Ultrazvučne primjene kod virusa majmunskih boginja

Ultrazvučna obrada važna je metoda obrade za izolaciju virusa majmunskih boginja (MPXV) iz analitičkih uzoraka, za fragmentaciju virusne DNA kao i u proizvodnji cjepiva protiv majmunskih boginja. Za pripremu uzoraka prije dijagnostike i analize (PCR, ELISA itd.) ultrazvučna se obrada upotrebljava za lizu stanica kako bi se virus majmunskih boginja oslobodio iz unutrašnjosti stanice i/ili za fragmentaciju DNA. U proizvodnji cjepiva primjene raspon obuhvaća od pripreme virusnih čestica/DNA, inkapsulacije u nosače lijekova i formuliranja inokula.
U nastavku možete pronaći detaljne informacije o ultrazvučnoj pripremi uzoraka virusa majmunskih boginja, kao i o proizvodnji cjepiva protiv MPXV-a potpomognutoj ultrazvukom.

Što ćete pronaći na ovoj stranici:

• Ultrazvučna liza za ekstrakciju virusa majmunskih boginja
• Ultrazvučna fragmentacija DNA virusa majmunskih boginja
• Ultrazvučne primjene u proizvodnji cjepiva protiv MPXV-a

Ultrazvučna liza i fragmentacija DNA prije lančane reakcije polimerazom (PCR)

Infekcija virusom majmunskih boginja otkriva se testom amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT) uz pomoć realno-vremenske ili konvencionalne lančane reakcije polimerazom (PCR), radi otkrivanja jedinstvenih sekvenci virusne DNA. Uzorak (npr. iz nazofaringealnog brisa ili biopsija kože) sadrži virus unutar stanica.
Za analizu virus se mora osloboditi iz stanica, a virusna DNA mora biti fragmentirana za PCR.

Ultrazvučna liza:

Ultrazvučno razaranje stanica / liza pouzdana je i učinkovita metoda za izoliranje virusa iz staničnih uzoraka te je stoga poželjnija tehnika od kemijskih sredstava kao što su lizozim, proteinaza K i razni deterdženti, koji se alternativno upotrebljavaju za postizanje lize stanica i oslobađanja DNA.
No upotreba takvih kemijskih reaktanata zahtijeva dugotrajnu pripremu uzorka u nekoliko koraka prije PCR analize kako bi se spriječila inhibicija PCR reakcije. Budući da PCR inhibitori utječu na učinkovitost amplifikacije, male varijacije količine inhibitora koji nisu uklonjeni mogu dovesti do velikih varijacija u amplifikaciji PCR produkta (Diaco, 1995).
Prednost ultrazvuka za lizu jest da se želi potpuno razaranje staničnih struktura i oslobađanje DNA bez potrebe za lizirajućim reaktantima i dugotrajnom pripremom uzorka. (usp. Fykse et al., 2003)

Ultrazvučna fragmentacija DNA:

Ultrazvučna fragmentacija DNA jednostavna je i pouzdana jer proizvodi DNA fragmente podesive duljine (bazni parovi, bp). Upotrebom ultrazvuka DNA se može učinkovito fragmentirati do uvođenja ciljane duljine DNA. Precizna kontrola ultrazvučnih parametara i sofisticirane opcije hlađenja sprječavaju degradaciju DNA.
Pročitajte više o ultrazvučnoj fragmentaciji DNA!

Ultrazvučne primjene kod cjepiva protiv majmunskih boginja

Cjepiva koja se upotrebljavaju protiv virusa majmunskih boginja trenutno su cjepiva živog virusa. Novo razvijena cjepiva mogla bi upotrebljavati druge platforme, primjerice one na bazi DNA. Trenutačno cjepivo sadrži modificirani virus Vaccinia Ankara, oslabljeni orthopoxvirus koji se ne replikira. Također sadrži Tris (tris-aminometan) i natrijev klorid. Cjepivo može sadržavati i male količine DNA i proteina iz stanica fibroblasta ptičjeg embriona, koje se upotrebljavaju za uzgoj cjepivnog virusa, benzonazu i antibiotske spojeve kao što su gentamicin i ciprofloksacin.

Ultrazvučna homogenizacija upotrebljava se u proizvodnji cjepiva živog oslabljenog virusa, DNA cjepiva, multivalentnih DNA koktela, mRNA cjepiva, cjepiva rekombinantnih proteina, cjepiva virusolikih čestica itd.

Ovdje možete pronaći temeljitije informacije o ultrazvučnim primjenama za unaprijeđenu proizvodnju cjepiva!

Protokol ultrazvučne izolacije virusa majmunskih boginja

Istraživački tim Stittelaar (2005) upotrijebio je ultrazvučnu lizu za oslobađanje virusa majmunskih boginja iz matične stanične kulture domaćina, kao i iz stanica dobivenih brisovima grla zaraženih primata.

Priprema cjepiva protiv majmunskih boginja:

Virusi majmunskih boginja uzgajani su na stanicama fibroblasta ptičjeg embriona oslobođenih specifičnih patogena. Nakon inkubacije od 1 do 2 dana suspenzija virus-stanica ubrana je jednim ciklusom smrzavanja i odmrzavanja, a zatim koncentrirana centrifugiranjem. Talog je resuspendiran i izložen nekoliko ciklusa ultrazvučne homogenizacije.

Izolacija virusa majmunskih boginja iz cijepljenih makaki:

Uzorci su smrzavani i odmrzavani tri puta te sonicirani u ultrazvučnom CupHorn uređaju. Koristile su se dvije dilucije (1:10 i 1:100) u transportnom mediju dopunjenom s 1% fetalnog goveđeg seruma za inokulaciju monoceljskih slojeva stanica Vero u pločicama s šest jažica. Nakon 1 h inkubacije na 37°C inokuli su uklonjeni i zamijenjeni kultivacijskim medijem dopunjenim s 1% fetalnog goveđeg seruma. Monoceljski se slojevi kultivirali 5 dana na 37°C i bojali su se otopinom kristal violeta.
(usp. Stittelaar et al., 2005)

Ultrazvučni uređaji za analizu virusa i proizvodnju cjepiva

Široki portfelj proizvoda Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni uređaj za istraživačke i analitičke laboratorije kao i za industrijsku proizvodnju cjepiva.
Hielscher Ultrasonics specijaliziran je za projektiranje, proizvodnju i distribuciju visokopropusnih ultrazvučnih uređaja i sono-bioreaktora za upotrebu u istraživačkim i analitičkim laboratorijima kao i za uvođenje u industrijsku proizvodnju cjepiva (npr. cjepiva, API-ji).
Sonikacija se može primijeniti na otvorene posude, zatvorene reaktore s kontinuiranim miješanjem i protočne reaktore. Svi dijelovi ultrazvučnih sustava, koji dolaze u dodir s tekućim medijem, izrađeni su od nehrđajućeg čelika, titana ili stakla. Autoklavirajući dijelovi i sanitarni priključci omogućuju proizvodnju pod farmaceutskim uvjetima kvalitete.
Automatsko snimanje podataka: Inteligentni softver automatski snima parametre postupka sonikacije na ugrađenu SD memorijsku karticu. Precizna kontrola svih parametara procesa osigurava reproducibilnost, standardizaciju proizvodnje, a olakšava ispunjavanje sigurnosnih standarda za farmaceutske proizvode.
Ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics vrlo su pouzdani i omogućuju precizno upravljanje. Svi industrijski ultrazvučni uređaji mogu se prilagoditi da podrže cijeli raspon od nižih do vrlo visokih amplituda. Robusnost ultrazvučnih sustava Hielscher omogućuje rad 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim uvjetima.

Tablica u nastavku daje naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja: