פרוטוקול בדיקת MBEC באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות של 96 באריות UIP400MTP

בדיקת MBEC משמשת לקביעת ריכוז החומרים האנטימיקרוביאליים הדרוש לסילוק ביופילמים שנוצרו על מכסים בעלי פינים. כדי להעריך את חיות הביופילמים, יש לנתק אותם תחילה מהמכסים בעלי הפינים של פלטה בת 96 באריות. סוניקציה היא השיטה האמינה והיעילה ביותר לניתוק זה. מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP תוכנן במיוחד לעיבוד פלטות בדיקה ביעילות ובנוחות מרביות, תוך ייעול והאצה של בדיקות MBEC בתפוקה גבוהה.

סוניקציה לניתוק ביופילמים

סוניקציה היא שלב חיוני בבדיקות הריכוז המזערי להכחדת ביופילם (MBEC), המאפשר ניתוק יעיל של תאי הביופילם מהמשטח שאליו הם צמודים. ביופילמים הם מטבעם קהילות מאורגנות של מיקרואורגניזמים העטופות במטריצה חוץ־תאית, המקנה להם עמידות גבוהה משמעותית לחומרים אנטימיקרוביאליים בהשוואה לתאים פלנקטוניים. במהלך בדיקות MBEC, הסוניקציה משתמשת בגלים אולטרסוניים ליצירת קוויטציה מבוקרת, המפרקת את מטריצת הביופילם ומשחררת את התאים המשוקעים בה לתרחיף. שלב זה מבטיח פיזור אחיד של תאי הביופילם במצע ההתאוששות, ומאפשר הערכות מדויקות של חיות התאים באמצעות זריעה על מצע, מיהול או שיטות ספקטרופוטומטריות. ללא ניתוק נאות של הביופילם, רכיבים שיוריים של המטריצה עלולים להגן על התאים ולהוביל להערכת חסר של היעילות האנטימיקרוביאלית. לכן, סוניקציה חיונית לקבלת ערכי MBEC אמינים והדירים, המשקפים את פוטנציאל ההכחדה האמיתי של החומרים הנבדקים. מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP מאפשר הכנת דגימות בקלות ובתפוקה גבוהה בפלטות בדיקה.

פרוטוקול בדיקת הריכוז המזערי להכחדת ביופילם (MBEC)

שלב 1: יצירת ביופילם

1. הכינו את תרחיף החיידקים:
   גדלו חיידקים במצעי גידול מתאימים עד לשלב הגידול הלוגריתמי.
   מהלו את תרבית החיידקים לצפיפות אופטית מוגדרת (למשל, OD600 ~0.1).
2. זרעו את הפלטה בת 96 הבאריות:
   הוסיפו את תרחיף החיידקים (למשל, 150–200 µL) לכל בארית בפלטת מיקרוטיטר תקנית בת 96 באריות.
3. חברו את המכסה בעל הפינים:
   הניחו את המכסה בעל הפינים על הפלטה שנזרעה כדי לאפשר יצירת ביופילם על פני הפינים.
4. הדגירו את הפלטה:
   הדגירו את המערכת בטמפרטורה מתאימה (למשל, 37°C) למשך 24–48 שעות ללא טלטול כדי לעודד את צמיחת הביופילם.

שלב 2: טיפול בחומרים אנטימיקרוביאליים

• הכינו תמיסות אנטימיקרוביאליות:
  הכינו סדרת ריכוזים של חומרים אנטימיקרוביאליים במצעי גידול טריים.
  חשפו את הביופילמים לחומרים האנטימיקרוביאליים:
  הסירו את המכסה בעל הפינים מתרבית החיידקים ושטפו אותו בתמיסת מלח סטרילית או ב־PBS כדי להסיר תאים פלנקטוניים.
  הניחו את המכסה בעל הפינים בפלטה חדשה בת 96 באריות המכילה את התמיסות האנטימיקרוביאליות.
• הדגירו את הפלטה:
  הדגירו למשך פרק זמן מוגדר (למשל, 24 שעות) כדי לאפשר חשיפה לחומרים האנטימיקרוביאליים.

שלב 3: סוניקציה באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות של 96 באריות UIP400MTP

שלב הסוניקציה קריטי לניתוק הביופילמים מהמכסים בעלי הפינים לצורך הערכת חיותם. בצעו את השלבים הבאים עבור מכשיר הסוניקציה UIP400MTP:

1. הכינו את המערכת:
   מלאו כל בארית בפלטה חדשה בת 96 באריות במצע התאוששות (למשל, מרק מנטרל או מצע גידול טרי).
2. העבירו את המכסה בעל הפינים:
   הסירו את המכסה בעל הפינים מפלטת הטיפול האנטימיקרוביאלי.
   שטפו את המכסה בעל הפינים בתמיסת מלח סטרילית או ב־PBS כדי להסיר שאריות של חומרים אנטימיקרוביאליים.
3. מקמו את הפלטה ואת מכשיר הסוניקציה:
   חברו את המכסה בעל הפינים לפלטה המכילה את מצע ההתאוששות.
   הניחו את פלטת מצע ההתאוששות על משטח מכשיר הסוניקציה UIP400MTP, וודאו שהפלטה ממורכזת ויציבה.
4. התאימו את פרמטרי הסוניקציה:
   הגדירו את פרמטרי הסוניקציה ב־UIP400MTP (ניתן להתאים את ההגדרות לביופילם):
   משרעת: 70–100%.
   משך הסוניקציה: 1–3 דקות (התאימו בהתאם לעמידות הביופילם) במצב מחזורי.
5. בצעו סוניקציה:
   התחילו את תהליך הסוניקציה. התנודות האולטרסוניות ינתקו את הביופילמים מפני הפינים אל מצע ההתאוששות.
6. נטרו את התהליך:
   השתמשו בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לנטר את טמפרטורת הדגימות בבאריות. ניתן לחבר את UIP400MTP לצ'ילר מעבדתי לצורך קירור.
7. טיפול לאחר הסוניקציה:
   העבירו מיד את מצע ההתאוששות (המכיל כעת ביופילמים שנותקו) לפלטה סטרילית חדשה לצורך אנליזות המשך.

(A) פלטה המכילה TSB עם 2% גלוקוז, ששימשה ליצירת ביופילם, להתאוששות התאים ולצורך
קביעת MIC ו־MBCB; (B) מכסה בעל פינים ליצירת ביופילמים של סטפילוקוקים. קביעת MIC ו־MBCB; (B) מכסה בעל פינים ליצירת ביופילמים של סטפילוקוקים.
תאי הביופילם שנוצרו על הפינים נותקו באמצעות סוניקציה (Hielscher Ultrasound Technology) למשך 5 min בפלטות של 96 באריות המכילות מצע תרבית טרי להתאוששות התאים.
(תמונה ומחקר: ©de Oliveira et al., 2016)

שלב 4: הערכת חיות

זרעו וגדלו את הביופילמים שנותקו:

1. בצעו מיהולים סדרתיים של מצע ההתאוששות וזרעו על אגר כדי לספור יחידות יוצרות מושבה (CFU).
   לחלופין, השתמשו בבדיקת חיות קולורימטרית או מבוססת פלואורסצנציה.
2. תעדו את התוצאות:
   קבעו את ערך ה־MBEC כריכוז הנמוך ביותר של החומר האנטימיקרוביאלי שהכחיד את חיות הביופילם הניתנת לזיהוי.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

מכשירי האולטרסאונד של Hielscher ידועים בסטנדרטים הגבוהים ביותר של איכות ותכנון. עמידות וקלות תפעול מאפשרות שילוב חלק של מכשירי האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. מכשירי הסוניקציה של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירי אולטרסאונד בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מתקדמת ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, מכשירי האולטרסאונד של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו־RoHs.

קראו כאן כיצד משתמשים ב־UIP400MTP לניתוק ביופילם כשלב בהכנת דגימות במסגרת פרוטוקול ASTM E2799 לבדיקת יעילותם של חומרי חיטוי נגד ביופילם של Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת MBEC.