פרוטוקול בדיקת ריכוז מעכב מינימלי (MIC)

בדיקת ריכוז מעכב מינימלי מבוסס ביופילם (MIC) היא שיטה חיונית להערכת היעילות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים נגד מיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם, אשר מפגינים עמידות מוגברת בשל המטריצה החוץ תאית המגנה עליהם. שלב מכריע בבדיקה זו הוא שיבוש מבני ביופילם לשחרור תאים משובצים להערכת כדאיות מדויקת. הסוניקטור UIP400MTP מקל על תהליך זה על ידי שימוש באולטרסאונד ממוקד ליצירת קוויטציה מבוקרת, ניתוק יעיל של תאי ביופילם ופיזורם לתרחיף אחיד. שיבוש ביופילם מדויק וניתן לשחזור זה משפר את האמינות והתפוקה של מבחני MIC, מה שהופך את UIP400MTP לכלי חיוני בקידום מחקר הביופילם.

סוניקציה לניתוק ביופילם

בדיקת MIC מבוססת ביופילם מודדת בדרך כלל כדאיות חיידקים או עיכוב גדילה באמצעות שיטות כגון ציפוי, ספירת מושבות או מדידות צפיפות אופטית. סוניקציה היא שלב קריטי במבחני MIC מבוססי ביופילם בעת הערכת הרגישות האנטי-מיקרוביאלית של מיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם. תפקידו העיקרי הוא לנתק ולפזר תאים המשובצים במטריצת הביופילם לתרחיף אחיד לצורך ניתוח מדויק.
ביופילמים עמידים באופן משמעותי יותר לחומרים אנטי-מיקרוביאליים בהשוואה לתאים פלנקטוניים, מה שהופך ניתוק נכון לקריטי לניתוח מדויק. במהלך תהליך זה, גלים על-קוליים יוצרים קוויטציה מבוקרת, מפרקים את מטריצת הביופילם ומשחררים תאים משובצים לתרחיף אחיד בתוך מדיום ההתאוששות. שלב זה מאפשר הערכות כדאיות מדויקות של תאים מפוזרים ביופילם באמצעות שיטות כגון ציפוי, דילול וספירת מושבות. הפרעה נכונה של ביופילם באמצעות סוניקציה מונעת מרכיבי מטריצה שיורית להגן על תאים, מה שעלול להוביל להערכת חסר של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית. UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות מתאים במיוחד למטרה זו, ומציע תנאי סוניקציה מדויקים וניתנים לשחזור כדי להבטיח הכנה אמינה ובעלת תפוקה גבוהה של לוחות מבחן.

מדוע סוניקציה נחוצה בבדיקות ריכוז מעכב מינימלי מבוססות ביופילם

לצורך מדידות כדאיות וספירת תאים, נדרש ניתוק ופיזור מלא ואמין של תאים בודדים. UIP400MTP מקדם היפרדות ביופילם אחידה שאינה מזיקה ופיזור תאים לקבלת תוצאות בדיקה חזקות.

• מורכבות ביופילם: ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מובנות העטופות במטריצת חומר פולימרי חוץ-תאי (EPS), המגנה על המיקרואורגניזמים והופכת אותם לעמידים יותר בפני חומרים אנטי-מיקרוביאליים.
• פיזור אחיד: כדי למדוד במדויק את הכדאיות של תאים המשובצים בביופילם או את רגישותם לחומרים אנטי-מיקרוביאליים, תחילה יש לעקור את הביופילם ולפרק אותו לתרחיף הומוגני.

פרוטוקול בדיקת ריכוז מעכב מינימלי מבוסס ביופילם

בדיקת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) קובעת את הריכוז הנמוך ביותר של חומר אנטי-מיקרוביאלי הדרוש כדי לעכב את הצמיחה הנראית לעין של מיקרואורגניזמים. פרוטוקול זה מיועד למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילם, תוך שימוש בסוניקטור לוחות רב-באר UIP400MTP לשיבוש ביופילם.

שלב 1: הכנת חיסון חיידקי

1. הכינו את התרחיף החיידקי:
   לגדל חיידקים במדיה המתאימה לשלב הלוגריתמי האמצעי.
   לדלל את התרבית כדי להשיג צפיפות תאים מתוקננת (למשל, 0.5 תקן McFarland או OD600 ~ 0.1).
2. הכינו תמיסות אנטי-מיקרוביאליות:
   לדלל את החומר האנטי-מיקרוביאלי בתווך מתאים כדי ליצור טווח ריכוזים (למשל, דילול טורי כפול).
3. מחלקים לצלחת 96well:
   הוסף את התמיסות האנטי-מיקרוביאליות לבארות של צלחת סטנדרטית בת 96 בארות, עם נפח באר סופי של ~150-200 μL.
   כלול בקרות גדילה (ללא מיקרוביאלית) ובקרות סטריליות (ללא חיסון חיידקי).

שלב 2: היווצרות ביופילם על מכסה יתד

• חבר את מכסה היתד:
  הניחו את מכסה היתדות המיוחד על הבארות המחוסנות, וודאו שהיתדות שקועות במלואן בתרחיף החיידקי.
• לדגור על הצלחת:
  יש לדגור בטמפרטורה המתאימה (למשל, 37°C) למשך זמן מוגדר (למשל, 24 שעות) בתנאים סטטיים כדי לאפשר היווצרות ביופילם על היתדות.

שלב 3: חשיפה מיקרוביאלית

• שוטפים את היתדות:
  הסירו את מכסה היתד מהתרחיף החיידקי ושטפו בעדינות במי מלח סטריליים או PBS כדי להסיר תאים פלנקטוניים המחוברים באופן רופף.
• חשיפה לחומרים אנטי-מיקרוביאליים:
  מעבירים את מכסה היתד לצלחת חדשה של 96 באר המכילה את הדילולים האנטי-מיקרוביאליים שהוכנו קודם לכן.
  יש לדגור למשך פרק זמן מוגדר (למשל, 24 שעות) בתנאים סטטיים כדי לאפשר לחומר האנטי-מיקרוביאלי לפעול על הביופילמים.

שלב 4: סוניקציה עם Microplate Sonicator UIP400MTP

שלב הסוניקציה הוא קריטי לניתוק ביופילמים ממכסי היתדות כדי להעריך את הכדאיות. בצע את השלבים הבאים עבור הסוניקטור UIP400MTP:

1. הכן את ההגדרה:
   ממלאים צלחת טרייה בת 96 בארות במצע התאוששות (למשל, ציר מנטרל או מדיום גידול סטרילי) בכל באר.
2. העבר את מכסה היתד:
   הסירו את מכסה היתד מצלחת הטיפול האנטי-מיקרוביאלית.
   שטפו את מכסה היתד במי מלח סטריליים או PBS כדי להסיר שאריות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים.
3. מקם את הצלחת בסוניקטור:
   חבר את מכסה היתד ללוח אמצעי השחזור.
   הניחו את לוחית השחזור בתוך הסוניקטור UIP400MTP, וודאו שהצלחת יושבת ממורכזת ויציבה כמו במדריך המתואר.
4. התאמת פרמטרים של סוניקציה:
   הגדר את פרמטרי הסוניקציה UIP400MTP (ההגדרות עשויות להיות מותאמות לביופילם):
   משרעת: 70–100%.
   זמן סוניקציה: 1-3 דקות (התאמה בהתאם למבנה הביופילם) במצב מחזור.
5. סונייט:
   התחל את תהליך הסוניקציה. הגלים העל-קוליים ישבשו את מטריצת הביופילם ויעקרו את התאים למדיום ההתאוששות.
6. עקוב אחר התהליך:
   השתמש בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לפקח על טמפרטורת הדגימה בבארות. ניתן לחבר את UIP400MTP לצ'ילר מעבדה לקירור.
7. טיפול לאחר סוניקציה:
   העבר מיד את מדיום השחזור המכיל ביופילמים מנותקים לצלחת סטרילית טרייה לניתוח הבא.

(A) צלחת המכילה TSB עם 2% גלוקוז המשמש ליצירת ביופילם, שחזור תאים וקביעת MIC ו-MBEC; (B) מכסה עם סיכות ליצירת ביופילמים סטפילוקוקליים.
תאי הביופילם שנוצרו על הסיכות נעקרו על ידי סוניקציה (Hielscher Ultrasound Technology) למשך 5 דקות בצלחות בנות 96 בארות שהכילו מדיום תרבית טרי להתאוששות התאים.
(תמונה ומחקר: ©de Oliveira et al., 2016)

שלב 4: הערכת כדאיות

ביופילמים מנותקי צלחת ותרבות:

1. בצע דילול סדרתי של מדיום השחזור וצלחת על אגר כדי למנות יחידות יוצרות מושבה (CFU).
2. הערכת MIC:
   קבע את המיקרופון כריכוז האנטי-מיקרוביאלי הנמוך ביותר המעכב לחלוטין צמיחה מיקרוביאלית נראית לעין במדיום ההתאוששות.

MIC ריכוז מעכב מינימלי: דוגמה של צלחת microtiter ופרשנות של תוצאות microdilution.
(מחקר ותמונה: ©Jaskiewicz et al. 2019)

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי הסוניקטורים של Hielscher.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.

קרא כאן כיצד UIP400MTP משמש לניתוק ביופילם בפרוטוקול ASTM E2799 – בדיקת יעילות חומר חיטוי נגד ביופילם Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת MBAC.