פרוטוקול למבחן ריכוז מעכב מינימלי (MIC)

מבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC) המבוסס על ביופילם הוא שיטה חיונית להערכת יעילותם של חומרים אנטימיקרוביאליים נגד מיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם, המפגינים עמידות מוגברת בשל המטריצה החוץ-תאית המגינה עליהם. שלב מכריע במבחן זה הוא ניתוק מבני הביופילם לשחרור תאים המשוקעים בהם, לצורך הערכה מדויקת של חיות התאים. מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מקל על תהליך זה באמצעות שימוש באולטרסאונד ממוקד ליצירת קוויטציה מבוקרת, המנתקת ביעילות תאי ביופילם ומפזרת אותם בתרחיף אחיד. פירוק מדויק והדיר זה של הביופילם משפר את המהימנות ואת התפוקה של מבחני MIC, והופך את UIP400MTP לכלי חיוני לקידום חקר הביופילם.

מדוע כדאי להשתמש בסוניקציה במהלך מבחני MIC?

• נתונים מדויקים והדירים: קבלו תרחיפי תאים אחידים המבטלים את ההגנה שמספקת המטריצה, וכך מבטיחים שספירות המושבות וקריאות הצפיפות האופטית שלכם ישקפו נאמנה את היעילות האנטימיקרוביאלית.
• יעילות בתפוקה גבוהה: עבדו צלחת שלמה בת 96 באריות בו-זמנית בתוך 1–3 דקות בלבד, והחליפו גירוד ידני איטי ולא עקבי בתהליך עבודה יעיל.
• שמירה על חיות התאים: נתקו בעדינות תאים המשוקעים בביופילם ללא הנזק הפיזי הנגרם מגירוד, תוך שמירה על שיעורי הישרדות גבוהים יותר לצורך חישובי MIC/MBEC מהימנים.
• אפס סיכון לזיהום צולב: הפיקו תועלת מתכנון ללא מגע המבוסס על קרן אולטרסונית בצורת כוס, המטפל בכל הבאריות באופן אחיד ללא מגע של גשושיות בדגימות או בבאריות בודדות.
• התאמה לדרישות תקנים: התאימו את המתודולוגיה שלכם לפרוטוקולים מתוקפים הנהוגים בתעשייה, כגון ASTM E2799-22, והקנו לנתונים שלכם אמינות רבה יותר לצורכי רגולציה או פרסום.
• סקר תרופות וטיפולים בביטחון: הסתמכו על תוצאות הרגישות שלכם כדי לקבל החלטות מושכלות יותר בנוגע ליעילות אנטימיקרוביאלית, לאפיון פרופיל עמידות או לפיתוח טיפולים.

סוניקציה לניתוק ביופילם

מבחן MIC המבוסס על ביופילם מודד בדרך כלל חיות חיידקים או עיכוב גדילה באמצעות שיטות כגון זריעה על צלחות, ספירת מושבות או מדידות צפיפות אופטית. סוניקציה היא שלב מכריע במבחני MIC המבוססים על ביופילם בעת הערכת הרגישות של מיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם לחומרים אנטימיקרוביאליים. תפקידה העיקרי הוא לנתק תאים המשוקעים במטריצת הביופילם ולפזר אותם בתרחיף אחיד לצורך אנליזה מדויקת.
ביופילמים עמידים במידה ניכרת יותר לחומרים אנטימיקרוביאליים בהשוואה לתאים פלנקטוניים, ולכן ניתוק נאות חיוני לאנליזה מדויקת. במהלך תהליך זה, גלים אולטרסוניים יוצרים קוויטציה מבוקרת, המפרקת את מטריצת הביופילם ומשחררת תאים המשוקעים בה לתרחיף אחיד בתוך מצע ההתאוששות. שלב זה מאפשר הערכות מדויקות של חיות התאים שפוזרו מתוך הביופילם באמצעות שיטות כגון זריעה על צלחות, מיהול וספירת מושבות. פירוק נאות של ביופילם באמצעות סוניקציה מונע משאריות רכיבי המטריצה להגן על התאים, הגנה שעלולה אחרת להוביל להערכת חסר של הפעילות האנטימיקרוביאלית. מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מתאים במיוחד למטרה זו, ומציע תנאי סוניקציה מדויקים והדירים כדי להבטיח הכנה מהימנה ובתפוקה גבוהה של צלחות מבחן.

מדוע סוניקציה נחוצה במבחני ריכוז מעכב מינימלי המבוססים על ביופילם

למדידות חיות ולספירת תאים נדרשים ניתוק ופיזור מלאים ומהימנים של תאים בודדים. UIP400MTP מסייע לניתוק אחיד של ביופילם ולפיזור אחיד של תאים ללא פגיעה בהם, לקבלת תוצאות מבחן אמינות.

• מורכבות הביופילם: ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מאורגנות העטופות במטריצה של חומר פולימרי חוץ-תאי (EPS), המגינה על המיקרואורגניזמים ומגבירה את עמידותם לחומרים אנטימיקרוביאליים.
• פיזור אחיד: כדי למדוד במדויק את חיותם של תאים המשוקעים בביופילם או את רגישותם לחומרים אנטימיקרוביאליים, יש תחילה לנתק את הביופילם ולפרקו לתרחיף הומוגני.

פרוטוקול לבדיקת ריכוז מעכב מזערי המבוססת על ביופילם

בדיקת הריכוז המעכב המזערי (MIC) קובעת את הריכוז הנמוך ביותר של חומר אנטימיקרוביאלי הנדרש לעיכוב צמיחה נראית לעין של מיקרואורגניזמים. פרוטוקול זה מיועד למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם, תוך שימוש במכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP לפירוק הביופילם.

שלב 1: הכנת מזרע החיידקים

1. הכינו את תרחיף החיידקים:
   גדלו חיידקים במצעי גידול מתאימים עד לאמצע שלב הגידול הלוגריתמי.
   דללו את התרבית להשגת צפיפות תאים מתוקננת (למשל, תקן 0.5 McFarland או OD600 ~0.1).
2. הכינו תמיסות אנטימיקרוביאליות:
   דללו את החומר האנטימיקרוביאלי במצע מתאים ליצירת טווח ריכוזים (למשל, דילולים סדרתיים פי שניים).
3. חלקו לצלחת בעלת 96 באריות:
   הוסיפו את התמיסות האנטימיקרוביאליות לבאריות של צלחת סטנדרטית בעלת 96 באריות, לנפח סופי של ~150–200 µL בכל בארית.
   כללו בקרות צמיחה (ללא חומר אנטימיקרוביאלי) ובקרות סטריליות (ללא מזרע חיידקים).

שלב 2: היווצרות ביופילם על מכסה עם פינים

• חברו את המכסה עם הפינים:
  הניחו את המכסה הייעודי עם הפינים על הבאריות שנזרעו, תוך הקפדה שהפינים יהיו שקועים במלואם בתרחיף החיידקים.
• הדגירו את הצלחת:
  הדגירו בטמפרטורה המתאימה (למשל, 37°C) למשך זמן מוגדר (למשל, 24 שעות) בתנאים סטטיים כדי לאפשר היווצרות ביופילם על הפינים.

שלב 3: חשיפה לחומרים אנטימיקרוביאליים

• שטפו את הפינים:
  הסירו את המכסה עם הפינים מתרחיף החיידקים ושטפו בעדינות בתמיסת מלח סטרילית או ב-PBS להסרת תאים פלנקטוניים המחוברים באופן רופף.
• חשפו לחומרים אנטימיקרוביאליים:
  העבירו את המכסה עם הפינים לצלחת חדשה בעלת 96 באריות המכילה את הדילולים האנטימיקרוביאליים שהוכנו קודם לכן.
  הדגירו למשך פרק זמן מוגדר (למשל, 24 שעות) בתנאים סטטיים כדי לאפשר לחומר האנטימיקרוביאלי לפעול על הביופילמים.

שלב 4: סוניקציה באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP

שלב הסוניקציה חיוני לניתוק ביופילמים מהמכסים עם הפינים לצורך הערכת חיות. בצעו את השלבים הבאים עבור מכשיר הסוניקציה UIP400MTP:

1. הכינו את המערך:
   מלאו כל בארית בצלחת חדשה בעלת 96 באריות במצע התאוששות (למשל, מרק מנטרל או מצע גידול סטרילי).
2. העבירו את המכסה עם הפינים:
   הסירו את המכסה עם הפינים מצלחת הטיפול האנטימיקרוביאלי.
   שטפו את המכסה עם הפינים בתמיסת מלח סטרילית או ב-PBS להסרת שאריות של חומרים אנטימיקרוביאליים.
3. מקמו את הצלחת במכשיר הסוניקציה:
   חברו את המכסה עם הפינים לצלחת המכילה את מצע ההתאוששות.
   הניחו את הצלחת המכילה את מצע ההתאוששות במכשיר הסוניקציה UIP400MTP, תוך הקפדה שהצלחת תהיה ממורכזת ויציבה כמתואר במדריך.
4. כוונו את פרמטרי הסוניקציה:
   הגדירו את פרמטרי הסוניקציה ב-UIP400MTP (ניתן להתאים את ההגדרות לביופילם):
   משרעת: 70–100%.
   משך הסוניקציה: 1–3 דקות (התאימו לפי מבנה הביופילם) במצב מחזורי.
5. בצעו סוניקציה:
   התחילו את תהליך הסוניקציה. הגלים האולטרסוניים יפרקו את מטריצת הביופילם וינתקו את התאים אל מצע ההתאוששות.
6. נטרו את התהליך:
   השתמשו בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לנטר את טמפרטורת הדגימות בבאריות. ניתן לחבר את UIP400MTP לצ'ילר מעבדתי לצורך קירור.
7. טיפול לאחר הסוניקציה:
   העבירו מיד את מצע ההתאוששות המכיל את הביופילמים שנותקו לצלחת סטרילית חדשה לצורך ניתוח בהמשך.

(A) צלחת המכילה TSB עם 2% גלוקוז, המשמשת ליצירת ביופילם, להשבת תאים ולקביעת MIC ו-MBEC; (B) מכסה עם פינים ליצירת ביופילמים של סטפילוקוקים.
תאי הביופילם שנוצרו על הפינים נותקו באמצעות סוניקציה (Hielscher Ultrasound Technology) במשך 5 min בצלחות בעלות 96 באריות המכילות מצע תרבית טרי להשבת התאים.
(תמונה ומחקר: ©de Oliveira et al., 2016)

שלב 4: הערכת חיות

זרעו וגדלו בתרבית את הביופילמים שנותקו:

1. בצעו מיהולים סדרתיים של מצע ההשבה וזרעו על אגר לספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU).
2. העריכו את ה-MIC:
   קבעו את ה-MIC כריכוז הנמוך ביותר של החומר האנטימיקרוביאלי המעכב לחלוטין צמיחה מיקרוביאלית נראית לעין במצע ההשבה.

MIC – ריכוז מעכב מזערי: דוגמה לצלחת מיקרוטיטר ולפענוח תוצאות מיקרודילול.
(מחקר ותמונה: ©Jaskiewicz et al. 2019)

מי מפיק תועלת מסוניקציה במהלך בדיקות MIC?

• יצרני מכשור רפואי: לבדיקת יעילותם של ציפויי משטחים ולתיקוף פרוטוקולי ניקוי למכשירים המועדים להיווצרות ביופילם.
• מיקרוביולוגים קליניים: לאבחון מדויק של זיהומים הקשורים לשתלים (כגון PJI) באמצעות השבת חיידקים מרכיבי מכשור רפואי.
• מפתחי תרופות: להערכת יעילותם של חומרים אנטימיקרוביאליים חדשים נגד פתוגנים עמידים המשובצים בביופילם.
• חוקרים באקדמיה: לעריכת מחקרים בתפוקה גבוהה ובעלי הדירות על הביולוגיה של ביופילמים ועל מנגנוני עמידות לחומרים אנטימיקרוביאליים.
• צוותי בקרת איכות בתעשייה: להערכת הצטברות ביולוגית ויעילותם של חומרי חיטוי בסביבות תעשייתיות (למשל, באמצעות תקני ASTM E2799-22).

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מוכרים בזכות תקני האיכות והתכנון הגבוהים ביותר שלהם. עמידות וקלות תפעול מאפשרות שילוב חלק של המכשירים האולטרסוניים שלנו במתקנים תעשייתיים. מכשירי הסוניקציה של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO ושמה דגש מיוחד על מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מהמתקדמות ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו-RoHs.

קראו כאן כיצד משתמשים ב-UIP400MTP לניתוק ביופילם בפרוטוקול ASTM E2799 – בדיקת יעילותם של חומרי חיטוי נגד ביופילם של Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת MBEC.