Suuren näytemäärän valmistelu mitokondriodiagnostiikkaa varten
Mitokondriodiagnostiikkaa tehdään tutkimuksessa ja kliinisessä työssä eri menetelmillä, kuten sekvensoinnilla, PCR:llä ja biokemiallisilla määrityksillä. Näillä menetelmillä tunnistetaan DNA-mutaatioita ja mitataan mitokondrioiden toimintaa. Sekvensointi auttaa havaitsemaan geneettisiä mutaatioita, kun taas PCR:llä voidaan määrittää tiettyjen DNA-sekvenssien määrä. Biokemiallisilla määrityksillä arvioidaan mitokondrioiden proteiinien ja entsyymien toimintaa.
Mitokondriosairauksien diagnostiikka on erityisen vaikeaa näiden sairauksien huomattavan kliinisen vaihtelun sekä kahden eri tavoin periytyvän genomin, mitokondrio-DNA:n (mtDNA) ja tuman genomin, monimutkaisen vuorovaikutuksen vuoksi.
DNA:n eristys ja fragmentointi ultraäänikäsittelyllä
DNA:n eristys lihaskudoksesta on erityisen hyödyllistä, kun epäillään kudoskohtaisia mtDNA:n muutoksia. Näitä muutoksia voivat olla mtDNA:n deleetiot kroonisessa etenevässä ulkoisessa oftalmoplegiassa (CPEO), mtDNA:n pistemutaatiot mitokondriaalisissa myopatioissa tai mtDNA:n määrän väheneminen Alpersin oireyhtymässä. Lihaskudoksesta eristettyä DNA:ta voidaan tämän jälkeen käyttää erilaisissa geneettisissä testeissä, kuten Southern blot -analyysissä ja pitkän kantaman PCR:ssä deleetioiden tutkimiseen, reaaliaikaisessa PCR:ssä mtDNA:n määrän vähenemisen tutkimiseen tai sekvensoinnissa pistemutaatioiden tutkimiseen.
Voimakkaita ultraääniaaltoja hyödyntävää ultraäänikäsittelyä käytetään mitokondriodiagnostiikassa useisiin tarkoituksiin. Sillä hajotetaan soluja solunsisäisen sisällön, kuten mitokondrioiden ja DNA:n, eristämiseksi, pilkotaan DNA:ta, kuten mtDNA:ta ja nDNA:ta, leikkausvoimilla sekvensointia varten sekä homogenisoidaan näytteitä.
Levyultraäänilaite UIP400MTP suuren näytemäärän valmisteluun käsittelee moni- ja 96-kuoppalevyjen näytteet tasaisesti ultraäänellä
Mitokondrioiden eristäminen soluista ja kudoksista
Mitokondrioiden eristys koostuu kahdesta olennaisesta vaiheesta: solujen hajotuksesta niiden sisällön vapauttamiseksi sekä differentiaalisentrifugoinnista mitokondriofraktioiden erottamiseksi ja talteen ottamiseksi.
Ultraäänikäsittely
Hielscher-ultraäänilaitteet ovat yhteensopivia tavanomaisten lyysipuskureiden ja reagenssipakkausten kanssa, joten ne soveltuvat mitokondrioiden eristämiseen. Ultraäänikäsittelyllä on kaksi päätarkoitusta:
- Solujen lyysi: Ultraääniaallot hajottavat solukalvoja ja vapauttavat solunsisäisen sisällön.
- Mitokondrioiden hajotus: Seuraavassa vaiheessa tehtävä ultraäänikäsittely voi hajottaa mitokondriot ja vapauttaa mitokondrioiden proteiineja tai mitokondrio-DNA:ta.
- mtDNA:n fragmentointi: Ultraäänikäsittely on luotettava menetelmä mitokondrio-DNA:n pilkkomiseen leikkausvoimilla sekvensointia varten.
Monikuoppalevyille tarkoitettu ultraäänilaite UIP400MTP mahdollistaa suuren mitokondrionäytemäärän valmistelun. Yhdessä differentiaalisentrifugoinnin kanssa ultraäänikäsittely tehostaa mitokondrioiden eristystä ja varmistaa suuren saannon ehjiä mitokondrioita, jotka soveltuvat erilaisiin jatkosovelluksiin.
Hielscher UIP400MTP -monikuoppalevyultraäänilaite toimii minkä tahansa standardilevyn kanssa
Monikuoppalevyille tarkoitettu ultraäänilaite UIP400MTP tarjoaa lukuisia etuja suuren näytemäärän valmisteluun esimerkiksi mitokondriodiagnostiikassa.
Monikuoppalevyultraäänilaite UIP400MTP suuren näytemäärän valmisteluun biomarkkeridiagnostiikassa.
Esimerkkiohjeet mtDNA:n fragmentointiin ultraäänellä
Valmistelu ja irrottaminen:
- C57BL/6-hiiret lopetettiin niskamurrolla.
- Maksat irrotettiin nopeasti ja pestiin jääkylmällä steriilillä PBS:llä.
Mitokondrioiden eristys:
- Mitokondriot eristettiin käyttämällä 2 mL:n Dounce-kudoshomogenisaattoria ja Mitochondria Isolation Kit for Tissue -reagenssipakkausta.
- Ensimmäinen sentrifugointi voimakkuuksilla 700× g ja 3 000× g.
- Tee kaksi ylimääräistä pesuvaihetta puskurilla C.
DNA:n eristys:
- Ensimmäisessä sentrifugoinnissa voimakkuudella 700× g saatua pellettiä käytettiin tuman DNA:n (nDNA) eristämiseen.
- DNA eristettiin sentrifugointipylväillä.
- Mitokondrio-DNA (mtDNA) eristettiin eristetyistä mitokondrioista.
- Tuman DNA (nDNA) eristettiin raaoista tumauutteista; sekä mitokondrio-DNA että tuman DNA olivat peräisin hiiren maksakudoksesta.
DNA:n fragmentointi:
- DNA fragmentoitiin jäillä käyttämällä 30 kHz:n / 50 W:n ultraäänilaitetta UP50H, jossa oli 0,5 mm:n mikrokärkisonotrodi, 14 μm:n arvolla 2 × 30 sekunnin ajan.
Fragmentoinnin visualisointi ja kvantifiointi:
- Ultraäänikäsittelyn jälkeinen fragmentoituminen visualisoitiin 1 %:n agaroosigeelillä käyttäen SYBR safe -DNA-väriainetta.
- mtDNA:n ja nDNA:n suhteelliset määrät määritettiin qPCR:llä.
(cf. Mariero et al., 2019)
Monikuoppalevyille tarkoitettu ultraäänilaite UIP400MTP helpottaa suurten näytemäärien valmistelua standardinmukaisissa 96-kuoppalevyissä, monikuoppalevyissä ja mikrotiitterilevyissä.
Lue lisää UIP400MTP:n eduista suuren näytemäärän valmistelussa!
Vinkkejä optimaaliseen mitokondrioiden eristykseen ultraäänikäsittelyllä:
- Lämpötilan hallinta: Tee kaikki vaiheet lämpötila-alueella 0 °C – 4 °C. Tämä on ratkaisevan tärkeää mitokondrioiden eheyden ja toimintakyvyn säilyttämiseksi.
- Tehokkuus ja nopeus: Työskentele nopeasti ja puhdista mitokondrioita vain siinä määrin kuin oma sovelluksesi edellyttää. Liiallinen käsittely voi johtaa merkittäviin mitokondrioiden sisällön menetyksiin.
- Suspensioiden laimentaminen: Pidä solu- ja soluelinsuspensioiden pitoisuudet pieninä koko eristysprosessin ajan. Tämä auttaa minimoimaan loukkuun jäämisen ja agglutinaation riskit ja parantaa siten eristettyjen mitokondrioiden puhtautta.
- Näytetilavuus: Valitse useita pienimuotoisia valmisteluja yhden suuren sijaan. Tämä lähestymistapa tuottaa yleensä paremman saannon, sillä mittakaavan suurentaminen ei lisää talteen saatavien mitokondrioiden määrää samassa suhteessa. Monikuoppalevyille tarkoitettu ultraäänilaite UIP400MTP helpottaa nopeaa ja luotettavaa solujen lyysiä mitokondrioiden eristämiseksi sekä proteiinien eristämistä mitokondrioista.
Nämä ohjeet tehostavat ultraäänilyysiin ja sentrifugointiin perustuvaa eristysprosessia ja tuottavat korkealaatuisia mitokondriopreparaatteja, jotka soveltuvat jatkosovelluksiin.
Hielscher-ultraäänilaitteet – Saksassa valmistettua laatua
Hielscher-ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka panostaa erityisesti suorituskykyisiin ultraäänilaitteisiin, joissa yhdistyvät huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher-ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL-, CSA- ja RoHs-vaatimukset.
96-kuoppalevyille tarkoitettu ultraäänilaite UIP400MTP mikrotiitteri- ja monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelyyn
Kirjallisuus / Lähteet
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Usein kysyttyjä kysymyksiä mitokondrioista ja mitokondriodiagnostiikasta
Mitä mitokondriot ovat?
Mitokondriot ovat kalvon ympäröimiä soluelimiä, joita esiintyy useimpien aitotumallisten eliöiden soluissa. Niitä kutsutaan solun voimalaitoksiksi, koska ne tuottavat energiaa adenosiinitrifosfaatin (ATP) muodossa soluhengityksen kautta. Lisäksi mitokondrioilla on oma DNA, ja niillä on keskeisiä tehtäviä muissa soluprosesseissa, kuten solusyklin ja solukuoleman säätelyssä.
Miten mtDNA eroaa genomisesta DNA:sta?
Mitokondrio-DNA (mtDNA) eroaa genomisesta DNA:sta (gDNA) useilla keskeisillä tavoilla. MtDNA sijaitsee mitokondrioissa, on rengasmainen ja periytyy äidiltä, kun taas gDNA sijaitsee solun tumassa, on lineaarinen ja periytyy molemmilta vanhemmilta. MtDNA on paljon pienempi ja koodaa vain 37 geeniä, kun taas gDNA sisältää noin 20 000–25 000 geeniä. MtDNA:ta on solussa useita kopioita, sen mutaationopeus on suurempi ja se koodaa pääasiassa mitokondrioiden toimintaan osallistuvia proteiineja. Sen sijaan gDNA on tyypillisesti diploidinen, sen mutaationopeus on pienempi ja se koodaa laajaa joukkoa eliön kehitykselle ja toiminnalle välttämättömiä geenejä. Lisäksi mtDNA:n transkriptio ja translaatio tapahtuvat mitokondrioissa, kun taas gDNA:n transkriptio tapahtuu tumassa ja translaatio solulimassa. Nämä erot heijastavat niiden erilaisia tehtäviä ja evolutiivista alkuperää.
Mikä on soluton uute?
Soluton uute on liuos, joka sisältää hajotettujen solujen sisällön, kuten proteiineja, nukleiinihappoja ja muita solukomponentteja, mutta ei ehjiä solukalvoja. Tätä uutetta käytetään biokemiallisessa ja molekyylibiologisessa tutkimuksessa soluprosessien tutkimiseen in vitro, jolloin tutkijat voivat analysoida reaktioita ja mekanismeja elävien solujen ulkopuolella.
Mikä tehtävä PCR-testeillä on mitokondriodiagnostiikassa?
PCR-testeillä on ratkaiseva tehtävä mitokondriodiagnostiikassa, sillä ne mahdollistavat mitokondrio-DNA:n (mtDNA) mutaatioiden, deleetioiden ja kopioluvun vaihteluiden havaitsemisen. Niillä voidaan monistaa tiettyjä mtDNA:n alueita mitokondriohäiriöihin liittyvien patogeenisten varianttien tunnistamiseksi. PCR-pohjaisia menetelmiä, kuten kvantitatiivista PCR:ää (qPCR) ja pitkän kantaman PCR:ää, käytetään myös mtDNA:n eheyden, heteroplasmian tason ja mtDNA:n määrän vähenemisen arviointiin, mikä antaa olennaista tietoa mitokondrioiden toiminnasta ja sairauksista.
Tutustu siihen, miten mikrolevyultraäänilaite UIP400MTP helpottaa PCR-testejä ja määrityksiä!
Mitä differentiaalisentrifugointi on?
Differentiaalisentrifugointi on laajalti käytetty menetelmä solujen fraktiointiin ja mitokondrioiden eristykseen. Menetelmä erottaa solurakenteita niiden sedimentaatiokertoimen perusteella, joka riippuu sekä tiheydestä että muodosta. Prosessissa näytteisiin kohdistetaan erisuuruisia keskipakovoimia puskuroitujen suolaliuosten sisällä, joiden tiheydet on määritelty. Rakenteet, joiden sedimentaatiokertoimet ovat samankaltaiset, laskeutuvat keräysputken pohjalle samanaikaisesti, jolloin ne voidaan ottaa talteen.
Miten differentiaalisentrifugointia käytetään mitokondrioiden eristykseen?
Differentiaalisentrifugointi mahdollistaa mitokondriofraktioiden tehokkaan erottamisen muista solukomponenteista. Mitokondrioiden eristys käsittää useita sentrifugointivaiheita ja niiden jälkeisen isolaatin talteenoton.
Ensimmäinen sentrifugointi: Käytä pientä keskipakovoimaa suurten solujäänteiden ja tumien saostamiseen.
Seuraavat sentrifugoinnit: Lisää keskipakovoimaa vaiheittain mitokondrioilla rikastuneiden fraktioiden pelletoimiseksi. Kukin sentrifugointivaihe poistaa rakenteita, joiden sedimentaatiokertoimet ovat asteittain suurempia.
Fraktioiden talteenotto: Kunkin sentrifugoinnin jälkeen pelletti kerätään ja supernatanttiin kohdistetaan suurempia g-voimia seuraavan fraktion eristämiseksi. Tätä toistetaan, kunnes mitokondrioiden haluttu puhtaus saavutetaan.