بهبود تحلیل HPLC با آماده سازی نمونه قابل اعتماد
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) همچنان یکی از مهم ترین تکنیک های تحلیلی برای شناسایی و کمی سازی ترکیبات در ماتریس های پیچیده است. از کنترل کیفیت دارویی گرفته تا پایش محیطی و تحلیل مواد غذایی، روش های HPLC به خاطر حساسیت، گزینش پذیری و قابلیت تکرارشان ارزشمند هستند. با این حال، قابلیت اطمینان داده های کروماتوگرافی به شدت به یک مرحله حیاتی وابسته است: آماده سازی نمونه HPLC.
روش های تحقیق و آماده سازی نمونه نشان می دهد که استخراج و آماده سازی نمونه با کمک صوتی به طور قابل توجهی کارایی، دقت و سرعت تحلیل HPLC را بهبود می بخشد. با استفاده از انرژی اولتراسونیک برای مختل کردن ماتریس ها و بهبود انتقال آنالیت ها به حلال ها، آزمایشگاه ها می توانند بازیابی های بالاتر، زمان استخراج کوتاه تر و نتایج تحلیلی قابل بازتولید بیشتری به دست آورند.
چرا آماده سازی نمونه در HPLC اهمیت دارد
در بسیاری از جریان های کاری تحلیلی، ماتریس نمونه – مانند مواد گیاهی، بافت زیستی، خاک یا آب – شامل مخلوط های پیچیده ای از ترکیبات است که می توانند در جداسازی کروماتوگرافی اختلال ایجاد کنند. بنابراین، آماده سازی نمونه به طور مؤثر برای جداسازی آنالیت ها، حذف مواد مزاحم و غلیظ کردن ترکیبات هدف قبل از تزریق به سیستم HPLC ضروری است.
تکنیک های سنتی استخراج اغلب شامل فرآیندهای طولانی، حجم زیادی از حلال های آلی و چندین مرحله پاک سازی هستند. این روش ها می توانند تغییرپذیری ایجاد کنند، هزینه های عملیاتی را افزایش دهند و زمان کل تحلیل را افزایش دهند.
آماده سازی نمونه اولتراسونیک جایگزینی مؤثر ارائه می دهد. سونیکاسیون انرژی صوتی با فرکانس بالا را به محیط مایع وارد می کند و حباب های میکروسکوپی کاویتاسیون تولید می کند. وقتی این حباب ها فرو می ریزند، نیروهای برشی موضعی و اثرات اختلاط میکرو ایجاد می کنند که ماتریس های جامد را مختل کرده و انتقال جرم را تسریع می کند. این فرآیند به طور چشمگیری کارایی استخراج را افزایش می دهد.
UIP400MTP سونیکاتور با توان بالا با Tube-Rack برای ویال های اتوسمپلر
شواهد علمی: سونیکاسیون عملکرد تحلیلی را بهبود می بخشد
چندین مطالعه داوری شده مزایای استخراج اولتراسونیک را در جریان های کاری HPLC نشان داده اند.
برای مثال، روشی که برای پایش بقایای آفت کش ها در نمونه های آب توسعه یافته بود، با ترکیب سونیک و تحلیل LC–MS/MS غلظت آفت کش های کارباریل را تعیین می کرد. در این روش، نمونه های آب با استونیتریل تحت درمان اولتراسونیک قبل از آنالیز کروماتوگرافی استخراج شدند. این روش عملکرد تحلیلی قوی داشت، از جمله بازیابی هایی بین ۸۹.۵۳٪ تا ۱۰۱.۷۲٪ که دقت و قابلیت اطمینان روش آماده سازی نمونه اولتراسونیک را تأیید می کند.
مرحله استخراج اولتراسونیک امکان انتقال مؤثر آنالیت ها از ماتریس آبی به حلال آلی را فراهم کرد، مصرف حلال را کاهش داد و نیاز به روش های پاک سازی گسترده را از بین برد. روش تحلیلی اعتبارسنجی شده محدودیت های خطی، دقت و کمی سازی عالی را نشان داد و اثربخشی سونیکاسیون را در جریان های کاری کروماتوگرافی مدرن برجسته ساخت. (رجوع شود به رودانی و همکاران، ۲۰۱۸)
مطالعه دیگری پراکندگی فاز جامد با کمک ماتریکس اولتراسونیک (UA-MSPD) را برای تعیین اولیورپین در برگ های زیتون با استفاده از تحلیل HPLC معرفی کرد. در این روش، پودر گیاهی و مواد جاذب مخلوط شده و سپس در مرحله شستشو در معرض امواج فراصوت قرار می گرفتند. سونوگرافی باعث افزایش جذب آنالیت ها از سطح جاذب شده و همزمان استخراج از ماتریس نمونه را بهبود بخشید. (مقایسه کنید با راشیدپور و حیدری، ۲۰۱۸)
روش اولتراسونیک بهینه شده بهبودهای تحلیلی قابل توجهی به همراه داشت، از جمله:
- منحنی های کالیبراسیون خطی با R² = 0.9979
- محدودیت های آشکارسازی تا 0.03 میکروگرم mL⁻¹
- نرخ بهبودی بین ۹۰.۲٪ تا ۹۶.۷٪
این نتایج تأیید می کنند که استخراج با کمک اولتراسوند نه تنها آماده سازی نمونه را تسریع می کند بلکه بازده استخراج را نسبت به تکنیک های پراکندگی فاز جامد ماتریسی کلاسیک افزایش می دهد.
پروب نوع فراصوت UP200St برای آماده سازی نمونه HPLC
مزایای کلیدی آماده سازی نمونه اولتراسونیک برای HPLC
پذیرش رو به رشد استخراج اولتراسونیک در آزمایشگاه های تحلیلی ناشی از چندین مزیت قابل اندازه گیری است.
- بازده استخراج بالاتر
کاویتاسیون صوتی ماتریس های جامد را تجزیه کرده و نفوذ حلال را بهبود می بخشد. این امر آزادسازی آنالیت ها را افزایش داده و نرخ بازیابی را به ویژه برای ترکیبات سطح کمیاب در نمونه های پیچیده افزایش می دهد. - کاهش زمان آماده سازی نمونه
استخراج اولتراسونیک اغلب می تواند آماده سازی نمونه را ظرف چند ثانیه یا چند دقیقه به پایان برساند. برای مثال، پارامترهای استخراج اولتراسونیک بهینه شده در UA-MSPD بازیابی آنالیت را در حدود ۳۰ ثانیه سونیک به انجام رساند و نشان داد که چگونه جریان های کاری تحلیل می تواند به طور چشمگیری تسریع شود. - مصرف حلال کمتر
از آنجا که سونوگرافی انتقال جرم را افزایش می دهد، معمولا حجم حلال های کوچکتر لازم است. کاهش استفاده از حلال ها پایداری آزمایشگاهی را بهبود بخشیده و هزینه های عملیاتی را کاهش می دهد. - تکرارپذیری بهبود یافته
توزیع یکنواخت انرژی اولتراسونیک باعث اختلال و استخراج مداوم نمونه در میان تکرارها می شود که منجر به دقت بالاتر در اندازه گیری های تحلیلی می گردد. - سازگاری با روش های کروماتوگرافی مدرن
استخراج اولتراسونیک به راحتی با سیستم های HPLC، UHPLC و LC-MS یکپارچه می شود و برای محیط های تحلیلی با توان بالا مناسب است.
کروماتوگرام HPLC از ترکیبات فنلی از عصاره التراسونیک جدا شده از برگ Annona muricata با استفاده از ultrasonicator UP400S.
