FFPE նմուշների պատրաստում բարձր թողունակությամբ. սպիտակուցների էքստրակցիա և նուկլեինաթթուների սահքային մասնատում

Հաճախ տրվող հարցեր
Ստորև պատասխանում ենք հաճախ տրվող հարցերին, որոնք վերաբերում են FFPE հյուսվածքների պատրաստմանը և FFPE նմուշների ուլտրաձայնային մշակմանը։

Ինչպե՞ս է պատրաստվում FFPE հյուսվածքը։

FFPE հյուսվածքի նախապատրաստման քայլերը. թարմ հյուսվածքի մանրակրկիտ գործածումն ու մշակումը վճռորոշ են բարձրորակ FFPE նմուշներ ստանալու համար։ Բջջային կառուցվածքի, նուկլեինաթթուների և սպիտակուցների պահպանման ապահովումն էական է հետագա ճշգրիտ վերլուծության համար։ Յուրաքանչյուր քայլ – հավաքումից մինչև ներփակում – պահանջում է ճշգրտություն՝ տարբեր վերլուծությունների, այդ թվում՝ հյուսվածաբանական հետազոտության, իմունահյուսվածաքիմիայի և մոլեկուլային ուսումնասիրությունների համար նմուշի ամբողջականությունը պահպանելու նպատակով։ Պատշաճ կատարման դեպքում ֆիքսման և ներփակման այս գործընթացն ապահովում է, որ պահպանված հյուսվածքը ճշգրիտ արտացոլի կենդանի օրգանիզմում առկա վիճակը՝ հնարավորություն տալով ստանալ ախտորոշման և հետազոտության հուսալի արդյունքներ։
Մենք ձեզ կներկայացնենք FFPE հյուսվածքի նմուշների ներփակման գործընթացի 6 հիմնական քայլերը։

