הסרת פרפין ומיצוי חלבונים מרקמות FFPE

הקלו על מיצוי חלבונים מחתכי רקמה מקובעת בפורמלין ומוטבעת בפרפין (FFPE) באמצעות שילוב מיטבי של הסרת פרפין, המסה וסוניקציה באמצעות מכשיר אולטרסוני רב־מבחנתי VialTweeter. פרוטוקול זה תומך באנליזות פרוטאומיות מבוססות ספקטרומטריית מסה בשלבי ההמשך, ותואם לתהליכי עבודה של ניקוי בשיטת SP3 ועיכול אנזימטי.

נוהל עבודה תקני זה מיועד לאנשי מעבדה העוסקים באנליזה פרוטאומית של דגימות רקמת FFPE באמצעות סוניקציה בעלת ביצועים גבוהים. הוא מותאם לעיבוד מקביל של עד עשר דגימות FFPE באמצעות מכשיר הסוניקציה הרב־מבחנתי VialTweeter.

פרוטוקול: מיצוי חלבונים מדגימות FFPE באמצעות VialTweeter

חומרים וריאגנטים

ריאגנטים

• קסילן (בדרגת ניקיון להיסטולוגיה)
• אתנול (מוחלט 96%)
• בופר לפירוק תאים:

6 M גואנידין הידרוכלוריד
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין)
40 mM CAA (2-כלורואצטאמיד)

• מעכב פרוטאזות (אופציונלי; למשל, cOmplete™ mini ללא EDTA)

ציוד

• מכשיר אולטרסוני רב־מבחנתי VialTweeter
• מבחנות מיקרוצנטריפוגה בעלות ספיחה נמוכה בנפח 1.5 mL או 2.0 mL
• בלוק חימום או אינקובטור (הגדרות של 95°C ו־80°C)
• מיקרוצנטריפוגה
• תרמומיקסר (אופציונלי אך מומלץ)

כמות הדגימה ההתחלתית

• 1–2 חתכים של רקמת FFPE בעובי 10 µm לכל דגימה (כלומר, לכל בקבוקון)

או

• סך הכול ~100 µg רקמה לכל דגימה (כלומר, לכל בקבוקון)

הערה: השתמשו בלהבים חדשים לחיתוך במיקרוטום כדי למזער זיהום בשאריות פרפין.

הליך

1. הסרת פרפין
   1. העבירו את חתכי ה־FFPE למבחנות מיקרוצנטריפוגה בעלות ספיחה נמוכה.
   2. הוסיפו 1 mL קסילן וערבלו קצרות בוורטקס.
   3. הדגירו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. צנטריפגו ב־14,000 × g במשך 2 דקות; השליכו את הנוזל העליון.
   5. חזרו על השטיפה בקסילן פעם נוספת (שלבים 2–4).
   6. שטפו את המשקע ב־1 mL אתנול בריכוז 96%, ערבלו בוורטקס ולאחר מכן צנטריפגו ב־14,000 × g במשך 2 דקות. השליכו את הנוזל העליון.
   7. חזרו על השטיפה באתנול פעם נוספת (סך הכול 2 שטיפות באתנול).
   8. ייבשו את המשקע באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כשהמכסים פתוחים, כדי לאדות את שאריות האתנול.
2. מיצוי חלבונים וסוניקציה
   1. הוסיפו 200 µL בופר לפירוק תאים לכל משקע יבש.

      הערה: אף שמכשיר הסוניקציה מאפשר עבודה עם עד 1 mL, נפח של 200 µL הוא מיטבי לעיבוד בהמשך.

   2. ערבבו באמצעות וורטקס או פיפטציה עדינה.
3. הדגרה תרמית ראשונה
   1. הדגירו את המבחנות ב־95 °C במשך 30 min, תוך ניעור ב־400 rpm באמצעות תרמומיקסר או בלוק חימום.
   2. הניחו לדגימות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 5 min.
4. סוניקציה ראשונה באמצעות VialTweeter
   1. הניחו את המבחנות בתוך VialTweeter.
   2. הגדירו את VialTweeter UP200St לערכים שלהלן ובצעו סוניקציה.
הגדרות מכשיר הסוניקציה
• הגדירו את המשרעת (A) ל־100%
• הגדירו את מצב הפעימות (C) ל־100%
• שעון מחזור: מופעל
• זמן הפעלה: 60s
• זמן השבתה: 30s
• ערך גבול: 15 min (תואם ל־10 מחזורים)
(הערת חישוב: (60 s הפעלה + 30 s השבתה) × 10 מחזורים = 900 s = 15 min)
5. הדגרה תרמית שנייה
   הוציאו את המבחנות והדגירו שוב ב־95 °C במשך 15 min, ב־400 rpm.
6. סוניקציה שנייה
   חזרו על הסוניקציה באמצעות VialTweeter באותן הגדרות (כמפורט לעיל) למשך 10 מחזורים נוספים (15 min בסך הכול).
7. הצללת הליזט
   1. צנטריפגו את הדגימות ב־13,000 × g במשך 10 min ב־23°C (טמפרטורת החדר).
   2. אספו בזהירות את הנוזל העליון למבחנת Eppendorf Safe-lock חדשה בנפח 2.0 mL. הימנעו מערעור המשקע.
8. עיבוד בהמשך
   הליזט מוכן כעת לניקוי בשיטת SP3 ולעיכול אנזימטי.

הערות והמלצות עבודה

1. הסיכון להתחממות יתר במהלך הסוניקציה מופחת באמצעות מחזורי הפעלה והשבתה מתוכנתים.
2. הימנעו מערבול בוורטקס לאחר הסוניקציה כדי למנוע אגרגציה של חלבונים.

סילוק פסולת ובטיחות

הטבלה שלהלן מספקת הערכה של קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו בגודל מעבדתי: