અલ્ટ્રાસોનિક્સનો ઉપયોગ કરીને છોડના કોષોમાં આનુવંશિક પરિવર્તન

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) એ એગ્રોબેક્ટેરિયમનો ટ્રાન્સપોર્ટર તરીકે ઉપયોગ કરીને છોડના કોષોને વિદેશી જનીનોથી સંક્રમિત કરવાની એક કાર્યક્ષમ પદ્ધતિ છે. અલ્ટ્રાસોનિક પોલાણ સોનોપોરેશનનું કારણ બને છે, જેને છોડની પેશીઓના લક્ષિત માઇક્રો-વાઉન્ડિંગ તરીકે વર્ણવી શકાય છે. આ અલ્ટ્રાસોનિકલી માઇક્રો-વાઉન્ડ્સ બનાવે છે, ડીએનએ અને ડીએનએ વેક્ટર્સને સેલ મેટ્રિક્સમાં અસરકારક રીતે પરિવહન કરી શકાય છે.

સોનોપોરેશન – અલ્ટ્રાસોનિકલી ઉન્નત સેલ ટ્રાન્સફોર્મેશન

જ્યારે ઓછી-આવર્તન અલ્ટ્રાસાઉન્ડ (આશરે 20kHz) સેલ સસ્પેન્શન પર લાગુ થાય છે, ત્યારે એકોસ્ટિક પોલાણની અસરો કોષની પેશીઓ પર ક્ષણિક પટલ અભેદ્યકરણનું કારણ બને છે. આ અલ્ટ્રાસોનિક અસરને સોનોપોરેશન તરીકે ઓળખવામાં આવે છે અને તેનો ઉપયોગ કોષો અથવા પેશીઓમાં જનીન ટ્રાન્સફર માટે થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિકેશનના ફાયદા તેના નોન-થર્મલ મેકેનિકલ કામના સિદ્ધાંત પર આધારિત છે, જે સોનિકેશનને ઘણી વખત વધુ સર્વતોમુખી બનાવે છે અને સેલ પ્રકારો પર ઓછું નિર્ભર કરે છે. સોનોપોરેશનનો સર્વતોમુખી ઉપયોગ ટ્રાન્સજેનિક છોડના ઉપયોગની શક્યતા ખોલે છે, જે જટિલ માનવ ઉપચારાત્મક પ્રોટીનના જૈવઉત્પાદનમાં નોંધપાત્ર ક્ષમતા ધરાવે છે. આવા છોડ આધારિત બાયોરિએક્ટર સરળતાથી આનુવંશિક રીતે ચાલાકી કરી શકે છે, માનવ રોગાણુઓ સાથે સંભવિત દૂષણને અટકાવે છે, પરિવર્તન મધ્યસ્થી બેક્ટેરિયા (દા.ત. એગ્રોબેક્ટેરિયમ) ને નુકસાન કરતા નથી અને જૈવ-સંશ્લેષણની સસ્તી, અસરકારક પદ્ધતિ છે.

અલ્ટ્રાસોનિક-આસિસ્ટેડ સેલ ટ્રાન્સફોર્મેશન

સોનિકેશન એ એવી તકનીક છે જે સોલ્યુશનમાં કણોને ઉશ્કેરવા, ઉકેલો મિશ્રિત કરવા માટે ઓછી-આવર્તન અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગો લાગુ કરે છે, જેનાથી સામૂહિક સ્થાનાંતરણ અને વિસર્જનનો દર વધે છે. સાથોસાથ, સોનિકેશન પ્રવાહીમાંથી ઓગળેલા વાયુઓને દૂર કરી શકે છે. પ્લાન્ટ-ટ્રાન્સફોર્મેશનમાં, સોનિકેશન છોડની પેશીઓ પર માઇક્રોવાઉન્ડ્સનું નિર્માણ કરશે અને છોડના પ્રોટોપ્લાસ્ટમાં નગ્ન ડીએનએની ડિલિવરી વધારશે.

આનુવંશિક પરિવર્તન માટે, સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) એ પસંદગીની પદ્ધતિ છે અને નગ્ન DNA અને DNA વેક્ટર્સને સીધા પ્રોટોપ્લાસ્ટમાં સ્થાનાંતરિત કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સોનિકેશન કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ કાર્યક્ષમતા ધરાવે છે. અસંખ્ય અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે સોનિકેશન આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) નો ઉપયોગ અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગો અને પરિણામી એકોસ્ટિક પોલાણ દ્વારા છોડના કોષો પર યાંત્રિક વિક્ષેપ અને ઘાવની રચનાને પ્રેરિત કરવા માટે થઈ શકે છે. ટૂંકી અલ્ટ્રાસોનિક સારવાર એક્સ્પ્લાન્ટની સપાટી પર સૂક્ષ્મ ઘા બનાવે છે. કારણ કે ઘાયલ કોષો એગ્રોબેક્ટેરિયમને છોડની પેશીઓના ઊંડા ભાગમાં પ્રવેશવાની મંજૂરી આપશે, આમ છોડના કોષોને ચેપ લાગવાની શક્યતા વધી જશે. વધુમાં, સ્ત્રાવિત ફિનોલિક સંયોજનો પરિવર્તનને વધારે છે. અલ્ટ્રાસોનિકલી જનરેટેડ માઇક્રો-વાઉન્ડ્સ બેક્ટેરિયા દ્વારા સ્પષ્ટ પ્રવેશને પણ વધુ શક્ય બનાવે છે. ખાસ કરીને એગ્રોબેક્ટેરિયમ સામે પ્રતિરોધક ગણાતી છોડની પ્રજાતિઓમાં આનુવંશિક પરિવર્તન માટે SAATનો સફળતાપૂર્વક ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
ખૂબ જ સરળ અને સસ્તી પદ્ધતિ હોવાને કારણે, તેમજ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મધ્યસ્થી જીન ટ્રાન્સફરમાં નોંધપાત્ર વધારો એ SAAT ના મુખ્ય ફાયદા છે. ચેનોપોડિયમ રુબ્રમ એલ. અને બીટા વલ્ગારિસ એલ.ના રૂપાંતરણમાં SAATના સફળ ઉપયોગ ઉપરાંત, આ અભિગમ નિકોટિયાના ટેબેકમમાં રિકોમ્બિનન્ટ એસ્ચેરીચિયા કોલી વાઇલ્ડ-ટાઇપ હીટ-લેબિલ હોલોટોક્સિન અને એસ્ચેરીચિયા કોલી મ્યુટન્ટ એલટી રસી સહાયકના ઉત્પાદનમાં પણ લાગુ કરવામાં આવ્યો છે. , જેમાં પક્ષીઓમાં સૌથી વધુ પ્રણાલીગત LT-B-વિશિષ્ટ IgG ટાઇટર્સ મળી આવ્યા હતા.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

છોડના કોષોમાં સોનોપોરેશન દ્વારા જીન ટ્રાન્સફર માટેની સામાન્ય પ્રક્રિયા

1. આનુવંશિક સામગ્રીની તૈયારી: તમે છોડના કોષોમાં દાખલ કરવા માંગો છો તે આનુવંશિક સામગ્રી તૈયાર કરીને પ્રારંભ કરો. આ પ્લાઝમિડ ડીએનએ, આરએનએ અથવા અન્ય ન્યુક્લિક એસિડ હોઈ શકે છે.
2. પ્લાન્ટ સેલ આઇસોલેશન: તમે લક્ષ્ય બનાવવા માંગો છો તે છોડના કોષોને અલગ કરો. તમારા પ્રયોગના આધારે, આ કોષો છોડની પેશીઓ અથવા સંસ્કૃતિઓથી અલગ થઈ શકે છે.
3. સેલ સસ્પેન્શન: છોડના કોષોને યોગ્ય માધ્યમ અથવા બફરમાં સ્થગિત કરો. આ સુનિશ્ચિત કરવા માટે જરૂરી છે કે કોષો સ્વસ્થ છે અને જનીન લેવા માટે અનુકૂળ સ્થિતિમાં છે.
4. તમારા Sonicator સેટઅપ કરો: કંપનવિસ્તાર, સમય, ઉર્જા અને તાપમાન જેવા સોનિકેશન પ્રી-સેટિંગ પરિમાણો દ્વારા તમારા પ્રોબ-ટાઈપ સોનિકેટરને તૈયાર કરો. સેલ સસ્પેન્શનમાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબને નિમજ્જન કરો.
5. સોનિકેશન: sonication પ્રક્રિયા શરૂ કરો. પ્રોબ ટીપનું ઝડપી ઓસિલેશન પ્રવાહીમાં પોલાણ પરપોટા પેદા કરે છે. આ પરપોટા અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોને કારણે વિસ્તરે છે અને તૂટી જાય છે, સસ્પેન્શનમાં યાંત્રિક દળો અને માઇક્રોસ્ટ્રીમિંગ બનાવે છે.
6. સોનોપોરેશન: પોલાણ દ્વારા પેદા થતી યાંત્રિક શક્તિઓ અને માઇક્રોસ્ટ્રીમિંગ છોડના કોષોના પટલમાં અસ્થાયી રૂપે છિદ્રો અને છિદ્રો બનાવે છે. સસ્પેન્શનમાં હાજર આનુવંશિક સામગ્રી આ છિદ્રો દ્વારા છોડના કોષોમાં પ્રવેશી શકે છે.
7. ઇન્ક્યુબેશન: સોનોપોરેશન ટ્રીટમેન્ટ પછી, છોડના કોષોને પુનઃપ્રાપ્ત કરવા અને તેમના પટલને સ્થિર કરવા માટે તેમને ઉકાળો. કોષના અસ્તિત્વ અને સફળ જીન ટ્રાન્સફરની ખાતરી કરવા માટે આ એક નિર્ણાયક પગલું છે.

એગ્રોબેક્ટેરિયમ અથવા લિપોસોમ્સ દ્વારા જીન ટ્રાન્સફર

છોડના કોષને સ્થાનાંતરિત કરવાના બે સામાન્ય સ્વરૂપો છે. તેઓ કાં તો એગ્રોબેક્ટેરિયમનો ઉપયોગ કરે છે, જે ગ્રામ-નેગેટિવ બેક્ટેરિયાની એક જાતિ છે, અથવા આનુવંશિક સામગ્રીના વાહક તરીકે લિપોસોમ્સનો ઉપયોગ કરે છે.

• એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મધ્યસ્થી સોનોપોરેશન: Agrobacterium tumefaciens એ એક બેક્ટેરિયમ છે જેનો સામાન્ય રીતે પ્લાન્ટ આનુવંશિક ઇજનેરીમાં ઉપયોગ થાય છે. આ પદ્ધતિમાં, ઇચ્છિત જનીન ધરાવતા પ્લાઝમિડ ડીએનએને એગ્રોબેક્ટેરિયમમાં દાખલ કરવામાં આવે છે, જે પછી છોડના કોષો સાથે મિશ્રિત થાય છે. સેલ સસ્પેન્શનને પ્રોબ-ટાઈપ સોનીકેટરનો ઉપયોગ કરીને સોનોપોરેશનને આધિન કરવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા એગ્રોબેક્ટેરિયમમાંથી છોડના કોષોમાં આનુવંશિક સામગ્રીના ટ્રાન્સફરને વધારે છે. છોડના આનુવંશિક ફેરફાર માટે આ પદ્ધતિનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.
• લિપોસોમ-મધ્યસ્થી સોનોપોરેશન: લિપોસોમ લિપિડ-આધારિત વેસિકલ્સ છે જે આનુવંશિક સામગ્રી વહન કરી શકે છે. આ પદ્ધતિમાં, પ્લાઝમિડ ડીએનએ અથવા અન્ય ન્યુક્લીક એસિડથી ભરેલા લિપોસોમ્સને છોડના કોષો સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવે છે. પ્રોબ-ટાઈપ સોનીકેટરનો ઉપયોગ કરીને સોનોપોરેશનનો ઉપયોગ છોડના કોષો દ્વારા લિપોસોમના શોષણને સરળ બનાવવા માટે કરવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસાઉન્ડ લિપોસોમ્સના લિપિડ બાયલેયર્સને વિક્ષેપિત કરે છે, આનુવંશિક સામગ્રીને છોડના કોષોમાં મુક્ત કરે છે. આ અભિગમ છોડના કોષોમાં ક્ષણિક જનીન અભિવ્યક્તિ અભ્યાસ માટે ઉપયોગી છે.

સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) ના વૈજ્ઞાનિક રીતે સાબિત લાભો

સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) અસંખ્ય છોડની પ્રજાતિઓ પર લાગુ કરવામાં આવ્યું છે. પ્લાન્ટ સેલ કલ્ચરની ટૂંકી અને પ્રમાણમાં હળવી અલ્ટ્રાસોનિક ટ્રીટમેન્ટ સોનોપોરેશનનું કારણ બને છે, જે પાછળથી જનીન ટ્રાન્સપોર્ટર તરીકે એગ્રોબેક્ટેરિયમના ઊંડા પ્રવેશને મંજૂરી આપે છે. નીચે તમે SAAT ની ફાયદાકારક અસરો દર્શાવતા અનુકરણીય અભ્યાસો વાંચી શકો છો.

અશ્વગંધાનું અલ્ટ્રાસોનિકલી-આસિસ્ટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન

W. somnifera (અશ્વગંધા અથવા વિન્ટર ચેરી તરીકે ઓળખાય છે) માં પરિવર્તન કાર્યક્ષમતા સુધારવા માટે, દેહદષ્ટિ અને સહકર્મીઓ (2016) એ એસીટોસીરીંગોન (AS) અને સોનિકેશનના ઉપયોગની તપાસ કરી.
Acetosyringone (AS)ને ત્રણ તબક્કામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું: એગ્રોબેક્ટેરિયમ લિક્વિડ કલ્ચર, એગ્રોબેક્ટેરિયમ ઇન્ફેક્શન અને એગ્રોબેક્ટેરિયમ સાથે એક્સ્પ્લાન્ટ્સની સહ-સંસ્કૃતિ. એગ્રોબેક્ટેરિયમ લિક્વિડ કલ્ચરમાં 75 μM ASનો ઉમેરો વીર જનીનોના ઇન્ડક્શન માટે શ્રેષ્ઠ હોવાનું જણાયું હતું.
સોનિકેશન (SAAT) ની વધારાની એપ્લિકેશન ઉચ્ચતમ જનીન અભિવ્યક્તિમાં પરિણમી. રુવાંટીવાળા મૂળમાં gusA જનીન અભિવ્યક્તિ શ્રેષ્ઠ હોવાનું જણાયું હતું જ્યારે પાંદડા અને અંકુરની ટીપ્સ અનુક્રમે 10 અને 20s માટે સોનિકેટ કરવામાં આવી હતી. સુધારેલ પ્રોટોકોલની રૂપાંતર કાર્યક્ષમતા અનુક્રમે લીફ અને શૂટ ટીપ એક્સ્પ્લાન્ટના કિસ્સામાં 66.5 અને 59.5% નોંધવામાં આવી હતી. અન્ય પ્રોટોકોલ સાથે સરખામણી કરવામાં આવે ત્યારે આ સુધારેલ પ્રોટોકોલની રૂપાંતર કાર્યક્ષમતા પાંદડા માટે 2.5 ગણી વધારે અને શૂટ ટીપ્સ માટે 3.7 ગણી વધુ હોવાનું જણાયું હતું. સધર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણોએ W1-W4 લાઇનમાં gusA ટ્રાન્સજીનની 1-2 નકલોની પુષ્ટિ કરી છે, જ્યારે સુધારેલ પ્રોટોકોલ દ્વારા જનરેટ કરાયેલ W5 લાઇનમાં 1-4 ટ્રાન્સજેન નકલો મળી આવી છે.

ડબ્લ્યુ. સોમ્નિફેરા લીફ (એ) અને શૂટ ટીપ (બી) એક્સ્પ્લેન્ટની ટ્રાન્સફોર્મેશન ફ્રીક્વન્સી પર સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) ના સમયગાળાની અસર
(અભ્યાસ અને ગ્રાફિક: © દેહદષ્ટિ એટ અલ., 2016)

કપાસનું અલ્ટ્રાસોનિકલી-આસિસ્ટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન

હુસૈન એટ અલ. (2007) સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ કોટન ટ્રાન્સફોર્મેશનની ફાયદાકારક અસરો દર્શાવો. ઓછી-આવર્તન અલ્ટ્રાસાઉન્ડને કારણે એકોસ્ટિક પોલાણ છોડની પેશીઓ (સોનોપોરેશન) ની સપાટી પર અને નીચે સૂક્ષ્મ ઘા બનાવે છે અને એગ્રોબેક્ટેરિયમને છોડની પેશીઓમાં ઊંડા અને સંપૂર્ણ રીતે મુસાફરી કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ ઘાવની ફેશન પેશીઓમાં ઊંડા પડેલા છોડના કોષોને ચેપ લગાડવાની સંભાવના વધારે છે. SAAT ની પરિવર્તન કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, GUS જનીન અભિવ્યક્તિ માપવામાં આવી હતી. GUS રિપોર્ટર સિસ્ટમ એ રિપોર્ટર જનીન સિસ્ટમ છે, જે ખાસ કરીને પ્લાન્ટ મોલેક્યુલર બાયોલોજી અને માઇક્રોબાયોલોજીમાં ઉપયોગી છે. વિવિધ SAAT પરિમાણોને સમાયોજિત કરીને, પરિપક્વ એમ્બ્રોયોનો ઉપયોગ કરીને કપાસમાં GUS ક્ષણિક અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે ઉન્નત કરવામાં આવી હતી. એક્સ્પ્લાન્ટના ઇન્ક્યુબેશન પછી 24 કલાકમાં પ્રથમ વખત GUS મળી આવ્યો હતો અને 48 કલાક સુધીમાં, GUS અભિવ્યક્તિ ખૂબ જ તીવ્ર હતી જે સોનિકેશન આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ મિડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT)ને પગલે કપાસના એક્સ્પ્લાન્ટના સફળ પરિવર્તનના ઉપયોગી સૂચક તરીકે સેવા આપી હતી. વિવિધ ટ્રાન્સફોર્મેશન ટેક્નિક (જેમ કે બાયોલિસ્ટિક, એગ્રો, BAAT, SAAT), સોનિકેશન-સહાયિત એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) ની સરખામણીએ રૂપાંતરણના અત્યાર સુધીના શ્રેષ્ઠ પરિણામો દર્શાવ્યા છે.

GUS ના ક્ષણિક અભિવ્યક્તિના આધારે પરિવર્તન પ્રક્રિયાની પસંદગી. સોનિકેશન-આસિસ્ટેડ એગ્રોબેક્ટેરિયમ-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સફોર્મેશન (SAAT) નોંધપાત્ર રીતે ઉચ્ચ ક્ષણિક અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે.
(અભ્યાસ અને ગ્રાફિક: © હુસૈન એટ અલ., 2007)

સોનોપોરેશન અને SAAT માટે ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિક સોલ્યુશન્સ

Hielscher Ultrasonics એ પ્રયોગશાળાઓ, સંશોધન સુવિધાઓ તેમજ ખૂબ ઊંચા થ્રુપુટ સાથે ઔદ્યોગિક ઉત્પાદન માટે ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સના વિકાસ અને ઉત્પાદનમાં લાંબા સમયથી અનુભવી છે. માઇક્રોબાયોલોજી અને જીવન વિજ્ઞાન માટે, Hielscher ચોક્કસ પેશીઓ અને તેમની સારવાર માટે જરૂરી વિવિધ જરૂરિયાતોને સમાવવા માટે વિવિધ ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. અસંખ્ય નમૂનાઓના એક સાથે અલ્ટ્રાસોનિકેશન માટે Hielscher મલ્ટિવેલ પ્લેટ્સ માટે UIP400MTP ઓફર કરે છે, 10 શીશીઓ (દા.ત., એપેન્ડોર્ફ ટ્યુબ) અથવા અલ્ટ્રાસોનિક કપહોર્ન સુધીના સોનિકેશન માટે VialTweeter. પ્રોબ-ટાઈપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ લેબ હોમોજેનાઇઝર્સ તરીકે 50 થી 400 વોટ સુધી ઉપલબ્ધ છે, જ્યારે ઔદ્યોગિક સિસ્ટમ 500 વોટથી 16kW સુધીની પાવર રેન્જને આવરી લે છે.
કૃપા કરીને અમારો સંપર્ક કરો અને અમને તમારી અરજી અને પ્રક્રિયાની જરૂરિયાતો વિશે જણાવો. અમારા અનુભવી સ્ટાફને તમારી જૈવિક પ્રક્રિયા માટે સૌથી યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિકેટરની ભલામણ કરવામાં આનંદ થશે.
નીચે આપેલ કોષ્ટક તમને અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની અંદાજિત પ્રોસેસિંગ ક્ષમતાનો સંકેત આપે છે: