Fragmentation de l’alpha-synucléine avec le sonicateur VialTweeter

Dans la recherche scientifique, les fibrilles et les rubans d’α-synucléine sont fragmentés afin d’obtenir des fragments de fibrilles plus petits, voire des molécules protéiques individuelles, qui peuvent être analysés plus facilement à l’aide de diverses techniques expérimentales. Le sonicateur VialTweeter est l’un des ultrasonicateurs les plus couramment utilisés pour une fragmentation efficace et fiable de l’alpha-synucléine.

L’α-synucléine dans la recherche

Les fibrilles d’alpha-synucléine sont des agrégats protéiques fortement associés à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et certaines formes de démence, dont la démence à corps de Lewy. La recherche consacrée aux fibrilles d’alpha-synucléine vise à comprendre leur rôle dans la progression de la maladie et à développer des interventions thérapeutiques potentielles. En décomposant les fibrilles d’alpha-synucléine en fragments plus petits, les chercheurs peuvent étudier leurs caractéristiques structurelles spécifiques. Par exemple, la fragmentation des fibrilles d’alpha-synucléine permet aux chercheurs d’étudier leurs interactions avec d’autres molécules, telles que des protéines, des lipides ou de petites molécules. En produisant des fragments plus petits, il est possible de sonder plus efficacement les sites de liaison et l’affinité pour ces partenaires d’interaction. Des fibrilles et rubans d’α-Syn plus petits peuvent également présenter une toxicité et des effets biochimiques modifiés. Une technique de fragmentation fiable et efficace, qui produit des résultats reproductibles grâce à un traitement des échantillons rapide et simple, est donc essentielle.
Fragmentation ultrasonore de l’alpha-Syn : Le sonicateur VialTweeter est le système éprouvé de préparation d’échantillons par ultrasons qui traite jusqu’à 10 flacons simultanément dans des conditions strictement identiques. Les réglages programmables permettent de répéter simplement et rapidement les mêmes expériences, ce qui fournit des résultats hautement fiables et reproductibles pour la fragmentation des fibrilles d’alpha-synucléine.

Préparation d’échantillons d’α-synucléine avec un sonicateur

L’une des approches pour étudier les fibrilles d’alpha-synucléine consiste à les extraire et à les fragmenter à l’aide de techniques telles que la sonication. La sonication est un procédé qui utilise des ondes ultrasonores de haute intensité et de basse fréquence pour désagréger et décomposer les agrégats protéiques, ce qui conduit à la libération de fibrilles plus petites ou de molécules protéiques individuelles. Le sonicateur VialTweeter est un appareil couramment utilisé à cette fin dans les études de recherche portant sur l’α-synucléine.

De nombreuses études de recherche décrivent des protocoles précis de préparation d’échantillons pour la sonication de fibrilles d’alpha-synucléine, qui utilisent le VialTweeter de Hielscher pour une fragmentation efficace et fiable des fibrilles d’α-synucléine. En fragmentant les fibrilles par ultrasons, les chercheurs peuvent analyser les produits obtenus et examiner leur structure, leur toxicité et leurs interactions avec d’autres molécules. Ces recherches apportent des éclairages importants sur les mécanismes sous-jacents à la neurodégénérescence et permettent potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les protocoles bien établis de sonication de l’α-synucléine utilisant le sonicateur VialTweeter permettent d’obtenir des résultats fiables et reproductibles.

Images du haut : fibrilles d’alpha-synucléine non fragmentées
Images du bas : fibrilles d’alpha-synucléine fragmentées par ultrasons avec le sonicateur VialTweeter
(étude et images : ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentation ultrasonore des fibrilles d’α-synucléine – protocoles

Comme de nombreux chercheurs utilisent le sonicateur VialTweeter comme technique de fragmentation privilégiée pour produire des fragments uniformes de fibrilles d’α-synucléine, des protocoles éprouvés sont facilement disponibles. Vous trouverez ci-dessous quelques exemples de protocoles de fragmentation.

Préparation des germes ClearTau : Les fibrilles ClearTau ont été diluées à 10 μM dans de l’eau dH2O et soniquées à 70 % d’amplitude pendant 50 s avec un cycle 1 s ON 1 s OFF, en tube, à l’aide du sonicateur UP200St avec VialTweeter. Les germes ont été caractérisés par microscopie électronique.
Mesure de la fluorescence ThS : Les fibrilles ClearTau ont été diluées à 2,5 μM dans de l’eau dH2O et soniquées à 70 % d’amplitude pendant 50 s avec un cycle 1 s ON 1 s OFF, en tube, à l’aide de l’UP200St avec VialTweeter. Du monomère Tau 4R2N pleine longueur à 2,5 μM a été utilisé comme témoin. À la réaction de 100 μl, 100 μl de ThS (10 μM) ont été ajoutés, ce qui a donné des concentrations finales en protéines de 1,25 μM. La fluorescence ThS en un seul point temporel a été mesurée à l’aide de plaques 96 puits à fond transparent placées dans un lecteur de microplaques FLUOstar Omega, avec une excitation à 445 nm et un enregistrement de l’émission à 485 nm.
(cf. Limorenko et al., 2023)

Longueur uniforme de l’α-synucléine grâce à la sonication : L’hétérogénéité de longueur des fibrilles et rubans d’α-syn a été réduite par sonication pendant 20 min sur glace dans des tubes Eppendorf 2-ml placés dans un VialTweeter réglé à 75% d’amplitude, avec des impulsions de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)

Le contrôle qualité de l’a-Syn monomérique recombinante humaine WT ou S129A et des polymorphes fibrillaires qu’elles génèrent, ainsi que celui de l’a-Syn 1–110, a été effectué. Les polymorphes fibrillaires ont ensuite été fragmentés par sonication pendant 20 min dans des tubes Eppendorf 2-mL placés dans l’ultrasonicateur VialTweeter, afin de générer des particules fibrillaires d’une taille moyenne de 42–52 nm adaptées à l’endocytose.
(cf. Shrivastava et al., 2020)

Caractérisation de cinq polymorphes fibrillaires d’α-Syn. (A) Micrographies électroniques en transmission, après coloration négative, des polymorphes fibrillaires d’α-Syn fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 et fibrils-110, avant (rangée du haut) et après fragmentation avec le VialTweeter (rangée du bas). (B) Distribution des longueurs des polymorphes fibrillaires fragmentés. Le nombre (n) d’assemblages fibrillaires à partir desquels les histogrammes ont été établis est indiqué.
(étude et images : Shrivastava et al., 2020)

Les fibrilles d’α-Syn ont été fragmentées par sonication pendant 20 min dans des tubes Eppendorf de 2 ml placés dans un VialTweeter, afin de générer des particules fibrillaires d’une taille moyenne de 42–52 nm, telle qu’évaluée par analyse MET (TEM).
(cf. Negrini et al., 2022)

Les fibrils91 remises en suspension (dans du PBS) ont été fragmentées avant leur ajout aux cultures cellulaires par sonication pendant 20 min dans des tubes Eppendorf de 2 mL à l’aide du sonicateur Vial Tweeter, puis aliquotées, congelées instantanément dans l’azote liquide et conservées à -80 ̊C jusqu’à leur utilisation.
(cf. Vajhøj et al., 2021)

VialTweeter et sonicateurs de laboratoire pour la fragmentation de l’α-Syn

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