• Հյուսվածքի հավաքում
  Կենդանի կաթնասուններից վերցված բիոպսիոն նմուշները և հյուսվածքային կուլտուրաները երկուսն էլ պիտանի աղբյուրներ են FFPE նմուշների նախապատրաստման համար թարմ հյուսվածք ստանալու նպատակով։
  Կարևոր է կիրառել ասեպտիկ տեխնիկա. աղտոտումից խուսափելու համար օգտագործեք ստերիլ գործիքներ և ձեռնոցներ։ Իդեալական տարբերակում հյուսվածքները հավաքեք ստերիլ միջավայրում, օրինակ՝ վիրահատարանում կամ լամինար հոսքով պահարանում։
  Քանի որ նմուշը շատ փխրուն է, դրա զգույշ գործածումն էական է. նվազագույնի հասցրեք մշակման ուշացումները և հյուսվածքի հեռացումից անմիջապես հետո սկսեք դրա հետագա մշակումը։ Սա վճռորոշ է աուտոլիզն ու քայքայումը կանխելու համար։ Հյուսվածքը պահեք սենյակային ջերմաստիճանում. խուսափեք սառեցումից, քանի որ այն կարող է առաջացնել սառցաբյուրեղներ և վնասել հյուսվածքը։
• Հյուսվածքի ֆիքսում
  Նախ՝ հյուսվածքը մշակվում է ֆիքսող լուծույթով. օգտագործեք 10% չեզոք բուֆերացված ֆորմալին (NBF), որը համարժեք է ջրում ֆորմալդեհիդի 4% լուծույթին՝ բուֆերացված մինչև չեզոք pH։
  Հյուսվածքն ամբողջությամբ ընկղմեք ֆորմալինի մեջ։ Ապահովեք ֆիքսող լուծույթի և հյուսվածքի ծավալների առնվազն 10:1 հարաբերակցություն։ Ֆիքսման տևողությունը սովորաբար տատանվում է 6-ից 24 ժամ՝ կախված հյուսվածքի տեսակից և չափից։ Կարևոր է, որ ֆիքսող նյութը կարողանա լիարժեք ներթափանցել հյուսվածքի մեջ։ Սակայն չափազանց երկար ֆիքսումը կարող է հանգեցնել խաչաձև կապերի առաջացման, ինչը բարդացնում է հակածինների վերականգնումը, մինչդեռ անբավարար ֆիքսումը կարող է հանգեցնել հյուսվածքի վատ պահպանման։
• Հյուսվածքի կտրտում
  Երկրորդ՝ հյուսվածքը կտրտեք մինչև մոտ 3–5 mm հաստության՝ ֆիքսող նյութի բավարար ներթափանցումն ապահովելու համար։ Ապահովեք հյուսվածքի ճիշտ կողմնորոշումը՝ համապատասխան հյուսվածաբանական կառուցվածքներն ընդգրկելու համար։ Սա հեշտացնում է էքստրակցիայի գործընթացը, երբ հյուսվածքը հետագայում օգտագործվում է վերլուծության համար։
• Ֆիքսված նմուշի մշակում
  Այժմ ֆիքսված հյուսվածքը պետք է ջրազրկել. ֆիքսումից հետո հյուսվածքն անհրաժեշտ է ջրազրկել՝ պարաֆինի լիարժեք ներթափանցումն ապահովելու համար։ Ջուրը հեռացնելու նպատակով հյուսվածքը հաջորդաբար անցկացրեք էթանոլի աճող խտությամբ լուծույթների շարքով (70%, 80%, 90% և 100%)։
  Պարզեցում քսիլոլով. պարաֆինը ջրում անլուծելի է, բայց լուծելի է քսիլոլում։ Հետևաբար, հյուսվածքի մեջ եղած ջուրը պետք է փոխարինել քսիլոլով։ Սակայն քսիլոլն ինքնին ջրում անլուծելի է, բայց լուծելի է սպիրտում, ինչի պատճառով անհրաժեշտ է միջանկյալ քայլ, որի ընթացքում ջուրը նախ փոխարինվում է սպիրտով։ Հյուսվածքն ընկղմեք քսիլոլի կամ քսիլոլի փոխարինիչի մեջ՝ էթանոլը հեռացնելու և հյուսվածքը պարաֆինով ներծծմանը նախապատրաստելու համար։
  Ներծծում պարաֆինով. հյուսվածքը ներփակեք հալված պարաֆինի մեջ՝ ապահովելով ամբողջական ներծծում։ Այս քայլը սովորաբար ներառում է պարաֆինի մի քանի փոխարինում՝ լիարժեք ներծծումն ապահովելու համար։
• Հյուսվածքի ներփակում
  Այս քայլում հյուսվածքը ձևավորվում է որպես հյուսվածքային բլոկ. հյուսվածքը ցանկալի կողմնորոշմամբ տեղադրեք կաղապարի մեջ և վրան լցրեք հալված պարաֆին։ Թույլ տվեք, որ պարաֆինը պնդանա՝ սառեցնելով սենյակային ջերմաստիճանում կամ սառը սալի վրա։
• Կտրվածքների պատրաստում և ամրացում
  Միկրոտոմիա. ներփակված հյուսվածքը շերտատելու համար միկրոտոմով պարաֆինային բլոկից կտրեք բարակ կտրվածքներ (սովորաբար՝ 4–5 միկրոմետր)։ Այնուհետև նմուշն ամրացվում է՝ կտրվածքները տեղադրելով առարկայական ապակիների վրա՝ հետագա ներկման և մանրադիտակային վերլուծության համար։
  Վերջում ստուգեք հյուսվածաբանական պատրաստուկի որակը. առաջին կտրվածքները գնահատեք մանրադիտակով՝ համոզվելու համար, որ ֆիքսումն ու մշակումը պատշաճ են կատարվել։ Անհրաժեշտության դեպքում ճշգրտեք ընթացակարգերը՝ ըստ հյուսվածքի տեսակի և դիտարկված որակի։

 
FFPE հյուսվածքները կարող են օգտագործվել ՌՆԹ, ԴՆԹ և սպիտակուցներ ստանալու, ինչպես նաև քաղցկեղի կամ այլ հիվանդության նշաններ հայտնաբերելու համար։ Դրանք կարող են պահպանվել տարիներ շարունակ և էական դեր ունեն ախտորոշման ու հետազոտությունների համար հետազոտողների և բժիշկների կողմից հյուսվածքային նմուշների օգտագործման գործում։

Որո՞նք են FFPE հյուսվածքների հետ կապված տարածված խնդիրներն ու դժվարությունները։

Ֆորմալինով ֆիքսված և պարաֆինում ներփակված (FFPE) հյուսվածքային նմուշները լայնորեն օգտագործվում են հետազոտություններում և ախտորոշման մեջ, սակայն դրանց հետ կապված են մի շարք դժվարություններ և տարածված խնդիրներ՝

• Կենսամոլեկուլների քայքայում՝ Երկարատև ֆիքսումը կարող է հանգեցնել ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և սպիտակուցների քայքայման՝ դժվարացնելով հետագա կիրառությունների համար բարձրորակ նուկլեինաթթուների կամ սպիտակուցների անջատումը։ Հյուսվածքի պահպանման համար էական է ճիշտ ֆիքսումը՝ խուսափելով անբավարար և չափազանց ֆիքսումից։

Խաչաձև կապերի առաջացում՝ Ֆորմալինով ֆիքսումն առաջացնում է սպիտակուցների և նուկլեինաթթուների խաչաձև կապեր, որոնք կարող են խոչընդոտել մոլեկուլային վերլուծությանը և ազդել իմունահյուսվածաքիմիական ու այլ հետազոտությունների ճշգրտության վրա։

• Հակածինների քողարկում՝ Ֆիքսման գործընթացը կարող է քողարկել հակածնային տեղամասերը՝ նվազեցնելով հակամարմինների կապման արդյունավետությունը իմունահյուսվածաքիմիական և այլ իմունաբանական հետազոտություններում։ Սա հաճախ պահանջում է հակածինների բացահայտում՝ ընթացակարգ, որի միջոցով վերացվում է էպիտոպի քողարկումը և վերականգնվում է էպիտոպի ու հակամարմնի կապումը։ Այնուամենայնիվ, հակածնայնությունը միշտ չէ, որ կարող է լիովին վերականգնվել։
• Ֆիքսման որակի փոփոխականություն՝ Ֆիքսման տևողության և պայմանների տարբերությունները կարող են հանգեցնել նմուշների որակի անհամաչափության՝ ազդելով արդյունքների վերարտադրելիության և համադրելիության վրա։ Օգտագործեք ֆիքսման հուսալի արձանագրություններ և խուսափեք անբավարար ու չափազանց ֆիքսումից։
• ԴՆԹ-ի վնասում և հատվածավորում՝ FFPE նմուշների ֆորմալինով ֆիքսումը կարող է առաջացնել ԴՆԹ-ի տարբեր տեսակի վնասումներ, ներառյալ ցիտոզինի դեամինացումը (C-ից T մուտացիաներ), օքսիդատիվ վնասումները (օրինակ՝ 8-oxo-guanine, որը հանգեցնում է G-ից T մուտացիաների), ինչպես նաև ֆիզիկական խախտումները, ինչպիսիք են միաշղթա ճեղքերը, բացերը և ազոտային հիմք չունեցող տեղամասերը, որոնք խոչընդոտում են ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությանը։ Ֆորմալինով ֆիքսման գործընթացը կարող է առաջացնել ԴՆԹ-ի հատվածավորում՝ բարդացնելով գենետիկական և գենոմային վերլուծությունները, ինչպիսիք են PCR հետազոտությունը և սեքվենավորումը։
• ՌՆԹ-ի որակ՝ FFPE հյուսվածքներից անջատված ՌՆԹ-ն հաճախ հատվածավորված և քիմիապես փոփոխված է լինում՝ դժվարացնելով բարձրորակ տրանսկրիպտոմային վերլուծությունների իրականացումը։
• Սպիտակուցների փոփոխություններ՝ Ֆորմալինը կարող է առաջացնել սպիտակուցների քիմիական փոփոխություններ՝ ազդելով դրանց կառուցվածքի և գործառույթի վրա, ինչը կարող է խանգարել պրոտեոմային վերլուծություններին։
• Նմուշների մշակման արտեֆակտներ՝ Ներփակման և կտրվածքների պատրաստման ընթացքում մեխանիկական լարումը և ջերմությունը կարող են առաջացնել արտեֆակտներ և հյուսվածքի լրացուցիչ վնասում։
• Խմբաքանակների միջև փոփոխականություն՝ Տարբեր խմբաքանակների ֆիքսման և ներփակման արձանագրությունների տարբերությունները կարող են հանգեցնել արդյունքների զգալի փոփոխականության՝ բարդացնելով հետազոտությունների միջև համեմատությունները։
• Պահպանման խնդիրներ՝ FFPE բլոկների երկարատև պահպանումը ժամանակի ընթացքում կարող է հանգեցնել լրացուցիչ քայքայման և նուկլեինաթթուների ամբողջականության կորստի՝ ազդելով հետահայաց ուսումնասիրություններում արխիվային նմուշների օգտագործման պիտանիության վրա։

Օպտիմալացված արձանագրությունների օգտագործումը, նմուշների հետ զգույշ աշխատանքը և առաջադեմ մեթոդների կիրառումն օգնում են բարելավել FFPE հյուսվածքներից ստացված տվյալների որակն ու հուսալիությունը։

Ի՞նչ տարբերություն կա FFPE և սառեցված հյուսվածքների միջև։

FFPE (ֆորմալինով ֆիքսված և պարաֆինում ներփակված) հյուսվածքը պահպանելու համար այն ֆիքսում են ֆորմալինով, ապա ներփակում պարաֆինում, ինչը թույլ է տալիս այն երկար ժամանակ պահել սենյակային ջերմաստիճանում՝ պահպանելով հյուսվածքի ձևաբանությունը։ Ի տարբերություն դրա՝ սառեցված հյուսվածքն արագ պահպանման է ենթարկվում սառեցմամբ, որն ավելի լավ է պահպանում նուկլեինաթթուների և սպիտակուցների ամբողջականությունը, սակայն պահանջում է պահպանում շատ ցածր ջերմաստիճաններում։

Ի՞նչ քիմիական նյութեր են օգտագործվում FFPE ներփակման համար։

FFPE ներփակման համար օգտագործվող քիմիական նյութերը սովորաբար ներառում են ֆորմալին՝ ֆիքսման համար, և պարաֆին՝ ներփակման համար։ FFPE ներփակման ժամանակ հյուսվածքները սովորաբար ֆիքսում են կամ 10% (v/v) չեզոք բուֆերացված ֆորմալինով (FA), կամ պարաֆորմալդեհիդի փոշուց թարմ պատրաստված ֆորմալդեհիդի 4% (w/v) լուծույթով (PFA)։ Ֆորմալինը, որը ֆորմալդեհիդի ջրային լուծույթ է, բուֆերացնում են մինչև չեզոք pH՝ հյուսվածքի ձևաբանությունը պահպանելու և չափազանց խաչաձև կապակցումը կանխելու համար։ Պարաֆորմալդեհիդի հիմքով լուծույթը նույնպես ապահովում է արդյունավետ ֆիքսում՝ սպիտակուցների խաչաձև կապակցման միջոցով, այդպիսով կայունացնելով հյուսվածքի կառուցվածքը՝ հետագայում պարաֆինի մեջ ներփակելու համար։ Այս քիմիական նյութերն անհրաժեշտ են ֆիքսման և ներփակման ընթացքում հյուսվածքի ամբողջականությունն ու ձևաբանությունը պահպանելու համար։

Ինչպե՞ս է պարաֆինը հեռացվում FFPE նմուշներից։

FFPE նմուշներից պարաֆինը հեռացնելու համար հյուսվածքային կտրվածքները սովորաբար ենթարկում են քսիլենով հաջորդական լվացումների, այնուհետև վերաջրազրկման հակառակ գործընթացին՝ վերաջրացմանը, սպիրտների աստիճանական խտություններով շարքի և վերջում ջրի միջոցով։ Քանի որ քսիլենը խիստ թունավոր է և առողջության համար վտանգներ է առաջացնում, ինչպիսիք են շնչառական խնդիրները, մաշկի գրգռումը և կրկնվող ազդեցության դեպքում հնարավոր երկարաժամկետ հետևանքները, պարաֆինի ուլտրաձայնային հեռացումը բազմաթիվ լաբորատորիաներում ի հայտ է գալիս որպես խոստումնալից այլընտրանք։ Այս մեթոդն օգտագործում է ինտենսիվ ուլտրաձայնային ալիքներ՝ պարաֆինն արդյունավետ և անվտանգ հեռացնելու համար՝ առանց քսիլենի նման թունավոր լուծիչների անհրաժեշտության, այդպիսով նվազեցնելով լաբորատոր անձնակազմի համար վտանգը և ստեղծելով ավելի անվտանգ աշխատանքային միջավայր։

Որքա՞ն ժամանակ պետք է ֆիքսեմ իմ հյուսվածքները՝ FFPE նմուշների լավ որակ ապահովելու համար։

Ֆիքսման տևողության վերաբերյալ ընդհանուր առաջարկությունները սովորաբար խորհուրդ են տալիս հյուսվածքային նմուշները ֆորմալինով ֆիքսել 24-ից 48 ժամ։ Այս տևողությունն ընդհանուր առմամբ բավարար է հյուսվածքի ձևաբանությունն ու բջջային կառուցվածքները պահպանելու համար՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով չափազանց ֆիքսումը, որը կարող է հանգեցնել չափազանց խաչաձև կապակցման և նուկլեինաթթուների ու սպիտակուցների քայքայման։ Սակայն ֆիքսման օպտիմալ ժամանակը կարող է տարբեր լինել՝ կախված հյուսվածքի չափից և տեսակից. ավելի փոքր կամ ավելի նուրբ նմուշների համար պահանջվում է ֆիքսման ավելի կարճ ժամանակ։ Խիստ կարևոր է ապահովել ֆիքսման այնպիսի հավասարակշռություն, որը բավարար է հյուսվածքի աուտոլիզն ու քայքայումը կանխելու համար՝ միաժամանակ խուսափելով երկարատև ֆիքսումից, որը կարող է բարդացնել հետագա մոլեկուլային վերլուծությունները։