דה-פרפיניזציה ומיצוי חלבון מ-FFPE

הקל על מיצוי חלבון מקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין (FFPE) באמצעות שילוב אופטימלי של דה-פראפיניזציה, מסיסות וסוניקציה עם אולטרסאונד מרובה צינורות VialTweeter. פרוטוקול זה תומך בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה במורד הזרם ותואם לתהליכי עבודה של ניקוי SP3 ועיכול אנזימטי.

SOP זה מיועד לאנשי מעבדה העוסקים בניתוח פרוטאומי של דגימות רקמת FFPE באמצעות סוניקציה בעלת ביצועים גבוהים. הוא מותאם עבור עד עשר דגימות FFPE המעובדות במקביל באמצעות VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

פרוטוקול: מיצוי חלבון מדגימות FFPE באמצעות VialTweeter

חומרים וריאגנטים

ריאגנטים

• קסילן (דרגה היסטולוגית)
• אתנול (96% מוחלט)
• חיץ ליזיס:

6 מ' גואנידין הידרוכלוריד
50 מ"מ Tris-HCl, pH 8.5
10 מ"מ TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 מ"מ CAA (2-כלורואצטמיד)

• מעכב פרוטאז (אופציונלי; למשל, cOmplete™ מיני ללא EDTA)

ציוד

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• צינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי כריכה נמוכה של 1.5 מ"ל או 2.0 מ"ל
• בלוק חום או אינקובטור (הגדרות 95°C ו-80°C)
• מיקרוצנטריפוגה
• Thermomixer (אופציונלי אך מומלץ)

קלט לדוגמא

• 1-2 קטעים של רקמת FFPE בעובי 10 מיקרומטר לדגימה (כלומר לכל בקבוקון)

או

• סה"כ ~100 מיקרוגרם רקמה לדגימה (כלומר לכל בקבוקון)

הערה: השתמש בלהבים טריים למיקרוטומיה כדי למזער את זיהום פסולת הפרפין.

פרוצדורה

1. דה-פרפיניזציה
   1. העבירו קטעי FFPE לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה.
   2. הוסף 1 מ"ל קסילן, מערבולת קצרה.
   3. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 × גרם למשך 2 דקות; זרוק סופרנטנט.
   5. חזור על שטיפת קסילן פעם נוספת (שלבים 2-4).
   6. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של 96% אתנול, מערבולת, ואז צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 2 דקות. השליכו סופרנטנט.
   7. חזור על שטיפת אתנול פעם נוספת (סה"כ 2 שטיפות אתנול).
   8. גלולה יבשה באוויר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם מכסים פתוחים לאידוי שאריות אתנול.
2. מיצוי חלבון וסוניקציה
   1. הוסף מאגר ליזה של 200 מיקרוליטר לכל גלולה יבשה.
      הערה: למרות שהסוניקטור יכול להכיל עד 1 מ"ל, 200 מיקרוליטר הוא אופטימלי לעיבוד במורד הזרם.

   2. מערבבים על ידי מערבולת או פיפטינג עדין.
3. דגירה תרמית ראשונה
   1. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, עם תסיסה ב-400 סל"ד באמצעות מערבל תרמי או בלוק חום.
   2. תנו לדגימות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
4. סוניקציה ראשונה עם ה-VialTweeter
   1. הכנס את הצינורות לתוך ה-VialTweeter.
   2. הגדר את ה-VialTweeter UP200St לערכים שלהלן ו-sonicate.
הגדרות Sonicator
• הגדר את המשרעת (A) ל-100%
• הגדר את מצב הפעימה (C) ל-100%
• שעון תקופתי: מופעל
• בזמן: שנות ה-60
• זמן הפסקה: 30 שניות
• ערך גבול: 15 דקות (מתאים ל -10 מחזורים)
(הערת חישוב: (60 שניות מופעל + 30 שניות כבוי) × 10 מחזורים = 900 שניות = 15 דקות)
5. דגירה תרמית שנייה
   יש להסיר את הצינורות ולדגור שוב בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 400 סל"ד.
6. סוניקציה שנייה
   חזור על סוניקציה ב-VialTweeter באמצעות אותן הגדרות (כמו לעיל) למשך 10 מחזורים נוספים (סה"כ 15 דקות).
7. הבהרת ליזאט
   1. צנטריפוגה את הדגימות ב-13,000 × גרם למשך 10 דקות ב-23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר).
   2. אסוף בזהירות את הסופרנטנט לתוך צינור אפנדורף חדש בנפח 2.0 מ"ל. הימנע מהפרעה לגלולה.
8. עיבוד במורד הזרם
   הליזאט מוכן כעת לניקוי SP3 ולעיכול אנזימטי.

הערות ושיטות עבודה מומלצות

1. הסיכון להתחממות יתר במהלך סוניקציה מופחת על ידי רכיבה על אופניים מתוכנתת ON/OFF.
2. הימנע ממערבולת לאחר סוניקציה כדי למנוע צבירת חלבונים.

פינוי פסולת ובטיחות

הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה לגבי יכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד בגודל מעבדה שלנו: