Sonikacija za lizu stanica: razbijanje i ekstrakcija stanica
Ultrazvučna liza stanica je postupak pripreme uzorka u biotehnološkim laboratorijima. Cilj je poremetiti stanične stijenke ili cijele stanice kako bi se oslobodile biološke molekule. Sonikacija se obično koristi za lizu stanica, razbijanje stanica i ekstrakciju. Glavna prednost sonikatora za lizu stanica leži u preciznoj kontroli parametara procesa, kao što su intenzitet i temperatura, što omogućuje nježno, ali učinkovito uništavanje i ekstrakciju stanica.
Liza stanica pomoću ultrazvuka
Ultrazvučna liza stanica koristi visokofrekventne zvučne valove za razbijanje stanica i izvlačenje njihovog sadržaja. Sonikacija je uspostavljena i pouzdana za razbijanje stanica i ekstrakciju unutarstaničnog materijala, kao što su plazmidi, receptorski testovi, proteini, DNA i RNA. Podešavanjem parametara procesa, ultrazvučni intenzitet može se fino podesiti kako bi zadovoljio specifične zahtjeve primjene, u rasponu od nježne do intenzivne sonikacije. Koraci koji slijede nakon lize uključuju frakcioniranje, izolaciju organela te ekstrakciju i pročišćavanje proteina. Dobiveni lizat mora se odvojiti za daljnja istraživanja ili primjene, kao što je proteomsko istraživanje.
Ako želite saznati više o sonikaciji za lizu, razbijanje stanica i ekstrakciju, kontaktirajte nas. Našem tehničkom timu će biti drago raditi s vama na vašem projektu lize stanica.
Ultrazvučni homogenizatori UP100H (100 vata) i UP400St (400 vata): Sonikacija za lizu i ekstrakciju stanica.
Prednosti korištenja sonikacije za lizu stanica
U usporedbi s drugim metodama lize i ekstrakcije stanica, ultrazvučna liza stanica ima nekoliko prednosti:
- Ubrzati: Ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica je brza metoda koja može razbiti otvorene stanice u nekoliko sekundi. Ovo je mnogo brže od drugih metoda kao što su homogenizacija, zamrzavanje-odmrzavanje ili mljevenje kuglica.
- Učinkovitost: Ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica može se koristiti za obradu malih, velikih ili više uzoraka odjednom, što je čini učinkovitijom od drugih metoda koje zahtijevaju individualnu obradu malih uzoraka.
- Bez kemikalija: Ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica je neinvazivna metoda koja ne zahtijeva upotrebu jakih kemikalija ili enzima. To ga čini idealnim za primjene u kojima je potrebno održati cjelovitost sadržaja ćelije. Može se izbjeći neželjena kontaminacija uzoraka.
- Visok prinos: Ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica mogu izvući visoku količinu staničnih sadržaja, uključujući DNA, RNA i proteine. To je zato što visokofrekventni zvučni valovi razbijaju stanične stijenke i otpuštaju sadržaj u okolnu otopinu.
- Kontrola temperature: Sofisticirani ultrazvučni uređaji omogućuju preciznu kontrolu temperature uzorka. Digitalni sonikatori Hielscher opremljeni su senzorom temperature koji se može priključiti i softverom za praćenje temperature.
- Ponovljivo: Protokoli za ultrazvučnu lizu stanica mogu se jednostavno reproducirati i čak uskladiti s različitim većim ili manjim volumenima uzoraka jednostavnim linearnim povećanjem.
- Svestran: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija mogu se koristiti za ekstrakciju širokog spektra tipova stanica, uključujući bakterije, kvasce, gljivice, stanice biljaka i sisavaca. Također se može koristiti za ekstrakciju različitih vrsta molekula, uključujući proteine, DNK, RNK i lipide.
- Istovremena priprema više uzoraka: Hielscher Ultrasonics nudi nekoliko rješenja za udobnu obradu brojnih uzoraka pod potpuno istim uvjetima procesa. To čini korak pripreme uzorka lize i ekstrakcije vrlo učinkovitim i štedi vrijeme.
