פרוטוקול MBEC Assay באמצעות 96-well Plate Sonicator UIP400MTP

בדיקת MBEC משמשת לקביעת ריכוז החומרים האנטי-מיקרוביאליים הדרושים לסילוק ביופילמים שנוצרו על מכסי יתדות. כדי להעריך את כדאיות הביופילם, יש לנתק תחילה את הביופילמים ממכסי היתדות של צלחת בעלת 96 בארות. סוניקציה היא השיטה האמינה והיעילה ביותר לניתוק זה. UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות תוכנן במיוחד לעיבוד לוחות בדיקה ביעילות ונוחות מרביות, ייעול והאצה של מבחני MBEC בעלי תפוקה גבוהה.

סוניקציה לניתוק ביופילם

סוניקציה היא צעד מכריע במבחני ריכוז בי-פילם מינימלי (MBEC), המאפשר עקירה יעילה של תאי ביופילם מחיבור פני השטח שלהם. ביופילמים הם קהילות מובנות מטבען של מיקרואורגניזמים העטופים במטריצה חוץ-תאית, מה שהופך אותם לעמידים יותר באופן משמעותי לחומרים אנטי-מיקרוביאליים בהשוואה לתאים פלנקטוניים. במהלך בדיקות MBAC, סוניקציה משתמשת בגלים על-קוליים כדי ליצור קוויטציה מבוקרת, משבשת את מטריצת הביופילם ומשחררת תאים משובצים לתרחיף. שלב זה מבטיח כי תאי הביופילם מפוזרים באופן שווה בתווך ההתאוששות, מה שמקל על הערכות כדאיות מדויקות באמצעות ציפוי, דילול או שיטות ספקטרופוטומטריות. ללא היפרדות ביופילם נכונה, רכיבי מטריצה שיורית עלולים להגן על התאים, מה שמוביל להערכת חסר של יעילות מיקרוביאלית. לכן, סוניקציה היא הכרחית להשגת ערכי MBEC אמינים הניתנים לשחזור, המשקפים את פוטנציאל החיסול האמיתי של הסוכנים הנבדקים. UIP400MTP הסוניקטור של לוחות מרובי בארות מאפשר הכנת דגימה קלה בתפוקה גבוהה בצלחות בדיקה.

ריכוז מינימלי לחיסול ביופילם (MBEC) פרוטוקול בדיקה

שלב 1: היווצרות ביופילם

1. הכינו את התרחיף החיידקי:
   לגדל חיידקים במדיה המתאימה לצמיחה בשלב הרישום.
   לדלל את תרבית החיידקים לצפיפות אופטית מוגדרת (למשל, OD600 ~ 0.1).
2. לחסן את צלחת 96 בארות:
   הוסף את התרחיף החיידקי (למשל, 150-200 μL) לכל באר של צלחת מיקרוטיטר סטנדרטית של 96 בארות.
3. חבר את מכסה היתד:
   הניחו את מכסה היתד על הצלחת המחוסנת כדי לאפשר היווצרות ביופילם על משטחי היתדות.
4. לדגור על הצלחת:
   יש לדגור על המערך בטמפרטורה מתאימה (למשל, 37°C) למשך 24-48 שעות ללא טלטול כדי לעודד צמיחת ביופילם.

שלב 2: טיפול בחומרים אנטי-מיקרוביאליים

• הכינו תמיסות אנטי-מיקרוביאליות:
  הכינו מגוון ריכוזים אנטי-מיקרוביאליים במצע טרי.
  חשיפת ביופילמים לחומרים אנטי-מיקרוביאליים:
  הסירו את מכסה היתד מתרבית החיידקים ושטפו אותו במי מלח סטריליים או PBS כדי להסיר תאים פלנקטוניים.
  הכניסו את מכסה היתד לצלחת חדשה בת 96 בארות המכילה את התמיסות האנטי-מיקרוביאליות.
• לדגור על הצלחת:
  יש לדגור לתקופה מוגדרת (למשל, 24 שעות) כדי לאפשר חשיפה אנטי-מיקרוביאלית.

שלב 3: סוניקציה עם UIP400MTP Sonicator בעל 96 בארות

שלב הסוניקציה הוא קריטי לניתוק ביופילמים ממכסי היתדות כדי להעריך את הכדאיות. בצע את השלבים הבאים עבור הסוניקטור UIP400MTP:

1. הכן את ההגדרה:
   מלאו צלחת טרייה בת 96 בארות במצע התאוששות (למשל, ציר מנטרל או מדיום גידול טרי) בכל באר.
2. העבר את מכסה היתד:
   הסירו את מכסה היתד מצלחת הטיפול האנטי-מיקרוביאלית.
   שטפו את מכסה היתד במי מלח סטריליים או PBS כדי להסיר שאריות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים.
3. מקמו את הצלחת ואת הסוניקטור:
   חבר את מכסה היתד ללוח אמצעי השחזור.
   הניחו את צלחת השחזור על פלטפורמת הסוניקטור UIP400MTP, וודאו שהלוחית ממורכזת ויציבה.
4. התאמת פרמטרים של סוניקציה:
   הגדר את פרמטרי הסוניק UIP400MTP (ניתן להתאים את ההגדרות לביופילם):
   משרעת: 70–100%.
   זמן סוניקציה: 1-3 דקות (כוונון בהתאם לחוסן הביופילם) במצב מחזור.
5. סונייט:
   התחל את תהליך הסוניקציה. הרטט העל-קולי יעקור את הביופילמים ממשטחי היתדות אל מדיום ההתאוששות.
6. עקוב אחר התהליך:
   השתמש בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לפקח על טמפרטורת הדגימה בבארות. ניתן לחבר את UIP400MTP לצ'ילר מעבדה לקירור.
7. טיפול לאחר סוניקציה:
   העבירו מיד את מדיום השחזור (המכיל כעת ביופילמים מנותקים) לצלחת סטרילית טרייה לניתוח במורד הזרם.

(A) צלחת המכילה TSB עם 2% גלוקוז המשמש ליצירת ביופילם, שחזור תאים, וכן
קביעת MIC ו- MBCB; (B) מכסה עם סיכות ליצירת ביופילמים סטפילוקוקליים. קביעת MIC ו- MBCB; (B) מכסה עם סיכות ליצירת ביופילמים סטפילוקוקליים.
תאי הביופילם שנוצרו על הסיכות נעקרו על ידי סוניקציה (Hielscher Ultrasound Technology) למשך 5 דקות בצלחות בנות 96 בארות שהכילו מדיום תרבית טרי להתאוששות התאים.
(תמונה ומחקר: ©de Oliveira et al., 2016)

שלב 4: הערכת כדאיות

ביופילמים מנותקי צלחת ותרבות:

1. בצע דילול סדרתי של מדיום השחזור וצלחת על אגר כדי למנות יחידות יוצרות מושבה (CFU).
   לחלופין, השתמש בבדיקת כדאיות קולורימטרית או פלואורסצנטית.
2. תוצאות שיא:
   קבע את MBEC כריכוז הנמוך ביותר של אנטי-מיקרוביאלית שחיסל את יכולת הקיום של ביופילם הניתן לזיהוי.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי הסוניקטורים של Hielscher.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.

קרא כאן כיצד UIP400MTP משמש לניתוק ביופילם כשלב הכנת דגימה במהלך פרוטוקול ASTM E2799 לבדיקת יעילות חיטוי נגד ביופילם Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת MBEC.