פרוטוקול לשימוש בסוניקטורים מרובי דגימות של Hielscher בחקר ביופילם ובאנליזה פרוטאומית

השימוש בסוניקטורים מרובי דגימות, כגון הסוניקטור למספר מבחנות VialTweeter והסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP, מייעל תהליכי עבודה במעבדה ליישומים בתפוקה גבוהה. שני המכשירים מאפשרים עיבוד אולטרסוני מדויק ואחיד של מספר דגימות, תוך מזעור השונות ושיפור השחזוריות. הדבר מועיל במיוחד בניסויים הדורשים ליזיס אחיד של דגימות, ניתוק ביופילם, מיצוי חלבונים או עיכול פרוטאוליטי, שבהם שיטות ידניות או שיטות לעיבוד דגימה יחידה יעילות פחות ומועדות לחוסר אחידות.

ייעול תהליכי עבודה באמצעות סוניקטורים מרובי דגימות

UIP400MTP, למשל, מאפשר טיפול אולטרסוני בו־זמני בבאריות של מיקרופלטה, ומבטיח ניתוק אחיד של ביופילמים או חומר תאי. במקביל, VialTweeter מאפשר ליזיס והומוגניזציה מדויקים של מספר דגימות במבחנות, ללא זיהום צולב. סוניקטורים אלה מקצרים משמעותית את זמני העיבוד, משפרים את שחזוריות הניסויים ושומרים על שלמות גבוהה של הדגימות, ובכך הופכים לכלים חיוניים במחקר במיקרוביולוגיה, בפרוטאומיקה ובביולוגיה מולקולרית.
להלן פרוטוקול מפורט המדגים את השימוש בדגמי הסוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher, הסוניקטור למספר מבחנות VialTweeter והסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP, במחקר העוסק ביצירת ביופילם של E. coli ובאנליזה פרוטאומית לאחר מכן.

פרוטוקול: יצירת ביופילם, ניתוקו ואנליזה פרוטאומית באמצעות סוניקטורים מרובי דגימות של Hielscher

1. הכנת תרבית חיידקים

• גדלו חיידקי E. coli (זן W3110) בטמפרטורה של 30°C, טמפרטורה המעודדת יצירת ביופילם של E. coli, במצע מרק טריפטון (TB) המכיל:
  – 10 g/L טריפטון
  – 5 g/L NaCl
• הוסיפו אנטיביוטיקה לפי הצורך כדי להבטיח את שימור הפלסמיד.
• למחקרי מיקרוסקופיה ופעילות פרומוטורים, השתמשו בזן W3110 של E. coli המכיל בגןום גן מדווח של GFP משופר (eGFP), תחת בקרת הפרומוטור rplL.
• השתמשו בפלסמידים עם גן מדווח GFP עבור פרומוטורים שונים (למשל, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) כדי למדוד את פעילות הפרומוטורים.

2. גידול ביופילם וניתוקו

• זרעו 1.5 mL של תרבית חיידקים מדוללת בכל בארית בפלטה בת 12 באריות (פלטות CellStar בנות 12 באריות, Greiner Bio-One).
• הדגירו כדי לאפשר יצירת ביופילם.
• הסירו בזהירות את התרבית הפלנקטונית (שאינה צמודה למשטח).

– שטפו כל בארית ב־500 µL של PBS.
– נתקו תאים צמודים באמצעות סוניקציה של הפלטה בת 12 הבאריות בסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP. המכשיר UIP400MTP מבטיח ניתוק אחיד באמצעות העברת אנרגיה אולטרסונית עקבית לכל הבאריות.
– הגדרות סוניקציה: אמפליטודה של 60%, מצב מחזורי: 60 sec הפעלה / 30 sec הפסקה.

3. איסוף תאים וליזיס

• צנטריפגו את תאי הביופילם שנותקו ב־4,500 g במשך 5 דקות.
• שטפו את התאים שבמשקע ב־PBS.
• הרחיפו מחדש את התאים ב־100 µL של נתרן לאורויל סרקוזינט (SLS) בריכוז 2% והדגירו ב־95°C במשך 15 דקות.
• בצעו סוניקציה באמצעות הסוניקטור למספר מבחנות VialTweeter כדי להבטיח ליזיס מלא של התאים.
  – הגדרות סוניקציה: אמפליטודה של 100%, 50 s הפעלה / 10 s הפסקה, למשך זמן פעולה כולל של 10 min; שמרו את הדגימות על קרח.

4. חיזור ואלקילציה

• הוסיפו 5 mM של Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) לחיזור קשרים דיסולפידיים והדגירו ב־95°C במשך 15 דקות.
• בצעו אלקילציה של החלבונים באמצעות יודואצטאמיד בריכוז 10 mM במשך 30 דקות ב־25°C.

5. כימות חלבונים ועיכול

• צנטריפגו את הליזטים לסילוק שברי תאים.
• כמתו את תכולת החלבון הכוללת באמצעות Pierce BCA Protein Assay Kit.
• עכלו 50 µg של חלבון כולל באמצעות 1 µg טריפסין בתמיסה המכילה 2% SLS ו־100 mM אמוניום ביקרבונט.
• הדגירו את תגובת העיכול למשך הלילה ב־30°C.

6. טיהור פפטידים

• השקיעו את ה־SLS באמצעות הוספת חומצה טריפלואורואצטית (TFA) בריכוז 1.5%, ולאחר מכן צנטריפגו.
• טהרו את הפפטידים באמצעות עמודות מיקרוספין C18.
• ייבשו את הפפטידים המטוהרים והרחיפו אותם מחדש ב־0.1% TFA.

7. כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS)

• נתחו את הפפטידים באמצעות ספקטרומטר מסה Q-Exactive Plus המצומד למערכת Ultimate 3000 RSLC nano.
• הפרידו את הפפטידים באמצעות עמודת HPLC בפאזה הפוכה (75 µm × 42 cm) הממולאת בשרף C18 ‏(2.4 µm).
• הפעילו גרדיאנט מ־2% עד 35% של ממס B (אצטוניטריל עם 0.15% חומצה פורמית) במשך 140 דקות.
• אספו נתונים באמצעות סריקות MS ברזולוציה גבוהה, ולאחריהן סריקות MS/MS בטנדם של 10 היונים בעלי העוצמה הגבוהה ביותר.

8. ניתוח נתונים

• עבדו את נתוני ה־LC-MS הגולמיים באמצעות תוכנת Progenesis.
• ייצאו קובצי .mgf ונתחו אותם באמצעות MASCOT.
• בצעו כימות פפטידים באמצעות SafeQuant לבקרת איכות ולתיקון בגין גילויים כוזבים.
• בצעו את כל הניסויים בשתי חזרות או בשלוש חזרות כדי להבטיח שחזוריות.

סוניקטורים מרובי דגימות להכנת דגימות בתפוקה גבוהה

דגמי הסוניקטורים מרובי הדגימות VialTweeter ו־UIP400MTP משפרים משמעותית את הדיוק והיעילות של תהליכי עבודה ניסויים, במיוחד בחקר ביופילמים ובפרוטאומיקה. יכולתם לעבד מספר דגימות באופן אחיד מבטיחה תפוקה גבוהה בלי לפגוע באיכות הנתונים. יתרונות אלה, בשילוב תהליכי העבודה היעילים שתוארו לעיל, הופכים את הסוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher לכלים חיוניים למחקר ביולוגי מודרני.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

המכשירים האולטרסוניים של Hielscher ידועים בתקני האיכות והתכנון הגבוהים ביותר שלהם. עמידות וקלות הפעלה מאפשרות שילוב חלק של המכשירים האולטרסוניים שלנו במתקנים תעשייתיים. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO ושמה דגש מיוחד על מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מהמתקדמות ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו־RoHs.