- Jednostavan za korištenje: Ultrazvučna oprema za lizu i ekstrakciju stanica jednostavna je za korištenje i zahtijeva minimalnu obuku. Oprema je također ekonomična jer se radi o jednom ulaganju bez potrebe za ponovnom kupnjom otpada. To ga čini privlačnim za širok raspon istraživača i laboratorija.
Sveukupno, ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica je brza, učinkovita, precizno kontrolirana i svestrana metoda za ekstrakciju staničnog sadržaja. Njegove prednosti u odnosu na alternativne metode čine ga privlačnim izborom za širok raspon istraživačkih i industrijskih primjena.
Princip rada ultrazvučne lize stanica
Ultrazvučna liza i ekstrakcija stanica koristi visokofrekventne zvučne valove za ometanje stanica i ekstrakciju njihovog sadržaja. Zvučni valovi stvaraju promjene tlaka u okolnoj tekućini, uzrokujući stvaranje i kolabiranje malih mjehurića u procesu poznatom kao kavitacija. Ovi mjehurići stvaraju lokalizirane vrlo intenzivne mehaničke sile koje mogu razbiti otvorene stanice i osloboditi njihov sadržaj u okolnu otopinu.
Liza stanica korištenjem ultrazvučnog aparata obično uključuje sljedeće korake:
- Uzorak se stavlja u epruvetu ili spremnik s tekućim puferom.
- Ultrazvučna sonda se umetne u uzorak, a visokofrekventni zvučni valovi s cca. Primjenjuju se 20-30 kHz.
- Ultrazvučni valovi uzrokuju oscilacije i kavitaciju u okolnoj tekućini, stvarajući lokalizirane sile koje razbijaju otvorene stanice i oslobađaju njihov sadržaj.
- Uzorak se centrifugira ili filtrira kako bi se uklonili svi stanični ostaci, a ekstrahirani sadržaj se prikuplja za daljnju analizu.
Snažni ultrazvučni valovi remete stanični matriks bioloških struktura i oslobađaju bioaktivne spojeve. Intenzivira se prijenos mase između biljnog materijala i otapala (npr. pufera). (grafikon: ©Vilkhu et al., 2006.)
Nedostaci uobičajenih metoda lize
Tijekom svog rada u laboratorijima možda ste već iskusili gnjavažu lize stanica korištenjem tradicionalnih protokola mehaničke ili kemijske lize.
- Mehanička liza: Metode mehaničke lize, kao što je mljevenje u žbuci i tučku ili homogenizacija pomoću french pressa, mlina s perlama ili sustava rotor-stator, često nemaju preciznu kontrolu i mogućnosti podešavanja. To znači da korištenje mljevenja i mljevenja može brzo generirati toplinu i sile smicanja koje mogu oštetiti uzorak i denaturirati proteine. Oni također mogu biti dugotrajni i zahtijevaju velike količine početnog materijala.
- Kemijska liza: Metode kemijske lize, kao što je liza na bazi deterdženta, mogu oštetiti uzorak ometanjem lipidnog dvosloja i denaturacijom proteina. Oni također mogu zahtijevati više koraka i mogu ostaviti zaostale kontaminante koji ometaju daljnje primjene. Pronalaženje optimalne doze deterdženta dodatni je izazov.
- Ciklusi smrzavanja i odmrzavanja: Ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja mogu uzrokovati pucanje staničnih membrana, ali ponovljeni ciklusi također mogu uzrokovati denaturaciju i razgradnju proteina. Ova metoda također može zahtijevati više ciklusa, što može biti dugotrajno i često rezultira nižim prinosima.
- Enzimska liza: Metode enzimske lize mogu biti specifične za određene vrste stanica i zahtijevaju više koraka, što ih čini dugotrajnim. Oni također stvaraju otpad i zahtijevaju pažljivu optimizaciju kako bi se izbjegla degradacija uzorka. Kompleti za enzimsku lizu često su skupi. Ako vaš trenutni postupak enzimske lize ne daje dovoljne rezultate, sonikacija kao sinergistička metoda može se primijeniti za pojačavanje poremećaja stanica.
