פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד בדגימות חיידקים
דגימות חיידקים מגיעות לעיתים נדירות כתמיסות של תאים בודדים אמיתיות. תרבויות גדלות בשרשראות ובגושים, מבודדים סביבתיים יוצרים אגרגטים הקשורים באמצעות חומרים פולימריים חוץ-תאיים, וגרגירי הצנטריפוגה לעיתים קרובות מתנגדים להשהיה מחדש למרות ערבוב יסודי בוורטקס. ספירת תאים חיים, צפיפות אופטית, ציטומטריית זרימה ופרופיל המיקרוביומה – כולם מבוססים על ההנחה שחלקיק אחד שווה לתא אחד. פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד פותר סתירה זו: פרצי סוניקציה קצרים ומבוקרים מפרידים את האגרגטים לתאים בודדים מבלי לפרק אותם.
מדוע צבירת תאים פוגעת בתוצאות שלכם
הצטברות היא תופעה ביולוגית, ולא טעות בהכנה. סטפילוקוקוס, סטרפטוקוקוס, לקטובצילוס, אקטינומיצס ומינים סביבתיים רבים מתרבים בשרשראות, באשכולות או בשברי ביופילם, וה-DNA והפוליסכרידים החוץ-תאיים מדביקים את התאים זה לזה בגרגרים ובתוצרי השטיפה של המקלון. ההשלכות האנליטיות הן שיטתיות:
- מספר המושבות מוערך בחסר, משום שגוש אחד מייצר מושבה אחת, ללא תלות במספר התאים שהוא מכיל.
- מדי צפיפות אופטית ומוני חלקיקים מדווחים על אגרגטים במקום על תאים, דבר המטה את עקומות הצמיחה.
- בציטומטריית זרימה ובמיון תאים, אירועים שבהם התאים מתקבצים נספרים באופן שגוי ומוחרגים מהניתוח.
- הפקת ה-DNA והחלבון מייצגת רק את התאים הנמצאים על פני השטח של האגרגט, דבר המטה את נתוני המיקרוביומה והאומיקה.
השיטות המקובלות הן איטיות, לא מקיפות או כרוכות בשינויים כימיים. פיפוט נמרץ וערבוב בוורטקס מותירים אחריהם מיקרו-אגרגטים. פיזור אנזימטי או מבוסס-קלטור משנה את פני השטח של התא שאתם מתכוונים לנתח. פירוק מכני באמצעות קוויטציה מבוקרת פועל תוך שניות ואינו מצריך תוספים.
אגד אחד שווה למושבה אחת – ותוצאה שגויה אחת. ראו כיצד פירוק באמצעות אולטרה-סאונד מייצר תמיסות תאים בודדים אמיתיות ללא ליזיס, אירוסולים או צורך בטיפול בחיישנים. בקשו מידע נוסף!
מכשיר סוניקציה רב-צינורי VialTweeter להכנת הדגימה ללא מגע: יש לפרק את גושי התאים במבחנות אטומות
כיצד תהליך הסוניקציה מפרק תאים מבלי להרוס אותם
פירוק תאים באמצעות אולטראסאונד מנצל את ההבדל בחוזק המכני. צברים חיידקיים מוחזקים יחד באמצעות קשרי תא-תא חלשים יחסית ומטריצה חוץ-תאית, בעוד שקליפת התא השלמה עומדת בפני כוחות גזירה גבוהים בהרבה. כאשר גלי קול מכוילים חודרים לתמיסה, קוויטציה אקוסטית מייצרת זרמים מיקרוסקופיים, פולסי לחץ וכוחות גזירה הפועלים תחילה על פני הממשק של האגרגטים. גושים, שרשראות ושברי ביופילם נפרדים זה מזה (פירוק אגרגטים) לפני שמגיעים לרמת האנרגיה שבה הקרומים נקרעים (ליזיס).
פירוק באמצעות אולטרסאונד של צברים של תאים חיידקיים
פירוק או ליזיס – מדוע פרמטרי הסוניקציה חשובים
ההשלכה המעשית היא שפירוק ותמוגה הם אותו מכשיר הפועל בפרמטרים שונים. בעוצמה בינונית, מחזורי פולסים קצרים וטמפרטורה מבוקרת, מתקבלת תמיסה של תאים בודדים בעלי כושר חיים. העלאת המשרעת, זמן החשיפה או טמפרטורת הדגימה מובילה את התהליך לכיוון פירוק תאי מוחלט, המיועד למטרות תוך-תאיות. גנרטורים של Hielscher מאפשרים להגדיר במדויק את המשרעת, ההספק, הדופק ותשומת האנרגיה, ולשמור את השיטה, כך ששלב הפירוק ניתן לשחזור בין דגימות, מפעילים וריצות.
