פרוטוקול באמצעות Hielscher Multi-Sample Sonicators בביופילם ואנליזה פרוטאומית

השימוש בסוניקטורים מרובי דגימות, כגון VialTweeter Multi-Tube Sonicator ו-UIP400MTP Microplate Sonicator, מייעל את תהליכי העבודה במעבדה עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה. שני המכשירים מאפשרים עיבוד קולי מדויק ואחיד על פני דגימות מרובות, ממזערים את השונות ומשפרים את יכולת השחזור. זה יתרון במיוחד בניסויים הדורשים ליזה דגימה עקבית, ניתוק ביופילם, מיצוי חלבונים או עיכול מפרקי חלבון, שבהם שיטות ידניות או מדגם יחיד הן פחות יעילות ומועדות לחוסר עקביות.

ייעל את זרימות העבודה עם סוניקטורים מרובי דוגמאות

UIP400MTP, למשל, מאפשר טיפול על-קולי סימולטני בבארות מיקרו-פלטות, ומבטיח ניתוק אחיד של ביופילמים או חומר תאי. בינתיים, VialTweeter מציע ליזה מדויקת והומוגניזציה של דגימות צינור מרובות ללא זיהום צולב. סוניקטורים אלה מקצרים באופן משמעותי את זמני העיבוד, משפרים את יכולת השחזור של הניסוי ושומרים על שלמות דגימה גבוהה, מה שהופך אותם לכלים חיוניים במחקר מיקרוביולוגיה, פרוטאומיקה וביולוגיה מולקולרית.
להלן פרוטוקול מפורט המדגים את השימוש בדגמי הסוניקטור מרובי הדגימות של Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator ו- Microplate Sonicator UIP400MTP, במחקר שכלל היווצרות ביופילם E. coli וניתוח פרוטאומי לאחר מכן.

פרוטוקול: היווצרות ביופילם, ניתוק, ואנליזה פרוטאומית באמצעות Hielscher Multi-Sample Sonicators

1. הכנת תרבית חיידקים

• תרבית חיידקי E. coli (זן W3110) בטמפרטורה של 30°C, טמפרטורה נוחה ליצירת ביופילם E. coli, בתווך ציר טריפטון (TB) המכיל:
  – 10 גרם/ליטר טריפטון
  – 5 גרם/ליטר NaCl
• יש ליטול תוסף אנטיביוטי לפי הצורך כדי להבטיח שימור פלסמיד.
• למחקרי מיקרוסקופיה ופעילות מקדמי מכירות, השתמש בזן W3110 E. coli עם כתב GFP משופר גנומי (eGFP) תחת שליטתו של מקדם rplL.
• השתמש בפלסמידים של כתב GFP עבור מקדמים שונים (למשל, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) כדי למדוד פעילויות מקדם.

2. גידול וניתוק ביופילם

• זרעו 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים מדוללת לכל באר לתוך צלחת של 12 בארות (CellStar 12-well plates, Greiner Bio-One).
• לדגור כדי לאפשר היווצרות ביופילם.
• הסר בזהירות את התרבות הפלנקטונית (שאינה דבקה).

– לשטוף כל באר עם 500 μL PBS.
– נתק תאים מחוברים על ידי סוניקציה של לוח 12 בארות בסוניקטור UIP400MTP microplate. UIP400MTP מבטיח ניתוק אחיד על ידי אספקת אנרגיה קולית עקבית על פני כל הבארות.
– הגדרות סוניקציה: 60% משרעת, מצב מחזור: 60 שניות הפעלה / 30 שניות כבוי.

3. קצירת תאים וליזיס

• צנטריפוגה ניתקה תאי ביופילם במשקל 4,500 גרם למשך 5 דקות.
• לשטוף תאים גלולות עם PBS.
• יש להשהות מחדש תאים ב-100 מיקרוליטר של 2% נתרן לאורואיל סרקוזינט (SLS) ולדגור ב-95°C למשך 15 דקות.
• Sonicate באמצעות VialTweeter Multi-Tube Sonicator כדי להבטיח ליזה מלאה של התא.
  – הגדרות סוניקציה: 100% משרעת, 50 שניות הפעלה / 10 שניות כיבוי למשך זמן פעולה כולל של 10 דקות; יש לשמור דגימות על קרח.

4. הפחתה ואלקילציה

• הוסף 5 mM Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) כדי להפחית קשרים דיסולפידים ולדגור ב 95°C במשך 15 דקות.
• חלבונים אלקילט עם יודואצטמיד 10 mM למשך 30 דקות ב-25°C.

5. כימות ועיכול חלבונים

• צנטריפוגות ליזציות לפינוי פסולת.
• כמת את תכולת החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת החלבון של פירס BCA.
• לעכל 50 מיקרוגרם חלבון סה"כ עם 1 מיקרוגרם טריפסין בתמיסה המכילה 2% SLS ו-100 מילימטר אמוניום ביקרבונט.
• יש לדגור על תגובת העיכול למשך הלילה ב-30°C.

6. טיהור פפטיד

• לזרז SLS על ידי הוספת 1.5% חומצה trifluoroacetic (TFA), ולאחר מכן צנטריפוגה.
• לטהר פפטידים באמצעות עמודות מיקרוספין C18.
• יש לייבש פפטידים מטוהרים ולהשהות מחדש ב-0.1% TFA.

7. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS)

• נתח פפטידים על ספקטרומטר מסות Q-Exactive Plus בשילוב עם מערכת ננו Ultimate 3000 RSLC.
• יש להפריד פפטידים באמצעות עמוד HPLC בפאזה הפוכה (75 מיקרומטר × 42 ס"מ) עמוס בשרף C18 (2.4 מיקרומטר).
• יש למרוח שיפוע מ-2% עד 35% ממס B (אצטוניטריל עם 0.15% חומצה פורמית) במשך 140 דקות.
• קבל נתונים באמצעות סריקות MS ברזולוציה גבוהה ואחריה סריקות MS/MS טנדם של 10 היונים האינטנסיביים ביותר.

8. ניתוח נתונים

• עבד נתוני LC-MS גולמיים באמצעות תוכנת Progenesis.
• יצא קבצי .mgf ונתח אותם באמצעות MASCOT.
• בצע כימות פפטידים באמצעות SafeQuant לבקרת איכות והתאמת גילוי שווא.
• ערוך את כל הניסויים בכפילויות או בטריפליקטים כדי להבטיח יכולת שחזור.

סוניקטורים מרובי דגימות להכנת דגימות בתפוקה גבוהה

דגמי הסוניקטור מרובי הדגימות VialTweeter ו-UIP400MTP משפרים באופן משמעותי את הדיוק והיעילות של תהליכי עבודה ניסיוניים, במיוחד במחקר ביופילם ובפרוטאומיקה. היכולת שלהם לעבד דגימות מרובות באופן אחיד מבטיחה קיבולת תפוקה גבוהה מבלי להתפשר על איכות הנתונים. יתרונות אלה, בשילוב עם תהליכי העבודה היעילים שתוארו לעיל, הופכים את הסוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher לכלים חיוניים למחקר ביולוגי מודרני.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסוניקטורים Hielscher.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.