פרוטוקול לגידול ולהסרה של ביופילם של Staphylococcus

שיטות מתוקננות חיוניות להשגת תוצאות מחקר מהימנות. כאן תוכלו למצוא פרוטוקול לגידול ולהסרה של ביופילמים של Staphylococcus. פרוטוקול זה מתמקד בייעול הכנת דגימות בתפוקה גבוהה באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP, להסרה יעילה של ביופילם בתפוקה גבוהה בפלטות בעלות 96 באריות. הפרוטוקול כולל גם שלבים מרכזיים לגידול, לשטיפה ולהמחשה של ביופילם, תוך התמקדות בצמצום השונות ובהבטחת הדירות.

ביופילם של Staphylococcus ומחקר אנטיביוטיקה

ביופילמים של Staphylococcus ממלאים תפקיד מרכזי בזיהומים מתמשכים בשל עמידותם לאנטיביוטיקה ולתגובות מערכת החיסון. היווצרות ביופילם מספקת לחיידקים סביבה מגינה, המקשה על הטיפול בזיהומים. מחקר ביופילמים מתמקד לעיתים קרובות בהבנת היווצרותם, התנהגותם ורגישותם לחומרים אנטימיקרוביאליים, תוך דגש על שיטות בתפוקה גבוהה לייעול תהליכי העבודה הניסויים.
מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP מציע יתרון משמעותי במחקר ביופילמים בכך שהוא מאפשר הסרה מהירה ויעילה של ביופילמים מפלטות בעלות 96 באריות. מכשיר זה מספק אנרגיה אולטרסונית אחידה לכל הבאריות, ומבטיח תוצאות עקביות תוך צמצום השונות.

פרוטוקול לגידול ולהסרה של ביופילם של Staphylococcus

להלן נדריך אתכם שלב אחר שלב בתהליך הגידול וההסרה של ביופילם של Staphylococcus. כדוגמה לשלב אנליטי, נציג כיצד לכמת בשיטה ספקטרופוטומטרית את הביומסה שגודלה באמצעות צביעה בקריסטל ויולט.

גידול ביופילם של Staphylococcus

חומרים וציוד נדרשים:

• פלטות מיקרוטיטר סטריליות מפוליסטירן בעלות 96 באריות עם תחתית שטוחה, שעברו טיפול להתאמה לתרבית רקמה, עם מכסים
• מצע נוזלי טריפטיק סויה (TSB) עם 0.25% גלוקוז
• מנדף בטיחות ביולוגית

שלבים:

1. הכינו סביבת עבודה סטרילית במנדף בטיחות ביולוגית כדי לצמצם זיהום.
2. הוסיפו TSB המכיל 0.25% גלוקוז לבאריות פלטת המיקרוטיטר. TSB ללא גלוקוז בדרך כלל אינו תומך בהיווצרות ביופילם, ויש להשתמש בו רק כביקורת אם נדרש.
3. זרעו בבאריות זני חיידקים שהוכנו כמתואר להלן:
4. הכינו תרחיפי חיידקים, תוך הבטחה שאין צברי תאים קיימים, באמצעות הומוגניזציה של התרחיפים בסוניקציה או באמצעות פירוק הצברים במחט בקוטר 23-gauge וערבול קצר בוורטקס.
5. סגרו את הפלטה במכסה שלה והדגירו בתנאים מיטביים להיווצרות ביופילם (למשל, 37°C למשך 24 שעות).
6. בצעו את הניסוי בשלוש חזרות לכל זן חיידקים (שלוש באריות לכל זן) כדי להבטיח מהימנות.
7. הקצו שש באריות בכל פלטה לביקורות שליליות. ניתן לבדוק עד 30 זנים בכל פלטה בעלת 96 באריות.

המחשה ושטיפה של ביופילם

1. לאחר ההדגרה, השליכו את המצע בזהירות כדי להימנע מפגיעה בביופילם.
2. שטפו כל בארית ארבע פעמים בתמיסת מלח פיזיולוגית כדי להסיר חיידקים פלנקטוניים.
3. בדקו את תחתית הבאריות לאיתור כתמים לבנים המעידים על נוכחות ביופילם.

הסרת ביופילם באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP

הגדרת המכשיר ופרמטרים:

• מכשיר סוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP
• הגדרות הפעלה: אמפליטודה של 60%, מצב מחזורי עם 60 שניות הפעלה / 30 שניות השבתה

שלבים:

1. הניחו את פלטת המיקרוטיטר השטופה על משטח ה-UIP400MTP.
2. בצעו סוניקציה של הדגימות בהגדרות המומלצות (אמפליטודה של 60%, 60 שניות הפעלה, 30 שניות השבתה). התאימו את ההגדרות לזן החיידקים.
3. התחילו בתהליך הסוניקציה להסרת הביופילם. הגלים האולטרסוניים מפרקים את מטריצת הביופילם ומשחררים את החיידקים הנצמדים.
4. ה-UIP400MTP מבטיח חשיפה אחידה בכל הבאריות לקבלת תוצאות הסרה עקביות.

שלב אנליטי: כימות הביומסה של ביופילם Staphylococcus שהוסר באמצעות קריסטל ויולט (CV)

חומרים וציוד נדרשים:

• תמיסת קריסטל ויולט (CV) בריכוז 0.1%
• אתנול 95% או חומצה אצטית 30% (להמסה)
• קורא מיקרופלטות המסוגל למדוד באורך גל של 570 nm
• פלטות מיקרוטיטר סטריליות לצביעה

שלבים:

1. הכנת פלטת הצביעה: העבירו 100 µL מתרחיף הביופילם שנותק מכל באר בפלטה שעברה סוניקציה אל הבארות המתאימות בפלטת מיקרוטיטר נקייה וסטרילית בעלת 96 בארות. כך מובטחת סביבה נקייה ואחידה לצביעה.
2. צביעת הביופילם שנותק: הוסיפו 150 µL של תמיסת קריסטל ויולט בריכוז 0.1% לכל באר המכילה את תרחיף הביופילם שנותק. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטה כדי להבטיח ערבוב אחיד של תרחיף הביופילם והקריסטל ויולט.
3. הדגרה: הדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר לקריסטל ויולט לצבוע את הביומסה ביעילות.
4. שטיפה: לאחר ההדגרה, סלקו בזהירות את תמיסת הקריסטל ויולט מהבארות בלי להפריע לביומסה. שטפו כל באר שלוש פעמים בתמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית כדי להסיר צבע שלא נקשר.
5. ייבוש: הניחו לפלטה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר או במנדף בעל זרימת אוויר סטרילית. הימנעו מחימום, שכן הוא עלול לשנות את התוצאות.
6. המסה: הוסיפו לכל באר 200 µL של אתנול 95% (או חומצה אצטית 30%, בהתאם לנהלים המקובלים במעבדה) כדי להמיס את הקריסטל ויולט הקשור. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטה או בניעור הפלטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. מדידה: מדדו את הצפיפות האופטית (OD) של תמיסת הקריסטל ויולט המומס באורך גל של 570 nm באמצעות קורא מיקרופלטות.
8. ניתוח נתונים: הפחיתו את ערך ה־OD570 הממוצע של הביקורות השליליות (בארות עם TSB אך ללא מידבק חיידקי) מהערכים של בארות הניסוי כדי להביא בחשבון את צביעת הרקע. תעדו ונתחו את הנתונים.

הערה: בצעו את הניסוי בשלוש חזרות לכל תנאי כדי להבטיח שחזוריות. הקפידו על טיפול נאות בקריסטל ויולט ובאתנול, תוך הקפדה על נוהלי הבטיחות וסילוק הפסולת.
 

היתרונות המרכזיים של UIP400MTP במבט מהיר:

• עיבוד בתפוקה גבוהה: תוכנן במיוחד לפלטות מרובות בארות, ומאפשר לכם לעבד דגימות רבות בו־זמנית.
• פיזור אולטרסוני אחיד: מבטיח עוצמה אולטרסונית שווה בכל הבארות, לקבלת תוצאות עקביות בכל הדגימות.
• השתמשו בכל פלטה סטנדרטית: UIP400MTP יכול לעבד כל פלטה סטנדרטית מרובת בארות, צלחות פטרי ומעמדי מבחנות. אין צורך בפלטות ייעודיות יקרות של היצרן!
• ממשק ידידותי למשתמש: קל להגדרה ולשליטה, ולכן הוא כלי מצוין להגדלת תפוקת המעבדה. הגדרות ניתנות לתכנות ואוטומציה מקלות על תקנון התהליך!