עיבוד קולי יעיל ללא מגע
ניקוי באמצעות אולטרסאונד באמבטיה אינו יכול להשתוות לרמת השליטה הזו. אמבטיות ומיכלים לניקוי אולטרסאונד מספקים אנרגיית אולטרסאונד נמוכה בלבד, מה שמביא להכנה לא מלאה, והקביטציה מתרחשת באופן לא אחיד, כך שכל צינור מטופל בהתאם למיקומו באמבטיה. ה-VialTweeter מעביר כוחות אולטראסוניים עוצמתיים וממוקדים ישירות דרך דופן הכלי אל עד 10 דגימות אטומות בו-זמנית. טיפולים הדורשים חשיפה ממושכת ומשתנה באמבטיה מסתיימים בתבנית פולסים סטנדרטית.
מכשירים סוניקטוריים ללא מגע של Hielscher מפעילים גלי קול עוצמתיים וממוקדים דרך דפנות הבקבוקונים הסגורים. מכשיר ה-VialTweeter מעבד עד 10 בקבוקונים בו-זמנית בעוצמה זהה, ללא צורך בהכנסת בדיקה לדגימה, ללא זיהום צולב וללא שחרור אירוסול. כאשר התפוקה מחייבת זאת, מכשירי האולטרסאונד למיקרו-פלטה מדגמי UIP400MTP ו-UIP550MTP מרחיבים את אותה העברת אנרגיה מבוקרת גם לצלחות רב-תאים.
ה-VialTweeter מפעיל אולטרסאונד על עד 10 בקבוקונים קטנים ועד 5 מבחנות גדולות בו-זמנית.
יתרונות הפירוק האולטראסוני ללא מגע
- ללא זיהום צולב כלל: מכיוון שהבקבוקונים נשארים סגורים באופן קבוע ואין טבילת בדיקה בדגימה, נמנעים לחלוטין זיהום צולב ואובדן דגימה. אין צורך לעקר דבר בין דגימה לדגימה, וריצה אחת אינה יכולה להשפיע על הריצה הבאה.
- הגנה מפני אירוסולים: שימוש באולטרסאונד עם בדיקה פתוחה יוצר אירוסולים מדבקים ומזהם את משטחי המכשירים. בשיטת האולטרסאונד בבקבוק אטום, הדגימה נשארת בתוך הצינור עצמו, דבר בעל חשיבות בעת טיפול בחיידקים פתוגניים כגון Mycobacterium tuberculosis וגורמים אחרים ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) או 3 (BSL-3).
- אין שחיקה של הטיפ: במהלך הפעולה, בדיקות טיטניום עלולות לשחרר כמות קטנה של מיקרו-חלקיקים לתוך הדגימה. חלקיקים אלה משנים את הצפיפות האופטית ואת ספירת החלקיקים בהמשך התהליך. שימוש בעיסוי קולי עקיף דרך דופן הכלי מבטל לחלוטין מקור זה של חומרים מוצקים.
- תפוקה אחידה: מכשיר ה-VialTweeter מספק עוצמת אולטרה-סאונד זהה לכל אחד מ-10 הבקבוקונים לכל היותר, כך שתוצאות הטיפול באולטרה-סאונד אחידות וניתנות לשחזור. השפעות המיקום, המטרידות בשימוש באמבטיות ובבדיקת דגימה בודדת, נעלמות, וקווי הבסיס שלכם נשארים דומים בין כל החזרות.
- שלמות הדגימה: המבחנות נשארות סגורות לאורך כל תהליך העיבוד, ולכן הדגימה אינה יכולה להיחשף לזיהום, להתקלקל או להתנדף. ניתן לעבוד עם נפחים קטנים ללא צורך בדילול, כולל משקעים קליניים יקרי ערך שלא ניתן להרשות לעצמם שלב העברה נוסף.
- בקרת תהליכים: ניתן לכוונן את המשרעת בין 20% ל-100%, את מצב הפולסים בין 0% ל-100%, והמערכות תומכות בניטור טמפרטורה, כך שזנים וחלבונים הרגישים לטמפרטורה יישארו מתחת לספים העלולים לגרום נזק.
יישומים נפוצים
- ניתוח המיקרוביומה ותכולת המעי: פיזור חיידקי Lactobacillus, Bifidobacterium ודגימות צואה לפני ההנחה על צלחת או הריצוף, כדי שהספירה לא תושפע לרעה מהיווצרות גושים.
- מיקרוביולוגיה של מזון ומים: פירוק גושים בדגימות מטוש, בשטיפות ובמרקאות העשרה לצורך קביעת מדויקת של מספר המושבות ושל רמת החיוניות.
- מחקר בנושא ביופילם: הפרדת תאים ממנשאים ומשטחים כמתלים של תאים בודדים, ללא טיפול אנזימטי שעלול להסיר את חלבוני השטח.
- אבחון קליני: ערבוב מחדש של ליחה, מוגלה ותוצרי שטיפה של מטליות בתנאי בידוד.
- תרביות תאים: הפרדת צברים של תאים מיונקים, חרקים ותאי CHO לפני הספירה וההעברה.
- הכנה לכל שלבי התהליך: אותו מכשיר שמבצע פירוק ברמת אמפליטודה נמוכה מבצע פירוק תאים מלא בהגדרות גבוהות יותר, כך שתהליכי הליזה, מיצוי החלבונים ופירוק ה-DNA מתבצעים ברצף, ללא צורך בהעברת תאים בין מבחנות.
מכשיר אולטרסאונד לצלחות רב-תאיות UIP400MTP לפיזור גושים של תאים בקצב גבוה
דגמי מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP ו-UIP550MTP מתאימים לא רק לצלחות רב-תאים, אלא גם לעיבוד מתקני מבחנות.
מצאו את מכשיר הסוניקציה המתאים לתהליך הפירוק שלכם
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
השיטה המועדפת לפירוק תוכן מבחנות סגורות וסטריליות. המכשיר מופעל על ידי מעבד UP200St בהספק של 200 וואט בתדר של 26 קילוהרץ עם כוונון אוטומטי, ה-VialTweeter משדר גלי קול באופן עקיף דרך דפנותיהם של עד 10 מבחנות סגורות בו-זמנית, בעוצמה של עד 10 וואט לכל מבחנה, לקבלת תוצאות אחידות וניתנות לשחזור ללא זיהום צולב וללא אובדן דגימה. הסונוטרוד מטיטניום של ה-VialTweeter ניתן לעיקור באוטוקלאב, והמשרעת והדופק ניתנים לכוונון ולשמירה, וזהו טווח הבקרה הדרוש לפרוטוקול פירוק אגרגטים. הסונוטרוד הסטנדרטי בעל 10 עמדות מתאים למבחנות של דוגם אוטומטי, צינורות מיקרו-צנטריפוגה ומבחנות Eppendorf או Nunc בנפח של 1 עד 5 מ"ל. מתקן ההידוק VialPress מתאים לעד 5 כלי קיבול גדולים יותר בקוטר של עד 20 מ"מ.
קיימים דגמי VialTweeter ייעודיים בעלי צינור יחיד, המתאימים לצינורות Falcon ולמבחנות בודדות המותאמות לגודל הכלי. יש לפרק את הסונוטרוד הבלוקי, ואז יחידת הליבה UP200St פועלת כמתמר קולי רגיל לטיפול ישיר בדגימות קטנות עד בינוניות.
מכשירים לסוניקציה של מיקרו-פלטה
הרחבת היקף הכנת הדגימות לתפוקה גבוהה באמצעות סוניקציה של צלחות רב-תאים: עבור תהליכי עבודה המבוססים על צלחות, מכשירי הסוניקציה למיקרו-צלחות UIP400MTP ו-UIP550MTP מרחיבים את יכולת הסוניקציה האחידה ללא מגע מעשרה מבחנות לצלחת שלמה.
מכשיר ה-UIP400MTP בהספק של 400 וואט מיועד לטיפול בצלחות מיקרוטיטר וצלחות רב-תאים סטנדרטיות, לרבות פורמטים של 96 תאים, עם בקרה מדויקת על משרעת, הספק ופעימות, וכן טיימר, חיישן טמפרטורה וקירור באמבט מים. הסרת ביופילם ועיבוד תרבויות חיידקים הם יישומים מקובלים של מכשיר הסוניקציה למיקרו-צלחות UIP400MTP.
ה-UIP550MTP, בהספק של 550 וואט, הוא האופציה החזקה יותר – אידיאלי ליישומים תובעניים יותר.
שתי מערכות הסוניקציה ללא מגע מעבדות באופן אמין צלחות בעלות 6, 12, 24, 48, 96 ו-384 שקעים, כמו גם מתקני צינורות וצלחות פטרי. מכשירים לסוניקציה של מיקרו-צלחות מבית Hielscher מתאימים לכל צלחת סטנדרטית, ובכך נמנעת הצורך בחומרים מתכלים יקרים וקנייניים. הודות לגבולות טמפרטורה ניתנים לתכנות, תהליך הסוניקציה נעצר אוטומטית כאשר הדגימה מגיעה לטמפרטורה המקסימלית, ומתחדש לאחר הקירור, מה שמגן על תקינות הדגימה גם במחזורים חוזרים. הכנת דגימות חכמה ואמינה בתפוקה גבוהה, לתוצאות חוזרות ונשנות.
הטבלה שלהלן מספקת סקירה כללית של קיבולת העיבוד המשוערת של מכשירי הסוניקציה לדגימות מעבדה שלנו, המשמשים בתחומי מדעי החיים, גנומיקה, פרוטאומיקה ואבחון:
| מכשירים מומלצים | נפח אצווה | קצב זרימה |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 0בקבוקונים בנפח 0.5 עד 1.5 מ"ל | נ.א. |
| מכשיר סוניקטור לצלחות רב-תאים מדגם UIP400MTP (440 וואט) | צלחות מרובות באר / מיקרוטיטר | נ.א. |
| מכשיר סוניקציה לצלחות רב-תאיות מדגם UIP550MTP (550 וואט) | צלחות מרובות באר / מיקרוטיטר | נ.א. |
| כוסית אולטראסונית | CupHorn עבור בקבוקונים או | נ.א. |
| UP100H – מכשיר סוניקציה מסוג בדיקה בהספק של 100 וואט | 1 עד 500 מ"ל | 10 עד 200 מ"ל/דקה |
| UP200Ht, UP200ST דגמי סוניקטור מסוג בדיקה בהספק של 200 וואט | 10 עד 1000 מ"ל | 20 עד 200 מ"ל/דקה |
| UP400St – מכשיר סוניקציה מסוג בדיקה בהספק של 400 וואט | 10 עד 2000 מ"ל | 20 עד 400 מ"ל/דקה |
| GDmini2 | כור מיקרו-זרימה סטרילי הפועל באמצעות אולטרסאונד | נ.א. |
| שייקר מסננת אולטראסוני | נ.א. | נ.א. |
שאלות נפוצות בנושא פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד
מה ההבדל בין פירוק תאים לבין ליזיס של תאים?
פירוק, המכונה גם פיזור, מפריד תאים שהתלכדו לתמיסה של תאים בודדים, תוך שהתאים נותרים שלמים וחיים. ליזיס קורע את קרום התא ומשחרר את התוכן התאי. שני התהליכים מונעים על ידי גזירה קוויטציונית, וההבדל ביניהם הוא בכמות האנרגיה המושקעת. באמצעות הגדרות אופטימליות של משרעת, פולס וטמפרטורה, טיפול קולי משיג פיזור מתחת לסף הליזיס.
מדוע אמבטיות אולטראסוניות אינן מתאימות לפירוק סטנדרטי?
אמבטיות מספקות אנרגיית אולטרה-סאונד נמוכה בלבד, מה שמוביל להכנה לא מלאה, והקביטציה מתפתחת באופן לא אחיד מאוד ברחבי המיכל, כך שכל דגימה מקבלת טיפול שונה בהתאם למיקומה. ספירות מיקרוביולוגיות ומחקרים השוואתיים תלויים ביכולת ההשוואה. מכשירים קוליים ללא מגע, כגון ה-VialTweeter – מכשיר קול רב-צינורות, וכן דגמי המכשירים הקוליים למיקרו-פלטה UIP400MTP ו-UIP550MTP, מעבדים את כל הכלי בתנאים קוליים מותאמים, מה שמשפר את השחזור בין הרפליקטים.
האם טיפול באולטרסאונד עלול לפגוע בתאים?
כן, אם לא שולטים בפרמטרים. שימוש מופרז באולטרסאונד או חימום בלתי מבוקר עלולים לפגוע בתאים, וה-DNA המשתחרר הופך את הדגימות לצמיגות ומסייע להתאגדות מחודשת. לכן יש לפתח את התהליך בזהירות: משרעת מתונה, מחזורים פועמים, קירור ומכשירים עם הגבלת טמפרטורה שומרים על הטיפול בצד הפירוק של העקומה.
כל מכשירי הסוניקציה הדיגיטליים של Hielscher מציעים פרמטרים הניתנים לשליטה מדויקת, חיישני טמפרטורה הניתנים לחיבור, הגדרות הניתנות לתכנות ורישום נתונים אוטומטי, לצורך הכנת דגימות אמינה.
האם יש להעביר את הדגימה לכלי אחר?
לא. הבקבוקונים והצלחות מעובדים בתוך המכלים המקוריים והסגורים שלהם. השימוש באולטרסאונד עקיף מונע הן אובדן בעת העברה והן העברה צולבת הקשורה לטיפול בחיישן.
אילו סוגי בקבוקונים יכול ה-VialTweeter לעבד?
הסונוטרוד הסטנדרטי בעל 10 עמדות מתאים לבקבוקוני דוגם אוטומטי, צינורות מיקרו-צנטריפוגה וצינורות Eppendorf או Nunc בנפח של 1 עד 5 מ"ל. אביזר ה-VialPress מתאים לעד 5 כלי קיבול גדולים יותר בקוטר של עד 20 מ"מ. קיימים דגמים ייעודיים של VialTweeter למבחנות Falcon ולפורמטים מותאמים אישית של מבחנה בודדת או מבחנות גדולות יותר.
האם ניתן לבצע פירוק ותסיסה באמצעות מכשיר אחד?
כן. אותה מערכת שמבצעת פירוק חלקיקים בעוצמה בינונית, מבצעת פירוק תאים מוחלט בעוצמה גבוהה יותר ובזמן חשיפה ממושך יותר, ולכן ניתן לבצע את תהליך יצירת תאי התלוי ואת תהליך החילוץ שלאחריו ברצף, ללא צורך בהחלפת פלטפורמות.
האם נעשה שימוש באולטרסאונד בבדיקות MBEC?
השימוש באולטרסאונד הוא מרכיב מקובל וסטנדרטי במידה רבה. בבדיקת MBEC עם מכסי יתדות, לאחר שגידול הביופילם על יתדות הפוליסטירן וחשיפתן לאנטיביוטיקה, היתדות מועברות למדיום טרי ועוברות ערבוב בוורטקס בשילוב עם סוניקציה כדי לנתק ולפרק את תאי הביופילם הנצמדים לתמיסה פלנקטונית לפני דילול סדרתי וספירת החיידקים החיים (MBEC נקבע כריכוז הנמוך ביותר שמפחית את הספירה שהוחזרה ב-≥3 log10 ביחס לביופילם שלא טופל). הסוניקציה משפרת באופן משמעותי את איכות הפיזור: שחרור לא מלא של תאים מוטמעים ממטריצת ה-EPS מוביל להערכת חסר של מידת ההשמדה ולניפוח ערכי ה-MBEC. השימוש הממוקד באולטרסאונד על בארות מחזיקי ה-PEG ברחבי צלחות הבדיקה באמצעות מכשיר האולטרסאונד למיקרו-צלחות UIP400MTP מתגבר על החולשות המסורתיות של אולטרסאונד באמבטיה – כלומר, חלוקה לא אחידה של האנרגיה, התחממות וסיכון לזיהום מארוסולים או לזיהום צולב.
גלו כיצד מכשיר הסוניקטור ללא מגע למיקרו-פלטה UIP400MTP מקל על ביצוע בדיקות MBEC!
האם נעשה שימוש באולטרסאונד בבדיקות MIC?
שימוש באולטרסאונד מיושם בתהליכי עבודה שונים הקשורים ל-MIC כדי לשפר את היעילות ואת יכולת השחזור:
- מיקובקטריולוגיה, שבה ליחה ודגימות צמיגות אחרות עוברות באופן שגרתי תהליך של חיטוי והומוגניזציה, לעיתים באמצעות אולטרסאונד, לפני בדיקת הרגישות, ושתלי מיקובקטריה היוצרים גושים מפיקים תועלת מפיזור קצר לצורך קבלת ערכי MIC מדויקים;
- אורגניזמים הנוטים ליצירת אגרגטים (למשל, סטרפטוקוקים, סטפילוקוקים בגרגרים), שבהם מיקרו-אגרגטים מעוותים את צפיפות התרבית; ו-
- אבחון משולב, כגון סוניקציה של שתל, תרבית נוזלית ולאחר מכן בדיקת רגישות, במקרים של זיהום במפרק תותב (שימוש בסגנון MBEC, ולא בשיטת ה-MIC הקלאסית).
ספרות / מקורות
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
בחרו את הצלחת שלכם! מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP550MTP מפריד דגימות חיידקים בכל צלחת רב-תאים סטנדרטית.
דגמי סוניקטור רב-דגימות של Hielscher UIP400MTP עבור מיקרו-צלחות, VialTweeter ו קופהורן: הכנת דגימות במהירות גבוהה ובנפח גבוה