Ultraäänikäsittely leväsolujen hajotuksen ja uuton tehostamiseen

Levissä, sekä makro- että mikrolevissä, on monia arvokkaita yhdisteitä, joita käytetään ravintona, elintarvikelisäaineina, polttoaineena tai polttoaineen raaka-aineena. Kohdeaineiden vapauttaminen leväsolusta edellyttää voimakasta ja tehokasta solujen hajotusmenetelmää. Ultraääniuuttimet ovat erittäin tehokkaita ja luotettavia uutettaessa bioaktiivisia yhdisteitä kasveista, levistä ja sienistä. Yrityksen Hielscher ultraääniuuttimia on saatavilla laboratorio-, pöytä- ja teollisuusmittakaavassa, ja niiden käyttö on vakiintunut soluperäisten uutteiden valmistuksessa elintarvike-, lääke- ja biopolttoainetuotannossa.

Levät arvokkaana ravinnon ja polttoaineen lähteenä

Leväsolut ovat monipuolinen bioaktiivisten ja energiapitoisten yhdisteiden lähde. Näitä yhdisteitä ovat esimerkiksi proteiinit, hiilihydraatit, lipidit ja muut bioaktiiviset aineet sekä alkaanit. Tämän ansiosta levät ovat ravinnon, ravintoaineiden ja polttoaineiden lähde.
Mikrolevät ovat arvostettu lipidien lähde. Lipidejä käytetään ravitsemuksessa ja biopolttoaineiden, esimerkiksi biodieselin, raaka-aineena. Merellisen kasviplanktonin Dicrateria-kannat, kuten Dicrateria rotunda, tunnetaan bensiiniä tuottavina levinä, jotka voivat syntetisoida sarjan tyydyttyneitä hiilivetyjä (n-alkaaneja) C₁₀H₂₂ –C₃₈H₇₈, jotka luokitellaan bensiiniksi (C10–C15), dieselöljyiksi (C16–C20) ja polttoöljyiksi (C21–C38).
Ravintoarvonsa vuoksi leviä käytetään ”funktionaalisina elintarvikkeina” tai ”nutraseutteina”. Levistä uutettavia tärkeitä mikroravintoaineita ovat muun muassa karotenoidit astaksantiini, fukoksantiini ja zeaksantiini, fukoidaani, laminari ja muut glukaanit, joita käytetään lukuisten muiden bioaktiivisten aineiden ohella ravintolisinä ja lääkkeinä. Karrageenia, alginaattia ja muita hydrokolloideja käytetään elintarvikelisäaineina. Levälipidejä käytetään vegaanisena omega-3:n lähteenä sekä polttoaineena tai biodieselin valmistuksen raaka-aineena.

Leväsolujen hajotus ja uutto suurtehoultraäänellä

Ultraääniuuttimia eli ultraäänilaitteita käytetään arvokkaiden yhdisteiden uuttamiseen pienistä näytteistä laboratoriossa sekä laajamittaiseen kaupalliseen tuotantoon.
Leväsoluja suojaavat monimutkaiset soluseinämatriisit, jotka koostuvat lipideistä, selluloosasta, proteiineista, glykoproteiineista ja polysakkarideista. Useimpien levien soluseinien perustana on mikrofibrilliverkosto geelimäisen proteiinimatriisin sisällä. Joillakin mikrolevillä on kuitenkin epäorgaaninen jäykkä seinämä, joka koostuu opaali­piidioksidisista kuorista tai kalsiumkarbonaatista. Bioaktiivisten yhdisteiden saaminen leväbiomassasta edellyttää tehokasta solujen hajotusmenetelmää. Uuttoon liittyvien teknisten tekijöiden eli uuttomenetelmän ja laitteiston lisäksi leväsolujen hajotuksen ja uuton tehokkuuteen vaikuttavat voimakkaasti myös monet levistä riippuvat tekijät, kuten soluseinän koostumus, halutun biomolekyylin sijainti mikroleväsoluissa ja mikrolevien kasvuvaihe korjuun aikana.

Miten leväsolujen hajotus ja uutto ultraäänellä toimivat?

Kun voimakkaat ultraääniaallot kytketään ultraäänianturin, jota kutsutaan myös ultraäänitorveksi tai sonotrodiksi, kautta nesteeseen tai lietteeseen, ääniaallot kulkevat nesteen läpi ja synnyttävät vuorottelevia korkean ja matalan paineen jaksoja. Näiden korkean ja matalan paineen jaksojen aikana syntyy pieniä tyhjiökuplia tai onteloita. Kavitaatiokuplia syntyy, kun paikallinen paine laskee matalan paineen jaksojen aikana riittävän paljon kylläisen höyrynpaineen alapuolelle. Kylläisen höyrynpaineen arvo määräytyy nesteen vetolujuuden perusteella tietyssä lämpötilassa. Kuplat kasvavat useiden jaksojen aikana. Kun nämä tyhjiökuplat saavuttavat koon, jossa ne eivät enää pysty absorboimaan lisää energiaa, kupla luhistuu rajusti korkean paineen jakson aikana. Kavitaatiokuplien luhistuminen on raju, energiatiheä prosessi, joka synnyttää nesteeseen voimakkaita paineaaltoja, turbulenssia ja mikrosuihkuja. Lisäksi syntyy paikallisesti erittäin korkeita paineita ja erittäin korkeita lämpötiloja. Nämä ääriolosuhteet pystyvät helposti hajottamaan soluseiniä ja solukalvoja sekä vapauttamaan solunsisäisiä yhdisteitä tehokkaasti, vaikuttavasti ja nopeasti. Solunsisäisiä yhdisteitä, kuten proteiineja, polysakkarideja, lipidejä, vitamiineja, kivennäisaineita ja antioksidantteja, voidaan siten uuttaa tehokkaasti suurtehoultraäänellä.

Ultraäänikavitaatio solujen hajotukseen ja uuttoon

Kun minkä tahansa solun, esimerkiksi kasvi-, nisäkäs-, levä-, sieni- tai bakteerisolun, seinämä tai kalvo altistuu voimakkaalle ultraäänienergialle, se hajoaa ja solu repeytyy pienemmiksi osiksi energiatiheän ultraäänikavitaation mekaanisten voimien vaikutuksesta. Kun soluseinä rikkoutuu, solun aineenvaihduntatuotteet, kuten proteiinit, lipidit, nukleiinihapot ja klorofylli, vapautuvat sekä soluseinämatriisista että solun sisältä ja siirtyvät ympäröivään kasvatusväliaineeseen tai liuottimeen.
Edellä kuvattu ultraäänikavitaation eli akustisen kavitaation mekanismi hajottaa voimakkaasti kokonaisia leväsoluja tai solujen sisäisiä kaasu- ja nestevakuoleja. Ultraäänikavitaatio, värähtely, turbulenssi ja mikrovirtaukset edistävät aineensiirtoa solun sisäosan ja ympäröivän liuottimen välillä, jolloin biomolekyylit eli aineenvaihduntatuotteet vapautuvat tehokkaasti ja nopeasti. Ultraäänikäsittely on puhtaasti mekaaninen käsittely, joka ei edellytä voimakkaita, myrkyllisiä ja/tai kalliita kemikaaleja.
Voimakas, matalataajuinen ultraääni luo äärimmäisiä, energiatiheitä olosuhteita, joissa esiintyy korkeita paineita ja lämpötiloja sekä suuria leikkausvoimia. Nämä fysikaaliset voimat edistävät solurakenteiden hajotusta, jotta solunsisäiset yhdisteet vapautuvat väliaineeseen. Siksi matalataajuista ultraääntä käytetään laajalti bioaktiivisten aineiden ja polttoaineiden uuttamiseen levistä. Verrattuna perinteisiin uuttomenetelmiin, kuten liuotinuuttoon, helmijauhatukseen tai korkeapainehomogenisointiin, ultraääniuutto on erinomainen menetelmä, sillä se vapauttaa suurimman osan bioaktiivisista yhdisteistä, kuten lipideistä, proteiineista, polysakkarideista ja mikroravintoaineista, solusta, johon ultraääni on muodostanut huokosia ja joka on hajotettu. Oikeilla prosessiolosuhteilla ultraääniuutto tuottaa erinomaisia uuttosaantoja hyvin lyhyessä prosessiajassa. Esimerkiksi suurtehoiset ultraääniuuttimet tuottavat erinomaisia uuttotuloksia levistä, kun käytetään sopivaa liuotinta. Happamassa tai emäksisessä väliaineessa levän soluseinä muuttuu huokoiseksi ja ryppyiseksi, mikä kasvattaa saantoja matalassa lämpötilassa (alle 60 °C) lyhyellä ultraäänikäsittelyajalla (alle 3 tuntia). Lyhyt uuttoaika maltillisissa lämpötiloissa estää fukoidaanin hajoamisen, jolloin saadaan erittäin bioaktiivinen polysakkaridi.
Ultraäänikäsittely on myös menetelmä, jolla suurimolekyylinen fukoidaani voidaan muuntaa pienimolekyyliseksi fukoidaaniksi. Tämä on huomattavasti bioaktiivisempaa haarattomaksi muutetun rakenteensa vuoksi. Suuren bioaktiivisuutensa ja biosaatavilla olevan osuutensa ansiosta pienimolekyylinen fukoidaani on kiinnostava yhdiste lääkkeisiin ja lääkeaineiden kuljetusjärjestelmiin.

Tapaustutkimuksia: leväyhdisteiden ultraääniuutto

Ultraääniuuton tehokkuutta ja ultraääniuuton parametrien optimointia on tutkittu laajasti. Alla on esimerkkejä eri levälajeista ultraäänikäsittelyllä saaduista uuttotuloksista.

Proteiinien uutto spirulinasta paineen, lämmön ja ultraäänen yhdistelmällä

Professori Chemat’n tutkimusryhmä (Avignonin yliopisto) tutki paineen, lämmön ja ultraäänen yhdistelmän (manotermoultraäänikäsittely, MTS) vaikutuksia proteiinien, kuten fykosyaniinin, uuttoon kuivista Arthrospira platensis -syanobakteereista, jotka tunnetaan myös spirulinana. Manotermoultraäänikäsittelyssä (MTS) ultraääni yhdistetään kohotettuun paineeseen ja lämpötilaan ultraääniuuttoprosessin tehostamiseksi.
”Kokeellisten tulosten mukaan MTS edisti aineensiirtoa (suuri tehollinen diffuusiokerroin, De) ja mahdollisti 229 % suuremman proteiinimäärän (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) saamisen verrattuna perinteiseen prosessiin ilman ultraääntä (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). Kun uutteessa oli 28,42 g proteiineja 100 g:aa kuivaa spirulinabiomassaa kohti, jatkuvalla MTS-prosessilla saavutettiin 50 %:n proteiinien talteenottoaste 6 minuutin tehollisessa käsittelyajassa. Mikroskooppiset havainnot osoittivat, että akustinen kavitaatio vaikutti spirulinarihmoihin eri mekanismeilla, kuten pilkkoutumisella, ultraäänen aiheuttamalla huokosten muodostumisella ja rakenteen hajoamisella. Nämä erilaiset ilmiöt helpottavat spirulinan bioaktiivisten yhdisteiden uuttoa, vapautumista ja liukenemista.” [Vernès et al., 2019]

Optisia mikroskooppikuvia kokonaisista spirulinarihmoista MTS-käsittelyn eri ajankohtina. Mittakaavajana (kuva A) = 50 μm kaikissa kuvissa.
kuva ja tutkimus: ©Vernès et al. 2019

Fukoidaanin ja glukaanien ultraääniuutto seuraavasta levästä: Laminaria digitata

Tohtori Tiwarin TEAGASC-tutkimusryhmä tutki polysakkaridien eli fukoidaanin, laminariinin ja kokonaisglukaanien uuttoa Laminaria digitata -makrolevästä käyttämällä ultraäänilaitetta UIP500hdT. Tutkituilla ultraääniavusteisen uuton (UAE) parametreilla oli merkittävä vaikutus fukoosi-, FRAP- ja DPPH-tasoihin. Fukoosille, kokonaisglukaaneille, FRAP:lle ja DPPH:lle saatiin vastaavasti arvot 1 060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde ja 11,02 % optimoiduissa lämpötila- (76◦C), aika- (10 min) ja ultraääniamplitudiolosuhteissa (100 %) käyttäen liuottimena 0,1 M HCl:ää. Kuvattuja UAE-olosuhteita sovellettiin tämän jälkeen onnistuneesti muihin taloudellisesti merkittäviin ruskeisiin makroleviin (L. hyperborea ja A. nodosum) runsaasti polysakkarideja sisältävien uutteiden saamiseksi. Tutkimus osoittaa UAE:n soveltuvuuden bioaktiivisten polysakkaridien uuton tehostamiseen eri makrolevälajeista.

Fytokemikaalien ultraääniuutto seuraavista levistä: F. vesiculosus ja P. canaliculata