(مطالعه و گرافیک: ©Nolasco-González و همکاران، 2022)
راه حل های عملی سونیکاسیون برای آماده سازی نمونه HPLC
برای آزمایشگاه هایی که استخراج اولتراسونیک را پیاده سازی می کنند، سونیکاتورهای هیلشر کنترل دقیقی بر پارامترهایی مانند دامنه، زمان و حالت پالس فراهم می کنند. بنابراین، سونیکاتورهای آزمایشگاهی هیلشر به ویژه برای آزمایشگاه های تحلیلی مناسب هستند.
مناسب ترین سونیکاتور آزمایشگاهی را برای نمونه های HPLC خود انتخاب کنید
| مدل Sonicator | مزایای HPLC | بهترین کاربرد در آماده سازی نمونه HPLC |
| VialTweeter چند لوله Sonicator |
• سونیک همزمان تا ۱۰ ویال مهر و موم شده با انرژی اولتراسونیک یکسان • استریل: هیچ آلودگی متقاطع وجود ندارد زیرا نمونه ها بسته باقی می مانند • شرایط استخراج بسیار قابل تکرارپذیری در میان دسته ها • کاویتاسیون کارآمد برای نمونه های تحلیلی با حجم کم |
• تهیه نمونه های محیطی، غذایی یا دارویی با ظرفیت بالا • استخراج آنالیت های ردیابی پیش از آنالیز HPLC، UHPLC یا LC-MS • جریان های کاری استاندارد که نیازمند برخورد یکسان با چندین نمونه هستند |
| فراصوت میکروپلیت UIP400MTP |
• سونیک بدون تماس کل میکروپلیت ها (فرمت های ۹۶ چاه، ۳۸۴ چاه) • توزیع یکنواخت انرژی فراصوت در تمام چاه ها • امکان اتوماسیون و یکپارچه سازی رباتیک برای جریان های کاری تحلیلی • توان عملیاتی بالا با کنترل دقیق دامنه و زمان صوتی |
• جریان های کاری غربالگری UHPLC با توان بالا • کتابخانه های ترکیبات دارویی و آماده سازی نمونه های متابولومی • استخراج مبتنی بر صفحه برای خطوط لوله تحلیلی LC-MS یا UHPLC |
| سونیکاتورهای آزمایشگاهی با میکرو-تیپ (سونیک مستقیم) |
• حداکثر شدت فراصوت برای اختلال ماتریسی کارآمد • استخراج بسیار سریع آنالیت ها از نمونه های جامد، ویسکوز یا ناهمگن • پارامترهای دامنه و پالس قابل تنظیم برای شرایط استخراج بهینه • انرژی بالای کاویتاسیون بازیابی آنالیت و بازده استخراج را بهبود می بخشد |
• استخراج از ماتریس های دشوار مانند بافت گیاهی، نمونه های غذایی یا پلیمرها • همگن سازی پیش از SPE، فیلتراسیون یا استخراج مایع-مایع • توسعه روش برای آماده سازی نمونه HPLC اولتراسونیک |
| کاپ هورن (“حمام با شدت بالا” برای بشرها و لوله ها) |
• سونیک غیرمستقیم از آلودگی پروب جلوگیری می کند • میدان اولتراسونیک یکنواخت برای چندین لامپ به طور همزمان • ایده آل برای نمونه های استریل، خطرناک یا فرار که باید مهر و موم بمانند • مدیریت را ساده تر می کند و در عین حال انرژی قوی کاویتاسیون را حفظ می کند |
• استخراج موازی چندین نمونه HPLC در لوله های سانتریفیوژ مهر و موم شده • تهیه نمونه های زیستی، دارویی یا محیطی • جریان های کاری که در آن ها نیاز به سونیک غیرمستقیم بدون آلودگی است |
اهمیت علمی برای شیمی تحلیلی
با حرکت شیمی تحلیلی به سمت روش های آزمایشگاهی سریع تر و پایدارتر، آماده سازی نمونه های اولتراسونیک به فناوری قدرتمندی توانمند تبدیل شده است. سونیکاسیون از توسعه روش های تحلیلی سریع با مصرف کمتر حلال، بهبود کارایی استخراج و پارامترهای اعتبارسنجی قوی حمایت می کند.
حجم رو به رشد ادبیات درباره استخراج اولتراسونیک نشان می دهد که آماده سازی نمونه HPLC با کمک سونیک صرفا یک سهولت نیست – این رویکرد علمی تأیید شده است که عملکرد تحلیلی را بهبود می بخشد. با ترکیب استخراج اولتراسونیک با تکنیک های کروماتوگرافی مدرن، آزمایشگاه ها می توانند تشخیص قابل اعتمادی از آنالیت های ردیاب در ماتریس های نمونه ای پیچیده تر به دست آورند.
جریان های کاری HPLC تقویت شده با سونیک
با پیشرفت های مستمر در ابزارهای تحلیلی و فناوری های آماده سازی نمونه، استخراج اولتراسونیک احتمالا نقش بزرگ تری در آزمایشگاه های کروماتوگرافی ایفا خواهد کرد. توانایی آن در ساده سازی جریان های کاری، بهبود کیفیت داده ها و کاهش تأثیرات زیست محیطی با نیازهای در حال تحول علم تحلیلی مدرن همسو است.
برای شیمیدانان تحلیلی و آزمایشگاه های صنعتی که به دنبال بهینه سازی آماده سازی نمونه HPLC هستند، استخراج اولتراسونیک راه حلی اثبات شده، مقیاس پذیر و از نظر علمی مقاوم ارائه می دهد. با ادغام سونیک در پروتکل های روتین آماده سازی نمونه، آزمایشگاه ها می توانند به طور قابل توجهی کارایی و قابلیت اطمینان تحلیل کروماتوگرافی را بهبود بخشند.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط مافوق صوت Hielscher رسیده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
ادبیات / منابع
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
پرسش و پاسخهای متداول
HPLC چیست؟
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) یک تکنیک جداسازی تحلیلی است که برای شناسایی، کمی سازی و تصفیه اجزای داخل یک مخلوط استفاده می شود. در HPLC، فاز متحرک مایع آنالیت های حل شده را از طریق ستونی که با فاز ساکن تحت فشار بالا پر شده است، منتقل می کند. تفاوت در تعاملات بین آنالیت ها، فاز ایستا و فاز متحرک باعث می شود ترکیبات هنگام عبور از ستون جدا شوند. آشکارسازهایی مانند UV-Vis، فلورسانس یا طیف سنجی جرمی ترکیبات جداشده را اندازه گیری می کنند که امکان تحلیل کیفی و کمی دقیق را فراهم می کند.
انواع کروماتوگرافی مایع چیستند؟
کروماتوگرافی مایع را می توان بر اساس مکانیزم جداسازی استفاده شده بین آنالیت، فاز ایستا و فاز متحرک طبقه بندی کرد. رایج ترین انواع، کروماتوگرافی فاز معکوس است که در آن فاز ایستای غیرقطبی ترکیبات را بر اساس تعاملات آب گریز جدا می کند؛ کروماتوگرافی فاز نرمال که از فاز قطبی-ساکن استفاده می کند و ترکیبات را بر اساس قطبیت جدا می کند؛ کروماتوگرافی تبادل یونی، که در آن فازهای ثابت باردار، آنالیت ها را بر اساس برهم کنش های یونی جدا می کنند؛ و کروماتوگرافی حذف اندازه که مولکول ها را بر اساس اندازه هیدرودینامیکی و وزن مولکولی شان جدا می کند. روش های تخصصی اضافی شامل کروماتوگرافی تمایل و کروماتوگرافی تعامل آب دوست (HILIC) است که تعاملات مولکولی خاص یا ترکیبات قطبی را هدف قرار می دهند.
چه ویال هایی برای HPLC استفاده می شوند؟
آنالیزهای HPLC معمولا از ویال های شیشه ای یا پلیمری کوچک استفاده می کنند که برای نگهداری نمونه های آماده شده قبل از تزریق به سیستم کروماتوگرافی طراحی شده اند. رایج ترین فرمت، ویال نمونه بردار خودکار ۲ میلی لیتری است که با اکثر نمونه بردارهای خودکار HPLC سازگار است. این ویال ها معمولا از شیشه بوروسیلیکات ساخته می شوند تا مقاومت شیمیایی و حداقل تعامل با حلال ها و آنالیت ها را تضمین کنند. بسته به نوع نمونه، ویال ها ممکن است شامل درج هایی برای نمونه های کم حجم، درپوش های پیچ دار یا درپوش های پیچ دار و سپتا ساخته شده از موادی مانند PTFE/سیلیکون برای حفظ یکپارچگی نمونه باشند.
ویال های اتوسمپلر چیستند؟
ویال های اتوسمپلر نمونه های تخصصی هستند که برای سیستم های تزریق خودکار در ابزارهای HPLC و UHPLC طراحی شده اند. آن ها محلول نمونه آماده شده را نگه می دارند و در سینی اتوسمپلر ابزار قرار می گیرند، جایی که سیستم به طور خودکار حجم مشخصی را برای تزریق به ستون کروماتوگرافی برداشت می کند. ویال های اتوسمپلر با ابعاد دقیق تولید می شوند تا سازگاری با سوزن های نمونه برداری رباتیک تضمین شده و تبخیر، آلودگی یا جذب نمونه به حداقل برسد. طراحی آن ها امکان تحلیل های قابل تکرار و با توان بالا را در آزمایشگاه های کروماتوگرافی مدرن فراهم می کند.
مراحل HPLC چیست؟
جریان کاری معمول کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) شامل چندین مرحله ترتیبی است که جداسازی و شناسایی قابل اعتماد آنالیت ها را تضمین می کند.
- ابتدا، آماده سازی نمونه برای حل کردن آنالیت، حذف ذرات معلق و اغلب استخراج یا غلیظ ترکیبات هدف از ماتریس نمونه انجام می شود. این مرحله ممکن است شامل تکنیک های فیلتراسیون، رقیق سازی یا استخراج مانند استخراج اولتراسونی، استخراج فاز جامد یا استخراج مایع-مایع باشد.
- سپس نمونه آماده شده در ویال HPLC قرار داده شده و در اتوسمپلر بارگذاری می شود. اتوسمپلر حجم دقیقی از نمونه را به فاز متحرک جاری تزریق می کند.
- مرحله انتقال فاز متحرک سپس نمونه تزریق شده را با استفاده از پمپ فشار بالا از طریق سیستم منتقل می کند. فاز متحرک آنالیت ها را با نرخ جریان کنترل شده از ستون کروماتوگرافی عبور می دهد.
- درون ستون کروماتوگرافی، جدایی رخ می دهد. این ستون شامل یک فاز ایستا است که معمولا ذرات فشرده با خواص شیمیایی تعریف شده است. هنگامی که آنالیت ها در ستون حرکت می کنند، با فاز ایستا و فاز متحرک به شکل متفاوتی تعامل می کنند و باعث می شوند در زمان های مختلف لول شوند.
- پس از جداسازی، ترکیبات از یک آشکارساز مانند آشکارساز UV-Vis، فلورسانس یا طیف سنجی جرمی عبور می کنند. آشکارساز حضور و غلظت ترکیبات خارج کننده را اندازه گیری کرده و سیگنال را به داده های الکترونیکی تبدیل می کند.
- در نهایت، جمع آوری و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار کروماتوگرافی انجام می شود. این سیستم یک کروماتوگرام تولید می کند که در آن قله ها متناظر با ترکیبات منفرد هستند. زمان های نگهداری اوج به شناسایی آنالیت ها کمک می کند، در حالی که نواحی اوج یا ارتفاعات امکان تعیین کمی غلظت آن ها را فراهم می کند.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.