Za razliku od konvencionalnih mehaničkih i kemijskih metoda lize stanica, sonikacija je vrlo učinkovit i pouzdan alat za dezintegraciju stanica koji omogućuje potpunu kontrolu nad parametrima sonikacije. To osigurava visoku selektivnost otpuštanja materijala i čistoću proizvoda. [usp. Balasundaram i sur., 2009.]
Pogodan je za sve tipove ćelija i lako se primjenjuje u malim i velikim razmjerima – uvijek pod kontroliranim uvjetima. Ultrasonicators se lako čiste. Ultrazvučni homogenizator uvijek ima funkciju čišćenja na mjestu (CIP) i sterilizacije na mjestu (SIP). Sonotroda se sastoji od masivnog titanskog roga koji se može brisati ili ispirati u vodi ili otapalu (ovisno o radnom mediju). Održavanje ultrazvučnih uređaja je zbog njihove robusnosti gotovo zanemarivo.
Ultrazvučna liza i razbijanje stanica
Općenito, liza uzoraka u laboratoriju će trajati između 15 sekundi i 2 minute. Budući da je intenzitet ultrazvuka vrlo lako podesiti postavljanjem amplitude i vremena sonikacije, kao i odabirom prave opreme, moguće je poremetiti stanične membrane vrlo nježno ili vrlo naglo, ovisno o staničnoj strukturi i svrsi lize ( npr. ekstrakcija DNA zahtijeva mekšu sonikaciju, potpuna ekstrakcija proteina bakterija zahtijeva intenzivniji tretman ultrazvukom). Temperatura tijekom procesa može se pratiti pomoću integriranog temperaturnog senzora i može se lako kontrolirati hlađenjem (ledena kupka ili protočne ćelije s rashladnim jaknama) ili ultrazvukom u pulsirajućem načinu rada. Tijekom sonikacije u pulsnom načinu, kratki ciklusi sonikacije u trajanju od 1-15 sekundi omogućuju rasipanje topline i hlađenje tijekom dužih isprekidanih razdoblja.
Svi procesi vođeni ultrazvukom potpuno su ponovljivi i linearno skalabilni.
VialTweeter je ultrazvučni homogenizator za istodobnu, ravnomjernu i brzu sterilnu pripremu brojnih uzoraka.
Ultrazvučni homogenizatori za lizu i ekstrakciju stanica
Različite vrste ultrazvučnih uređaja omogućuju usklađivanje s ciljem pripreme uzorka i osiguravaju lakoću korištenja i udobnost rada. Ultrazvučni uređaji tipa sonde najčešći su uređaji u laboratoriju. Najprikladniji su za pripremu malih i srednjih uzoraka volumena od 0,1 ml do 1000 ml. Različite veličine snage i sonotrode omogućuju prilagodbu ultrasonicator-a volumenu uzorka i posudi za najučinkovitije i učinkovite rezultate sonicatinga. Ultrazvučna sonda je najbolji izbor kada je potrebno pripremiti pojedinačne uzorke.
Ako je potrebno pripremiti više uzoraka, npr. 8-10 bočica stanične otopine, intenzivna neizravna sonikacija ultrazvučnim sustavima kao što je VialTweeter ili ultrazvučni cuphorn najprikladnija je metoda homogenizacije za učinkovitu lizu. Nekoliko bočica se sonicira istovremeno, istim intenzitetom. To ne samo da štedi vrijeme, već osigurava i isti tretman svih uzoraka, što rezultate među uzorcima čini pouzdanim i usporedivim. Nadalje, tijekom neizravne sonikacije izbjegava se unakrsna kontaminacija uranjanjem ultrazvučne sonotrode (također poznate kao ultrazvučna sonda, rog, vrh ili prst). Budući da se koriste bočice koje pojedinačno odgovaraju veličini uzorka, izostavljeno je dugotrajno čišćenje i gubitak uzorka zbog dekantiranja posuda. Za ujednačenu sonikaciju ploča s više jažica ili mikrotitarskih ploča, Hielscher nudi UIP400MTP.
Za veće količine, npr. za komercijalnu proizvodnju staničnih ekstrakata, najprikladniji su kontinuirani ultrazvučni sustavi s protočnim ćelijskim reaktorom. Kontinuirani i ravnomjerni protok obrađenog materijala osigurava ravnomjernu sonikaciju. Svi parametri procesa ultrazvučne dezintegracije mogu se optimizirati i prilagoditi zahtjevima primjene i specifičnog materijala ćelije.
Primjer postupka za ultrazvučnu lizu bakterijskih stanica:
- Priprema stanične suspenzije: Stanične pelete moraju biti potpuno suspendirane u puferskoj otopini homogeniziranjem (odaberite svoju pufersku otopinu kompatibilnu sa sljedećom analizom, npr. specifičnom metodom kromatografije). Dodajte lizozime i/ili druge aditive, ako je potrebno (također moraju biti kompatibilni sa sredstvima za odvajanje/pročišćavanje). Lagano izmiješajte/homogenizirajte otopinu uz blagu sonikaciju dok se ne postigne potpuna suspenzija.
- Ultrazvučna liza: Stavite uzorak u ledenu kupelj. Za ometanje stanica, sonikirajte suspenziju u nizovima od 60-90 sekundi (koristeći pulsni način sonikatora).
- Odvajanje: centrifugirajte lizat (npr. 10 min. na 10 000 xg; na 4°C). Pažljivo odvojite supernatant od taloga stanica. Supernatant je ukupni stanični lizat. Nakon filtracije supernatanta, dobivate pročišćenu tekućinu topljivog staničnog proteina.
Najčešće primjene ultrazvučnih uređaja u biologiji i biotehnologiji su:
- Priprema ekstrakta stanica
- Poremećaj kvasca, bakterija, biljnih stanica, mekog ili tvrdog staničnog tkiva, nukleinskog materijala
- ekstrakcija proteina
- Priprema i izolacija enzima
- Proizvodnja antigena
- Ekstrakcija DNK i/ili ciljana fragmentacija
- pripravak liposoma
Razbijanje stanica ultrazvučnim uređajem tipa sonde učinkovita je metoda pripreme uzorka.
Tablica u nastavku daje vam pregled naših ultrazvučnih uređaja za razbijanje i ekstrakciju stanica. Kliknite na vrstu uređaja kako biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno tehničko osoblje s dugogodišnjim iskustvom rado će vam pomoći u odabiru najprikladnijeg ultrazvučnog uređaja za vaše uzorke!
| Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili tuba | na | VialTweeter |
| više jažica / mikrotitarske ploče | na | UIP400MTP |
| više cijevi/posuda | na | kuphorn |
| 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP400St |
Mnogobrojne primjene ultrazvuka granaju se u sektorima biotehnologije, bioinženjeringa, mikrobiologije, molekularne biologije, biokemije, imunologije, bakteriologije, virologije, proteomike, genetike, fiziologije, stanične biologije, hematologije i botanike.
Liza: razbijanje staničnih struktura
Stanice su zaštićene polupropusnom plazmatskom membranom koja se sastoji od fosfo-lipidnog dvosloja (također protein-lipidnog dvosloja; tvore ga hidrofobni lipidi i hidrofilne molekule fosfora s ugrađenim proteinskim molekulama) i stvara barijeru između unutrašnjosti stanice (citoplazme) i izvanstaničnom okruženju. Biljne stanice i prokariotske stanice okružene su staničnom stijenkom. Zbog višeslojne debele stanične stijenke celuloze, biljne stanice teže se liziraju nego životinjske. Unutrašnjost stanice, poput organela, jezgre, mitohondrija, stabilizirana je citoskeletom.
Liziranjem stanica želi se izdvojiti i odvojiti organele, proteine, DNA, mRNA ili druge biomolekule.
Konvencionalne metode lize stanica i njihovi nedostaci
Postoji nekoliko metoda za liziranje stanica, koje se mogu podijeliti na mehaničke i kemijske metode, koje uključuju upotrebu deterdženata ili otapala, primjenu visokog tlaka ili upotrebu mlina s kuglicama ili french pressa. Najproblematičniji nedostatak ovih metoda je teška kontrola i podešavanje parametara procesa, a time i utjecaja.
Donja tablica prikazuje glavne nedostatke uobičajenih metoda lize:
Tablica: Konvencionalne metode stanične lize imaju velike nedostatke
Postupak lize
Liza je osjetljiv proces. Tijekom lize uništava se zaštita stanične membrane, ali se mora spriječiti inaktivacija, denaturacija i razgradnja ekstrahiranih proteina u nefiziološkoj okolini (odstupanje od pH-vrijednosti). Stoga se općenito liza provodi u puferskoj otopini. Većina poteškoća proizlazi iz nekontroliranog razaranja stanica koje rezultira neciljanim otpuštanjem cjelokupnog unutarstaničnog materijala ili/i denaturacijom ciljanog produkta.
Često postavljana pitanja o sonikaciji i lizi stanica
- Možete li lizirati stanice sonikacijom? Da, sonikacija učinkovito lizira stanice pomoću visokofrekventnih ultrazvučnih valova koji induciraju kavitaciju, pojavu u kojoj se stvaraju sićušni mjehurići pare i nasilno kolabiraju unutar stanične suspenzije. Rezultirajuće mehaničke sile ometaju stanične membrane i olakšavaju otpuštanje unutarstaničnih komponenti u tekućinu.
- Kako koristiti sonikator za lizu stanica? Korištenje sonikatora za lizu stanica uključuje uranjanje sonikatora u staničnu suspenziju i podešavanje parametara kao što su amplituda i trajanje pulsa. Proces treba pomno pratiti kako bi se optimiziralo ometanje stanica dok se denaturacija proteina i deaktivacija enzima svedu na minimum.
- Koji je princip sonikacije za lizu stanica? Sonikacija djeluje na principu akustične kavitacije. Ultrazvučna energija prenosi se u tekući medij, uzrokujući brze fluktuacije tlaka koje dovode do stvaranja i implozije mikromjehurića. Ove implozije stvaraju intenzivne sile smicanja i lokalne visoke temperature, ometajući stanične strukture i povećavajući homogenost lizata.
- Koliko dugo traje sonikacija lize stanica? Trajanje sonikacije za lizu stanica može značajno varirati ovisno o čimbenicima kao što su vrsta stanice, gustoća stanica, snaga sonikatora i korišteni specifični protokol. Tipični postupci mogu trajati od nekoliko sekundi do nekoliko minuta, često se izvode u ciklusima kako bi se upravljalo stvaranjem topline i osiguralo ravnomjerno ometanje stanica.
- Koja je svrha sonikacije u ekstrakciji proteina? U ekstrakciji proteina, sonikacija služi za učinkovito pucanje staničnih membrana i solubilizaciju proteina. Ova metoda je osobito korisna za otpuštanje proteina iz staničnih odjeljaka, što je čini bitnom za pripremu lizata iz kojih se proteini pročišćavaju ili analiziraju.
- Zašto se ultrazvuk koristi za ekstrakciju? Sonikacija je omiljena za ekstrakciju zbog svog brzog djelovanja i sposobnosti primjene ciljane energije, razbijanja staničnih struktura radi oslobađanja bioaktivnih molekula bez upotrebe oštrih kemijskih tretmana, čime se čuva funkcionalni integritet ekstrahiranih spojeva.
- Ometa li ultrazvuk interakcije protein-protein? Dok sonikacija može učinkovito poremetiti stanične membrane, ona također može poremetiti interakcije protein-protein. Razina poremećaja ovisi o intenzitetu sonikacije i trajanju izloženosti, što potencijalno dovodi do denaturacije ili disocijacije proteinskih kompleksa, što može utjecati na naknadne analitičke ili funkcionalne studije.
- Može li se sonikacija koristiti za lizu E. coli? Hielscher sonikatori su posebno učinkoviti za lizu bakterijskih stanica kao što je E. coli, koje imaju čvrste stanične stijenke. Tehnika pruža fizičku metodu za smicanje stanične stijenke i membrane, što je čini preferiranom metodom za pripremu bakterijskih lizata u laboratorijima molekularne biologije i biokemije.
Literatura/Reference
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.