Korkean suorituskyvyn näytteen valmistelu mitokondrioiden diagnostiikkaa varten
Mitokondrioiden diagnostiikka tutkimuksessa ja klinikoilla suoritetaan käyttämällä erilaisia tekniikoita, kuten sekvensointia, PCR: ää ja biokemiallisia määrityksiä. Näitä menetelmiä käytetään DNA-mutaatioiden tunnistamiseen ja mitokondrioiden toiminnan mittaamiseen. Sekvensointi auttaa havaitsemaan geneettisiä mutaatioita, kun taas PCR voi kvantifioida spesifisiä DNA-sekvenssejä. Biokemiallisilla määrityksillä arvioidaan mitokondrioiden proteiinien ja entsyymien toimivuutta.
Mitokondrioiden sairauksien diagnosointi on erityisen vaikeaa näiden sairauksien voimakkaan kliinisen vaihtelun sekä kahden eri tavalla periytyvän genomin monimutkaisen vuorovaikutuksen vuoksi: mitokondrioiden DNA (mtDNA) ja ydingenomi.
DNA: n uuttaminen ja pirstoutuminen sonikaatiolla
DNA: n uuttaminen lihaskudoksesta on erityisen hyödyllistä, kun epäillään kudoskohtaisia muutoksia mtDNA: ssa. Näitä muutoksia voivat olla mtDNA: n deleetiot kroonisessa progressiivisessa ulkoisessa oftalmoplegiassa (CPEO), mtDNA: n pistemutaatiot mitokondrioiden myopatioissa tai mtDNA: n heikkeneminen Alpersin oireyhtymässä. Lihaskudoksesta uutettua DNA: ta voidaan sitten käyttää erilaisiin geneettisiin testeihin, kuten eteläiseen blottiin ja pitkän kantaman PCR: ään deleetioihin, reaaliaikaiseen PCR: ään ehtymiseen tai pistemutaatioiden sekvensointiin.
Sonikaatiota, jossa käytetään voimakkaita ultraääniaaltoja, sovelletaan useisiin mitokondrioiden diagnostiikan sovelluksiin. Sitä käytetään solujen hajottamiseen solunsisäisen sisällön, kuten mitokondrioiden ja DNA: n, uuttamiseksi, DNA: n, kuten mtDNA: n ja nDNA: n, leikkaamiseksi sekvensointia varten ja näytteiden homogenoimiseksi.
UIP400MTP Plate Sonicator korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen sonikoi tasaisesti näytteitä monikuoppaisissa ja 96-kuoppaisissa levyissä
Kuinka eristää mitokondriot soluista ja kudoksista
Mitokondrioiden eristäminen käsittää kaksi olennaista vaihetta: solujen hajottaminen niiden sisällön vapauttamiseksi ja differentiaalisentrifugoinnin käyttäminen mitokondrioiden fraktioiden erottamiseksi ja talteenottamiseksi.
Ultraäänellä
Hielscher-sonikaattorit ovat yhteensopivia tavallisten lyysipuskureiden ja -sarjojen kanssa, joten ne soveltuvat mitokondrioiden eristämiseen. Sonikaatiolla on kaksi päätarkoitusta:
- Solujen lyysi: Ultraääniaallot häiritsevät solukalvoja ja vapauttavat solunsisäistä sisältöä.
- Mitokondrioiden häiriöt: Sonikaatio seuraavassa vaiheessa voi murtaa mitokondriot mitokondrioiden proteiinien tai mitokondrioiden DNA: n vapauttamiseksi.
- mtDNA-pirstoutuminen: Sonikaatio on luotettava tekniikka mitokondrioiden DNA: n leikkaamiseksi sekvensointia varten.
Monikuoppalevyinen sonikaattori mahdollistaa UIP400MTP mitokondrioiden näytteiden korkean suorituskyvyn näytteen valmistuksen. Yhdessä differentiaalisen sentrifugoinnin kanssa sonikaatio parantaa mitokondrioiden eristämisen tehokkuutta, mikä takaa korkeat saannot ehjiä mitokondrioita, jotka soveltuvat erilaisiin loppupään sovelluksiin.
Hielscher UIP400MTP multiwell-levyn sonikaattori toimii minkä tahansa vakiolevyn kanssa
Monikuoppalevyinen sonikaattori tarjoaa UIP400MTP lukuisia etuja korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen, esimerkiksi mitokondrioiden diagnostiikassa.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen biomarkkeridiagnostiikassa.
Esimerkilliset ohjeet ultraääni mtDNA-pirstoutumiseen
Valmistelu ja uuttaminen:
- C57BL/6-hiiret kuolivat kohdunkaulan sijoiltaanmenoon.
- Maksat uutettiin nopeasti ja pestiin jääkylmässä steriilissä PBS:ssä.
Mitokondrioiden eristäminen:
- Mitokondriot eristettiin käyttämällä 2 ml: n Dounce-kudoshiomakonetta ja mitokondrioiden eristyspakkausta kudokselle.
- Alkusentrifugointi 700× g:ssa ja 3 000× g:ssa.
- Suorita kaksi ylimääräistä pesuvaihetta puskurilla C.
DNA: n eristäminen:
- Ensimmäisen sentrifugoinnin pellettiä 700× g: ssa käytettiin ydin-DNA: n (nDNA) eristämiseen.
- DNA eristettiin spin-pylväillä.
- Mitokondrioiden DNA (mtDNA) uutettiin eristetyistä mitokondrioista.
- Ydin-DNA (nDNA) uutettiin raaoista ydinuutteista, molemmat hiiren maksakudoksesta.
DNA: n pirstoutuminen:
- DNA pirstoutui jäällä käyttäen 30 kHz/50 W:n ultraäänisonikaattoria UP50H, jossa oli 0,5 mm:n mikrokärkisonotrodi 14 μm:ssä 2 × 30 sekunnin ajan.
Pirstoutumisen visualisointi ja kvantifiointi:
- Pirstoutuminen ultrasonifikaation jälkeen visualisoitiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä, jossa oli SYBR-turvallista DNA-väriainetta.
- MtDNA: n ja nDNA: n suhteellinen runsaus määritettiin qPCR: llä.
(vrt. Mariero et al., 2019)
Korkean läpäisyn näytteenvalmistusta varten monikuoppalevyinen sonikaattori helpottaa UIP400MTP suurten näytemäärien valmistamista tavallisissa 96-kuoppa-, monikuoppa- ja mikrotiitterilevyissä.
Lue lisää suuren suorituskyvyn näytteen valmistelun eduista UIP400MTP avulla!
Vinkkejä optimaaliseen mitokondrioiden eristämiseen sonikaatiolla:
- Lämpötilan säätö: Suorita kaikki vaiheet lämpötila-alueella 0 °C - 4 °C. Tämä on kriittistä mitokondrioiden eheyden ja toimivuuden ylläpitämiseksi.
- Tehokkuus ja nopeus: Työskentele nopeasti ja puhdista mitokondriot vain siinä määrin kuin sovelluksesi vaatii. Liiallinen manipulointi voi johtaa mitokondrioiden sisällön merkittäviin menetyksiin.
- Suspensioiden laimentaminen: Solu- ja organellisuspensioiden pitoisuudet pidetään alhaisina koko eristysprosessin ajan. Tämä auttaa minimoimaan ansastumis- ja agglutinaatioriskit, mikä parantaa eristettyjen mitokondrioiden puhtautta.
- Näytteen määrä: Valitse useita pienimuotoisia valmisteita yhden suuren sijaan. Tämä lähestymistapa johtaa yleensä parempiin satoihin, koska skaalaaminen ei lisää suhteellisesti hyödynnettävissä olevien mitokondrioiden määrää. Monikuoppainen levysoitin helpottaa UIP400MTP solun nopeaa ja luotettavaa hajoamista mitokondrioiden eristämiseksi sekä proteiinin uuttamista mitokondrioista.
Nämä ohjeet tehostavat eristysprosessia, jossa käytetään ultraäänilyysiä ja sentrifugointia, jolloin saadaan korkealaatuisia mitokondrioita, jotka soveltuvat loppupään sovelluksiin.
Hielscherin sonikaattorit – Laatu valmistettu Saksassa
Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.
96-kuoppainen levysonikaattori UIP400MTP mikrotiitteri- ja multiwell-levyjen sonikointiin
Kirjallisuus / Viitteet
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Usein kysyttyjä kysymyksiä mitokondrioista ja mitokondrioiden diagnostiikasta
Mitä mitokondriot ovat?
Mitokondriot ovat kalvoon sitoutuneita organelleja, joita löytyy useimpien eukaryoottisten organismien soluista. Ne tunnetaan solun voimalaitoksina, koska ne tuottavat energiaa adenosiinitrifosfaatin (ATP) muodossa soluhengitysprosessin kautta. Lisäksi mitokondrioilla on oma DNA ja niillä on keskeinen rooli muissa soluprosesseissa, mukaan lukien solusyklin säätely ja solukuolema.
Mikä erottaa mtDNA: n genomi-DNA: sta?
Mitokondrioiden DNA (mtDNA) eroaa genomi-DNA: sta (gDNA) useilla keskeisillä tavoilla. MtDNA sijaitsee mitokondrioissa, on pyöreä ja äidin perinnöllinen, kun taas gDNA sijaitsee solun ytimessä, on lineaarinen ja periytyy molemmilta vanhemmilta. MtDNA on paljon pienempi, koodaa vain 37 geeniä, kun taas gDNA sisältää noin 20 000-25 000 geeniä. MtDNA on läsnä useissa kopioissa solua kohti, sillä on suurempi mutaationopeus ja se koodaa pääasiassa mitokondrioiden toimintaan osallistuvia proteiineja. Sitä vastoin gDNA on tyypillisesti diploidi, sillä on alhaisempi mutaationopeus ja se koodaa laajaa joukkoa geenejä, jotka ovat välttämättömiä organismin kehitykselle ja toiminnalle. Lisäksi mtDNA-transkriptio ja translaatio tapahtuvat mitokondrioissa, kun taas gDNA-transkriptio tapahtuu ytimessä ja translaatio tapahtuu sytoplasmassa. Nämä erot heijastavat niiden erillisiä rooleja ja evolutiivista alkuperää.
Mikä on soluton uute?
Soluton uute on liuos, joka sisältää liuotettujen solujen sisällön, mukaan lukien proteiinit, nukleiinihapot ja muut solukomponentit, mutta ilman ehjiä solukalvoja. Tätä uutetta käytetään biokemiallisessa ja molekyylibiologisessa tutkimuksessa soluprosessien tutkimiseen in vitro, jolloin tutkijat voivat analysoida reaktioita ja mekanismeja elävien solujen ulkopuolella.
Mikä rooli PCR-testeillä mitokondriodiagnostiikassa?
PCR-testeillä on kriittinen rooli mitokondriodiagnostiikassa, koska ne mahdollistavat mutaatioiden, deleetioiden tai kopiomäärän vaihteluiden havaitsemisen mitokondrioiden DNA:ssa (mtDNA). Ne mahdollistavat tiettyjen mtDNA-alueiden monistamisen mitokondriosairauksiin liittyvien patogeenisten varianttien tunnistamiseksi. PCR-pohjaisia tekniikoita, kuten kvantitatiivista PCR:ää (qPCR) ja pitkän kantaman PCR:ää, käytetään myös mtDNA:n eheyden, heteroplasmiatasojen ja mtDNA:n ehtymisen arvioimiseen, mikä tarjoaa olennaista tietoa mitokondrioiden toiminnasta ja sairauksista.
Opi kuinka UIP400MTP Microplate Sonicator helpottaa PCR-testejä ja määrityksiä!
Mikä on differentiaalinen sentrifugointi?
Differentiaalinen sentrifugointi on laajalti käytetty tekniikka solujen fraktiointiin ja mitokondrioiden eristämiseen. Tämä menetelmä erottaa solurakenteet niiden sedimentaatiokertoimen perusteella, joka riippuu sekä tiheydestä että muodosta. Prosessissa käytetään eritasoista keskipakovoimaa näytteisiin, jotka ovat puskuroiduissa suolaliuoksissa, joilla on tietty tiheys. Rakenteet, joilla on samanlaiset sedimentaatiokertoimet, laskeutuvat keräysputken pohjalle samanaikaisesti, mikä mahdollistaa niiden talteenoton.
Kuinka differentiaalisentrifugointia käytetään mitokondrioiden eristämiseen?
Differentiaalinen sentrifugointi antaa tutkijoille mahdollisuuden erottaa mitokondrioiden fraktiot tehokkaasti muista solukomponenteista. Mitokondrioiden eristämiseen liittyy useita sentrifugointivaiheita ja sen jälkeen isolaatin talteenotto.
Ensimmäinen sentrifugointi: Käytä pientä keskipakovoimaa suurten solujätteiden ja ytimien sedimenttiin.
Seuraavat sentrifugointi: Lisää keskipakovoimaa vaiheittain mitokondrioilla rikastettuihin pellettifraktioihin. Jokainen sentrifugointivaihe poistaa rakenteet, joilla on asteittain korkeammat sedimentaatiokertoimet.
Fraktion talteenotto: Jokaisen sentrifugoinnin jälkeen pelletti kerätään talteen ja supernatantti altistetaan suuremmille g-voimille seuraavan fraktion eristämiseksi. Tämä toistetaan, kunnes mitokondrioiden haluttu puhtaus saavutetaan.