הפרדה אולטרסונית של צברי תאים בדגימות חיידקים

דגימות חיידקים מגיעות לעיתים רחוקות כתרחיפים אמיתיים של תאים בודדים. תרביות גדלות בשרשראות ובפתיתים, תבדידים סביבתיים יוצרים צברים הקשורים זה לזה באמצעות חומרים פולימריים חוץ־תאיים, ומשקעים שנוצרו בצנטריפוגה לעיתים קרובות אינם מתרחפים מחדש בקלות, למרות ערבול יסודי בוורטקס. ספירת תאים חיים, צפיפות אופטית, ציטומטריית זרימה ואפיון המיקרוביום מניחים כולם שחלקיק אחד שקול לתא אחד. הפרדה אולטרסונית של צברי תאים פותרת את הסתירה הזאת: פרצי סוניקציה קצרים ומבוקרים מפרידים צברים לתאים בודדים מבלי לגרום לתמס שלהם.

מדוע הצטברות תאים בצברים פוגעת בתוצאות שלכם

הצטברות בצברים היא מאפיין ביולוגי, ולא שגיאה בהכנת הדגימה. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces ומינים סביבתיים רבים גדלים בשרשראות, באשכולות או במקטעי ביופילם, ו־DNA חוץ־תאי ופוליסכרידים מדביקים תאים זה לזה במשקעים ובתמיסות מיצוי ממטושים. ההשלכות האנליטיות הן שיטתיות:

• ספירת המושבות נותנת הערכת חסר, משום שצבר אחד יוצר מושבה אחת ללא קשר למספר התאים שהוא מכיל.
• מדידות צפיפות אופטית ומוני חלקיקים מדווחים על צברים במקום על תאים, וכך מטים את עקומות הגידול.
• בציטומטריית זרימה ובמיון תאים, אירועים שמקורם בצברי תאים נספרים באופן שגוי ומוצאים מהניתוח.
• מיצויי DNA וחלבונים מייצגים רק את התאים שעל פני הצבר, וכך מטים את נתוני המיקרוביום והאומיקה.

הפתרונות המקובלים איטיים, חלקיים או גורמים לשינויים כימיים. פיפטציה נמרצת וערבול בוורטקס מותירים מיקרו־צברים. פיזור אנזימטי או פיזור באמצעות חומרים קושרים משנה את פני התא שייתכן שבכוונתכם לנתח. הפרדה מכנית של צברים באמצעות קוויטציה מבוקרת פועלת בתוך שניות ואינה דורשת תוספים.

כיצד סוניקציה מפרידה צברי תאים מבלי לגרום לתמס שלהם

הפרדה אולטרסונית של צברי תאים מנצלת הבדל בחוזק המכני. צברי חיידקים מוחזקים יחד באמצעות קשרים בין־תאיים חלשים יחסית ומטריצה חוץ־תאית, בעוד שמעטפת תא שלמה עומדת בכוחות גזירה גבוהים במידה ניכרת. כאשר אולטרסאונד מכויל חודר לתרחיף, קוויטציה אקוסטית יוצרת מיקרו־זרימה, פעימות לחץ וכוחות גזירה שפועלים תחילה בממשקי הצברים. צברים, שרשראות ומקטעי ביופילם מופרדים בכוחות גזירה (דה־אגלומרציה) לפני שמגיעים לרמת האנרגיה שבה ממברנות נקרעות (תמס).

הפרדה אולטרסונית של צברי תאי חיידקים

הפרדת צברים או תמס – כיצד משפיעים פרמטרי הסוניקציה

המשמעות המעשית היא שהפרדת צברים ותמס מבוצעים באותו מכשיר, המופעל בפרמטרים שונים. במשרעת מתונה, במחזורי פולסים קצרים ובטמפרטורה מבוקרת מתקבל תרחיף של תאים בודדים חיים. העלאת המשרעת, משך החשיפה או טמפרטורת הדגימה מסיטה את התהליך לעבר פירוק תאים מלא לצורך הפקת רכיבי מטרה תוך־תאיים. הגנרטורים של Hielscher מאפשרים להגדיר במדויק את המשרעת, ההספק, הפולסים והאנרגיה המושקעת ולשמור את השיטה, כך ששלב הפרדת הצברים ניתן לשחזור בין דגימות, מפעילים והרצות.

סוניקציה יעילה ללא מגע

סוניקציה באמבט אינה יכולה להשתוות לרמת בקרה זו. אמבטיות ומכלים לניקוי אולטרסוני מספקים אנרגיה אולטרסונית נמוכה בלבד, וכתוצאה מכך ההכנה אינה מלאה. כמו כן, הקוויטציה מתרחשת באופן לא אחיד, ולכן כל מבחנה מטופלת בהתאם למיקומה באמבט. מכשיר VialTweeter מעביר כוחות אולטרסוניים עזים וממוקדים ישירות דרך דופן הכלי אל עד 10 דגימות אטומות בו־זמנית. טיפולים הדורשים חשיפה ממושכת ומשתנה באמבט מושלמים באמצעות תבנית פולסים תקנית.
סוניקטורים ללא מגע של Hielscher מפעילים אולטרסאונד עז וממוקד דרך דופנותיהם של בקבוקונים סגורים. מכשיר VialTweeter מעבד עד 10 בקבוקונים בו־זמנית בעוצמה זהה, ללא גשוש בדגימה, ללא זיהום צולב וללא שחרור אירוסולים. כאשר דרישות התפוקה מחייבות זאת, הסוניקטורים למיקרופלטות UIP400MTP ו־UIP550MTP מרחיבים את אותה העברת אנרגיה מבוקרת לצלחות מרובות באריות.

יתרונות ההפרדה האולטרסונית של צברי תאים ללא מגע

• אפס זיהום צולב: מכיוון שהבקבוקונים נשארים סגורים כל העת ושום גשוש אינו טבול בדגימה, זיהום צולב ואובדן דגימה נמנעים לחלוטין. אין צורך לעקר דבר בין דגימות, והרצה אחת אינה יכולה להשפיע על הבאה אחריה.
• הגנה מפני אירוסולים: סוניקציה באמצעות גשוש בכלי פתוח יוצרת אירוסולים מידבקים ומזהמת את משטחי המכשיר. סוניקציה בבקבוקון אטום שומרת את הדגימה בתוך המבחנה שלה, דבר בעל חשיבות בעת טיפול בחיידקים פתוגניים כגון Mycobacterium tuberculosis ובגורמים ביולוגיים אחרים ברמות BSL-2 או BSL-3.
• ללא שחיקת קצה: גשושי טיטניום עלולים לשחרר כמות קטנה של מיקרו־חלקיקים אל הדגימה במהלך הפעולה. חלקיקים אלה משנים את הצפיפות האופטית ואת ספירות החלקיקים בשלבי ההמשך. סוניקציה עקיפה דרך דופן הכלי מבטלת לחלוטין מקור זה של חומר מוצק.
• תפוקה אחידה: מכשיר VialTweeter מספק עוצמת אולטרסאונד זהה לכל אחד מעד 10 בקבוקונים, כך שתוצאות הסוניקציה אחידות וניתנות לשחזור. השפעות המיקום, הפוגעות בטיפול באמבט ובטיפול בדגימה יחידה באמצעות גשוש, נעלמות, וערכי הבסיס שלכם נשארים בני השוואה בין חזרות.
• שלמות הדגימה: המבחנות נשארות סגורות לאורך כל העיבוד, כך שהדגימה אינה יכולה להזדהם, להתקלקל או להתנדף. ניתן לעבד נפחים קטנים ללא דילול, לרבות משקעים קליניים יקרי ערך שאינם מאפשרים שלב העברה נוסף.
• בקרת תהליך: ניתן לכוונן את המשרעת מ־20 עד 100%, ואת מצב הפולסים מ־0 עד 100%. המערכות תומכות בניטור טמפרטורה, כך שזנים וחלבונים רגישים לחום נשארים מתחת לספי הטמפרטורה הגורמים לנזק.

יישומים טיפוסיים

• ניתוח המיקרוביום ותכולת המעי: פיזור Lactobacillus, Bifidobacterium ודגימות צואה לפני זריעה על מצע מוצק או ריצוף, כך שצברי תאים אינם גורמים לספירות נמוכות מדי.
• מיקרוביולוגיה של מזון ומים: הפרדת פתיתים בדגימות מטוש, בנוזלי שטיפה ובמרקי העשרה לצורך קביעה מדויקת של מספר המושבות וחיוניות התאים.
• חקר ביופילם: איסוף תאים מנשאים וממשטחים כתרחיפים של תאים בודדים, ללא טיפול אנזימטי שהיה מסיר חלבוני פני שטח.
• אבחון קליני: הרחפה מחדש של כיח, מוגלה ונוזלי מיצוי ממטושים בתנאי הכלה.
• תרביות תאים: הפרדת צברים של תאי יונקים, תאי חרקים ותאי CHO לפני ספירה והעברה לתרבית המשך.
• הכנה לאורך כל תהליך העבודה: אותו מכשיר המפריד צברי תאים במשרעת נמוכה מבצע פירוק תאים מלא בהגדרות גבוהות יותר, כך שליזיס, מיצוי חלבונים וקיטוע DNA מתבצעים בהמשך ללא העברה בין מבחנות.

ספרות / מקורות

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.