García-Vaqueron tutkimusryhmä vertaili erilaisia uusia uuttomenetelmiä, kuten suurtehoista ultraääniuuttoa, ultraääni-mikroaaltouuttoa, mikroaaltouuttoa, hydrotermisesti avustettua uuttoa ja korkeapaineavusteista uuttoa, arvioidakseen uuton tehokkuutta ruskeista mikrolevälajeista Fucus vesiculosus ja Pelvetia canaliculata. Ultraäänikäsittelyyn he käyttivät Hielscher UIP500hdT -ultraääniuutinta. Uuttosaantojen analyysi osoitti, että ultraääniuutolla saavutettiin useimpien fytokemikaalien suurimmat saannot molemmista F. vesiculosus -levistä. Tämä tarkoittaa, että F. vesiculosus -levästä uutettujen yhdisteiden suurimmat saannot käytettäessä ultraääniuutinta UIP500hdT olivat: kokonaisfenolipitoisuus (445,0 ± 4,6 mg gallushappoekvivalentteja/g), kokonaisflorotanniinipitoisuus (362,9 ± 3,7 mg floroglusinoliekvivalentteja/g), kokonaisflavonoidipitoisuus (286,3 ± 7,8 mg kversetiiniekvivalentteja/g) ja kokonaistanniinipitoisuus (189,1 ± 4,4 mg katekiiniekvivalentteja/g).
Tutkimuksessaan ryhmä päätteli, että ultraääniavusteisen uuton käyttö ”yhdistettynä 50 %:n etanoliliuokseen uuttoliuottimena voisi olla lupaava strategia TPC:n, TPhC:n, TFC:n ja TTC:n uuttamiseen samalla, kun vähennetään ei-toivottujen hiilihydraattien samanaikaista uuttoa sekä F. vesiculosus- että P. canaliculata -levistä, ja tarjota lupaavia sovelluksia käytettäessä näitä yhdisteitä lääkkeinä, nutraseutteina ja kosmeseutteina.” [García-Vaquero et al., 2021]

Manotermoultraäänikäsittelyn mittakaavan kasvattaminen Avignonin yliopistossa yrityksen Hielscher ultraäänilaitteilla: laboratoriolaitteesta UIP1000hdT (A) pilottilaitteeseen UIP4000hdT (B, C ja D). Kuvassa D esitetään kaavio ultraäänivirtauskennon poikkileikkauksesta: FC100K.
kuva ja tutkimus: ©Vernès et al. 2019

Suurtehoiset ultraääniuuttimet levien hajotukseen

Hielscherin uusinta tekniikkaa edustavat ultraäänilaitteet mahdollistavat prosessiparametrien, kuten amplitudin, lämpötilan, paineen ja energiansyötön, täydellisen hallinnan.
Ultraääniuutossa esimerkiksi raaka-aineen hiukkaskokoa, liuotintyyppiä, kiintoaineen ja liuottimen suhdetta sekä uuttoaikaa voidaan muuttaa ja optimoida parhaiden tulosten saavuttamiseksi.
Koska ultraääniuutto on ei-terminen uuttomenetelmä, raaka-aineessa, kuten levissä, olevien bioaktiivisten ainesosien lämpöhajoaminen vältetään.
Kaiken kaikkiaan edut, kuten suuri saanto, lyhyt uuttoaika, matala uuttolämpötila ja pienet liuotinmäärät, tekevät ultraäänikäsittelystä ylivertaisen uuttomenetelmän.

Ultraääniuutto: vakiintunut käyttö laboratorioissa ja teollisuudessa

Ultraääniuuttoa käytetään laajalti kaikenlaisten bioaktiivisten yhdisteiden uuttamiseen kasveista, levistä, bakteereista ja nisäkässoluista. Ultraääniuutto on vakiintunut yksinkertaiseksi, kustannustehokkaaksi ja erittäin tehokkaaksi menetelmäksi, joka päihittää muut perinteiset uuttomenetelmät suuremmilla uuttosaannoilla ja lyhyemmällä käsittelyajalla.
Koska laboratorio-, pöytä- ja täysin teollisia ultraäänijärjestelmiä on helposti saatavilla, ultraääniuutto on nykyään vakiintunut ja luotettu tekniikka. Yrityksen Hielscher ultraääniuuttimia on asennettu ympäri maailmaa teollisiin tuotantolaitoksiin, joissa valmistetaan elintarvike- ja lääkelaatuisia bioaktiivisia yhdisteitä.

Prosessin standardointi Hielscher Ultrasonicsin avulla

Elintarvikkeissa, lääkkeissä tai kosmetiikassa käytettävät leväuutteet on valmistettava hyvien tuotantotapojen (GMP) mukaisesti ja standardoituja prosessimäärityksiä noudattaen. Hielscher Ultrasonicsin digitaalisissa uuttojärjestelmissä on älykäs ohjelmisto, jonka avulla ultraäänikäsittelyprosessi on helppo määrittää ja sitä on helppo hallita tarkasti. Automaattinen tietojen tallennus kirjoittaa kaikki ultraääniprosessin parametrit, kuten ultraäänienergian (kokonais- ja nettoenergian), amplitudin, lämpötilan ja paineen (kun lämpötila- ja paineanturit on asennettu), päivämäärä- ja aikaleimoineen sisäänrakennetulle SD-kortille. Näin voit tarkastaa jokaisen ultraäänellä käsitellyn erän. Samalla varmistetaan toistettavuus ja jatkuvasti korkea tuotelaatu.

Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: