Ultrazvukom za lizu: Poremećaj i ekstrakcija stanica

Dezintegracija stanica ili liza čest je dio svakodnevne pripreme uzoraka u biotehnološkim laboratorijima. Cilj lize je poremetiti dijelove stanične stijenke ili kompletne stanice kako bi se oslobodile biološke molekule. Ultrazvučni homogenizatori su naširoko koristi za uspješnu staničnu lizu. Glavna prednost sofisticiranih ultrasonicators je precizna kontrola nad procesnim parametrima kao što su intenzitet i temperatura, što omogućuje nježan, ali vrlo učinkovit poremećaj stanica i ekstrakciju.

Liza stanica pomoću ultrazvuka

Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija metoda je koja se koristi za razbijanje otvorenih stanica i vađenje sadržaja pomoću visokofrekventnih zvučnih valova, tj. Ultrazvukom je tehnika lize, koja se široko koristi kao utvrđena i pouzdana metoda poremećaja stanica i ekstrakcije unutarstaničnog materijala. Ultrazvučna liza je pouzdana tehnika za pripremu lizata koji se kosi, npr. plazmid, testovi receptora, proteini, DNA, RNA itd. Kako se ultrazvučni intenzitet može izravnati podešavanjem parametara procesa, optimalni intenzitet ultrazvukom od vrlo mekog do intenzivnog može se postaviti pojedinačno za svaku tvar i medij kako bi zadovoljio specifične zahtjeve primjene. Sljedeći koraci lize su frakcioniranje, izolacija organela ili/i ekstrakcija i pročišćavanje proteina. Izvađeni materijal (= lizat) mora se odvojiti i podložan je daljnjim istraživanjima ili primjenama, npr. za proteomska istraživanja.

U usporedbi s drugim staničnim lizama i metodama ekstrakcije, ultrazvučna stanična liza ima nekoliko prednosti:

1. Brzina: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija je brza metoda koja može razbiti otvorene stanice u nekoliko sekundi. To je mnogo brže od ostalih metoda kao što su homogenizacija, zamrzavanje ili mljevenje perli.
2. učinkovitost: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija mogu se koristiti za liječenje malih, velikih ili višestrukih uzoraka odjednom, što ga čini učinkovitijim od ostalih metoda koje zahtijevaju individualnu obradu malih uzoraka.
3. Bez kemikalija: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija je neinvazivna metoda koja ne zahtijeva uporabu oštrih kemikalija ili enzima. To ga čini idealnim za primjene u kojima je potrebno održavati integritet sadržaja stanice. Može se izbjeći neželjena kontaminacija uzoraka.
4. Visok prinos: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija mogu izvući visok prinos staničnog sadržaja, uključujući DNK, RNA i proteine. To je zato što visokofrekventni zvučni valovi razbijaju stanične stijenke i oslobađaju sadržaj u okolnu otopinu.
5. Kontrola temperature: Sofisticirani ultrasonciatori omogućuju preciznu kontrolu temperature uzorka. Hielscher digitalni ultrazvuk opremljeni su pluggable temperaturnim senzorom i softverom za praćenje temperature.
6. Izvodljiv: Protokoli za ultrazvučnu staničnu lizu mogu se lako reproducirati, pa čak i uskladiti s različitim većim ili manjim količinama uzoraka jednostavnim linearnim skaliranjem.
7. Svestran: Ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija mogu se koristiti za izdvajanje širokog raspona tipova stanica, uključujući bakterije, kvasac, gljivice, biljne i sisavske stanice. Također se može koristiti za ekstrakciju različitih vrsta molekula, uključujući proteine, DNK, RNA i lipide.
8. Istovremena priprema brojnih uzoraka: Hielscher Ultrasonics nudi nekoliko rješenja za udobnu obradu brojnih uzoraka u potpuno istim procesnim uvjetima. To čini korak pripreme uzorka lize i ekstrakcije vrlo učinkovitim i štedljivim vremenom.
9. Jednostavan za korištenje: Ultrazvučna stanična liza i oprema za ekstrakciju je jednostavna za korištenje i zahtijeva minimalnu obuku. Oprema je također ekonomična jer se radi o jedinstvenoj investiciji bez zahtjeva za ponovnu kupnju zbrinjavanja. To ga čini atraktivnim za širok raspon istraživača i laboratorija.

Sve u svemu, ultrazvučna stanična liza i ekstrakcija je brza, učinkovita, precizno upravljiva i svestrana metoda za vađenje staničnog sadržaja. Njegove prednosti u odnosu na alternativne metode čine ga atraktivnim izborom za širok raspon istraživačkih i industrijskih primjena.

Princip rada ultrazvučne stanične lize

Ultrasonic cell lysis and extraction uses high-frequency sound waves to disrupt cells and extract their contents. The sound waves create pressure changes in the surrounding liquid, causing small bubbles to form and collapse in a process known as cavitation. These bubbles generate localized highly intense mechanical forces that can break open cells and release their contents into the surrounding solution.

Liza stanica pomoću ultrasonicatora obično uključuje sljedeće korake:

• Uzorak se stavlja u cijev ili posudu s tekućim puferom.
• Ultrazvučna sonda je umetnuta u uzorak, a primjenjuju se visokofrekventni zvučni valovi s približno 20-30 kHz.
• Ultrazvučni valovi uzrokuju oscilaciju i kavitaciju u okolnoj tekućini, stvarajući lokalizirane sile koje razbijaju otvorene stanice i oslobađaju njihov sadržaj.
• Uzorak se centrifugira ili filtrira kako bi se uklonili svi stanični ostaci, a izvađeni sadržaj prikuplja se za analizu nizvodno.

Snažni ultrazvučni valovi ometaju staničnu matricu bioloških struktura i oslobađaju bioaktivne spojeve. Intenzivira se masovni prijenos između biljnog materijala i otapala (npr. Pufer). (grafika: ©Vilkhu i dr., 2006)

Nedostaci uobičajenih metoda lize

Tijekom rada u laboratorijima možda ste već iskusili gnjavažu stanične lize pomoću tradicionalnih mehaničkih ili kemijskih protokola lize.

• Mehanička liza: Metode mehaničke lize, kao što su brušenje žbukom i tučkom ili homogenizacija pomoću francuske preše, mlina za perle ili rotora-statorskog sustava često nemaju mogućnosti kontrole i podešavanja. To znači da uporaba mljevenja i mljevenja može brzo stvoriti sile topline i smicanja koje mogu oštetiti proteine uzorka i denature. Oni također mogu biti dugotrajni i zahtijevaju velike količine početnog materijala.
• Kemijska liza: Metode kemijske lize, kao što je liza na bazi deterdženta, mogu oštetiti uzorak ometanjem lipidnog dvosloja i denaturirajućih proteina. Također mogu zahtijevati više koraka i mogu ostaviti zaostale kontaminante koji ometaju primjene nizvodno. Pronalaženje optimalne doze deterdženta dodatni je izazov.
• Ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja: Ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja mogu uzrokovati pucanje staničnih membrana, ali ponovljeni ciklusi također mogu uzrokovati denaturaciju i razgradnju proteina. Ova metoda također može zahtijevati više ciklusa, što može biti dugotrajno i često rezultira nižim prinosima.
• Enzimska liza: Enzimske metode lize mogu biti specifične za određene tipove stanica i zahtijevaju više koraka, što ih čini dugotrajnim. Oni također stvaraju otpad i zahtijevaju pažljivu optimizaciju kako bi se izbjegla razgradnja uzorka. Enzimski kompleti liza često su skupi. Ako vaš trenutni enzimski postupak lize daje nedovoljne rezultate, ultrazvukom kao sinergistička metoda može se primijeniti za intenziviranje poremećaja stanica.

Za razliku od konvencionalnih mehaničkih i kemijskih metoda lize stanica, ultrazvukom je vrlo učinkovit i pouzdan alat za raspad stanica koji omogućuje potpunu kontrolu nad parametrima ultrazvukom. To osigurava visoku selektivnost oslobađanja materijala i čistoće proizvoda. Balasundaram i dr., 2009.]
Pogodan je za sve tipove stanica i lako se primjenjuje u malim i velikim razmjerima – uvijek u kontroliranim uvjetima. Ultrasonicators se lako čiste. Ultrazvučni homogenizator uvijek ima čistu funkciju na mjestu (CIP) i sterilizaciju na mjestu (SIP). Sonotrode se sastoji od masivnog titanskog roga koji se može obrisati ili isprati vodom ili otapalom (ovisno o radnom mediju). Održavanje ultrasonicators je zbog njihove robusnosti gotovo zanemariva.

Ultrazvučna liza i poremećaj stanica

Općenito, liza uzoraka u laboratoriju će trajati između 15 sekundi i 2 minute. Budući da je intenzitet ultrazvukom vrlo lako prilagoditi amplitudnim postavljanjem vremena soniciranja, kao i odabirom odgovarajuće opreme, vrlo je lako ili vrlo naglo poremetiti stanične membrane, ovisno o strukturi stanica i svrsi lize ( npr. ekstrakcija DNA traži nježniju ultrazvučnost, cjelovita proteinska ekstrakcija bakterija zahtijeva intenzivniji tretman ultrazvukom). Temperatura tijekom procesa može se pratiti integriranim temperaturnim senzorom i lako se može upravljati hlađenjem (ledena kupka ili stanice toka s hlađenjem) ili soniciranjem pulsiranim načinom rada. Tijekom ultrazvučne soniciranja, kratki ciklusi soniciranja od 1-15 sekundi omogućuju disipaciju topline i hlađenje tijekom duljih prekida.
Svi procesi ultrazvuk pogon potpuno izvodljiv i linearno prilagodljiv.

Ultrazvučni homogenizatori za staničnu lizu i ekstrakciju

Različite vrste ultrazvučnih uređaja omogućuju podudaranje cilja pripreme uzorka i osiguravanje jednostavnosti i udobnosti rada. Sonde tipa ultrasonicators su najčešći uređaji u laboratoriju. Oni su najprikladniji za pripremu malih i srednjih uzoraka s volumenom od 0,1mL do 1000mL. Različite veličine snage i sonotrode omogućuju prilagodbu ultrasonicator volumena uzorka i posude za najučinkovitije i najučinkovitije sondiranje rezultate. Ultrazvučni uređaj sonde je najbolji izbor kada se moraju pripremiti pojedinačni uzorci.

If more samples have to be prepared, e.g. 8-10 vials of cell solution, an intense indirect sonication with ultrasonic systems such as the VialTweeter or an ultrasonic cuphorn are the most suitable homogenization method for an efficient lysis. Several vials are sonicated at the same time, at the same intensity. This saves not only time, but ensures also the same treatment of all samples, which makes the results among the samples reliable and comparable. Furthermore, during indirect sonication cross-contamination by immersing the ultrasonic sonotrode (also known as ultrasonic probe, horn, tip, or finger) is avoided. Since individually to sample size matched vials are used, time-consuming clean-up and sample loss due to decanting of vessels are omitted. For the uniform sonication of multiwell or microtiter plates, Hielscher offers the UIP400MTP.
Za većih količina, na primjer za komercijalnu proizvodnju staničnih ekstrakata, kontinuirana ultrazvučni sustavi s staničnom toka reaktor su najprikladnije. Kontinuirani tok, pa čak i od obrađenog materijala osigurava ravnomjernu sonikaciju. Svi parametri ultrazvučnog procesa dezintegracije može biti optimiziran i prilagođen zahtjevima primjene i specifične stanične materijala.
 
 
Primjer Postupak ultrazvučnu ližu bakterijskoj:

• Priprema suspenzije stanica: Stanične pelete se mora u potpunosti suspendira u otopini pufera pomoću homogenizacije (odabir pufersku otopinu kompatibilan sa sljedećom analizom, na primjer specifične metode kromatografije). Dodaj lisozime i / ili druge aditive, ako je potrebno (oni moraju biti također kompatibilan sa sredstvima za odvajanje / pročišćavanje). Pomiješati / homogenizira otopine lagano uz blago sonikacijom dok se ne postigne potpuna suspenzija.
• Ultrazvučno liza: Staviti uzorak u ledenoj kupki. Za prekid stanica, sonificira suspenzije na 60-90 sekundi rafala (pomoću svojeg ultrasonicator u modu puls).
• (, Na primjer 10 minuta pri 10.000 x g; na 4degC) odvajanje Centrifuga lizat. Odvojiti supernatanta iz stanične pelete pažljivo. Supernatant je ukupni lizat stanica. Nakon filtracije supernatanta, te se dobije bistra tekućina proteina topljivog stanica.

 
 
Najčešće primjene za ultrasonicators biologije i biotehnologije su:

• Priprema ekstrakta stanica
• Poremećaj kvasca, bakterija, biljnih stanica, mekog ili tvrdog tkiva stanica, nukleinskog materijala
• ekstrakcija proteina
• Priprema i izolacija enzima
• Proizvodnja antigena
• ekstrakcija DNA i / ili ciljanih fragmentacija
• liposomski pripravak