում է G-ից T մուտացիաների), ինչպես նաև ֆիզիկական խանգարումներ, ինչպիսիք են նիկերը, բացերը և աբազային տեղամասերը, որոնք խոչընդոտում են ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությանը: Ֆորմալինի ֆիքսման գործընթացը կարող է առաջացնել ԴՆԹ-ի մասնատում` բարդացնելով գենետիկական և գենոմային անալիզները, ինչպիսիք են PCR-ն և հաջորդականությունը:
• ՌՆԹ որակ: FFPE հյուսվածքներից արդյունահանվող ՌՆԹ-ն հաճախ մասնատված և քիմիապես ձևափոխված է, ինչը դժվար է դարձնում բարձրորակ տրանսկրիպտոմիկ անալիզներ կատարելը:
• Սպիտակուցի փոփոխություններ. Ֆորմալինը կարող է առաջացնել սպիտակուցների քիմիական փոփոխություններ՝ ազդելով դրանց կառուցվածքի և ֆունկցիայի վրա, ինչը կարող է խանգարել պրոտեոմային անալիզներին:
• Նմուշների մշակման արտեֆակտներ. Ներկառուցման և հատվածավորման գործընթացում մեխանիկական սթրեսը և ջերմությունը կարող են առաջացնել արտեֆակտներ և առաջացնել հյուսվածքի հետագա վնաս:
• Փաթեթից խմբաքանակի փոփոխականություն. Տարբեր խմբաքանակների միջև ամրագրման և ներկառուցման արձանագրությունների տատանումները կարող են հանգեցնել արդյունքների զգալի փոփոխականության՝ բարդացնելով ուսումնասիրությունների միջև համեմատությունները:
• Պահպանման խնդիրներ. FFPE բլոկների երկարաժամկետ պահպանումը կարող է ժամանակի ընթացքում հանգեցնել լրացուցիչ քայքայման և նուկլեինաթթվի ամբողջականության կորստի՝ ազդելով հետահայաց ուսումնասիրությունների համար արխիվային նմուշների կենսունակության վրա:

Օպտիմիզացված արձանագրությունների օգտագործումը, նմուշների զգույշ մշակումը և առաջադեմ տեխնիկայի կիրառումը օգնում են բարելավել FFPE հյուսվածքներից ստացված տվյալների որակը և հուսալիությունը:

Ո՞րն է տարբերությունը FFPE-ի և սառեցված հյուսվածքի միջև:

FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) հյուսվածքը պահպանվում է ֆորմալինի միջոցով՝ հյուսվածքը ամրացնելու համար, այնուհետև տեղադրվում է պարաֆին մոմում, ինչը թույլ է տալիս երկարաժամկետ պահել սենյակային ջերմաստիճանում՝ պահպանելով հյուսվածքների մորֆոլոգիան: Ի հակադրություն, սառեցված հյուսվածքը արագորեն պահպանվում է սառեցման միջոցով, որն ավելի լավ է պահպանում նուկլեինաթթուների և սպիտակուցների ամբողջականությունը, բայց պահանջում է պահեստավորում շատ ցածր ջերմաստիճանում:

Ի՞նչ քիմիական նյութեր են օգտագործվում FFPE ներկառուցման համար:

Քիմիական նյութերը, որոնք օգտագործվում են FFPE ներկառուցման համար, սովորաբար ներառում են ֆորմալին` ամրագրման համար և պարաֆին մոմ` ներկառուցման համար: FFPE ներկառուցման համար հյուսվածքները սովորաբար ամրացվում են՝ օգտագործելով կամ 10% (v/v) չեզոք բուֆերացված ֆորմալին (FA) կամ թարմ պատրաստված 4% (w/v) ֆորմալդեհիդի լուծույթ (PFA), որը պատրաստված է պարաֆորմալդեհիդի փոշիից: Ֆորմալինը, որը ֆորմալդեհիդի լուծույթ է ջրի մեջ, բուֆերացված է մինչև չեզոք pH՝ պահպանելու հյուսվածքների մորֆոլոգիան և կանխելու ավելորդ խաչաձեւ կապը: Պարաֆորմալդեհիդի վրա հիմնված լուծույթը նաև ապահովում է արդյունավետ ամրացում՝ խաչաձև կապակցելով սպիտակուցները՝ դրանով իսկ կայունացնելով հյուսվածքի կառուցվածքը պարաֆին մոմում հետագա ներկառուցման համար: Այս քիմիկատները անհրաժեշտ են հյուսվածքների ամբողջականության և մորֆոլոգիայի պահպանման համար ամրացման և ներկառուցման գործընթացում:

Ինչպե՞ս է պարաֆինը հեռացվում FFPE նմուշներից:

FFPE նմուշներից պարաֆին հեռացնելու համար հյուսվածքների հատվածները սովորաբար ենթարկվում են մի շարք քսիլենային լվացումների, որին հաջորդում է ռեհիդրացիա՝ սպիրտների դասավորված շարքի և վերջապես ջրի միջոցով: Քանի որ քսիլենը շատ թունավոր է և առողջության հետ կապված վտանգներ է ներկայացնում, ինչպիսիք են շնչառական խնդիրները, մաշկի գրգռումը և պոտենցիալ երկարաժամկետ ազդեցությունը կրկնվող ազդեցության դեպքում, պարաֆինի ուլտրաձայնային հեռացումը շատ լաբորատորիաներում ի հայտ է գալիս որպես խոստումնալից այլընտրանք: Այս մեթոդը օգտագործում է ինտենսիվ ուլտրաձայնային ալիքներ՝ պարաֆինն արդյունավետ և անվտանգ հեռացնելու համար՝ առանց քսիլենի նման թունավոր լուծիչների անհրաժեշտության, դրանով իսկ նվազեցնելով լաբորատոր անձնակազմի ռիսկը և ստեղծելով ավելի անվտանգ աշխատանքային միջավայր:

Որքա՞ն ժամանակ պետք է ամրացնեմ իմ հյուսվածքները FFPE նմուշի լավ որակի համար:

Ֆիքսացիայի տևողության վերաբերյալ ընդհանուր առաջարկությունները սովորաբար առաջարկում են հյուսվածքների նմուշները ֆորմալինի մեջ ամրացնել 24-ից 48 ժամ: Այս տևողությունը, ընդհանուր առմամբ, բավարար է հյուսվածքների մորֆոլոգիան և բջջային կառուցվածքները պահպանելու համար՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով ավելորդ ամրացումը, ինչը կարող է հանգեցնել նուկլեինաթթուների և սպիտակուցների չափազանց խաչաձև կապի և քայքայման: Այնուամենայնիվ, ֆիքսման օպտիմալ ժամանակը կարող է տարբեր լինել՝ կախված հյուսվածքի չափից և տեսակից, ավելի փոքր կամ ավելի նուրբ նմուշներով, որոնք պահանջում են ավելի կարճ ամրացման ժամանակներ: Շատ կարևոր է հավասարակշռել համարժեք ֆիքսացիան՝ կանխելու հյուսվածքների աուտոլիզը և դեգրադացիան՝ միաժամանակ խուսափելով երկարատև ֆիքսացիայից, որը կարող է բարդացնել մոլեկուլային անալիզները: