بهبود آنالیز HPLC با آماده‌سازی قابل‌اعتماد نمونه
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) همچنان یکی از مهم‌ترین روش‌های تجزیه‌ای برای شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات در ماتریس‌های پیچیده است. از کنترل کیفیت دارویی تا پایش محیط‌زیست و آنالیز مواد غذایی، روش‌های HPLC به‌دلیل حساسیت، گزینش‌پذیری و تکرارپذیری خود ارزشمند هستند. بااین‌حال، قابلیت اعتماد داده‌های کروماتوگرافی به‌شدت به یک مرحلهٔ حیاتی وابسته است: آماده‌سازی نمونه برای HPLC.
پژوهش‌ها و رویه‌های معمول آماده‌سازی نمونه نشان می‌دهند که استخراج و آماده‌سازی نمونه به کمک فراصوت‌دهی، کارایی، صحت و سرعت آنالیز HPLC را به‌طور چشمگیری بهبود می‌بخشند. آزمایشگاه‌ها با استفاده از انرژی فراصوتی برای تخریب ماتریس‌ها و بهبود انتقال آنالیت به حلال‌ها می‌توانند به بازیابی بیشتر، زمان استخراج کوتاه‌تر و نتایج تجزیه‌ای تکرارپذیرتر دست یابند.
چرا آماده‌سازی نمونه در HPLC اهمیت دارد
در بسیاری از گردش‌کارهای تجزیه‌ای، ماتریس نمونه – مانند مواد گیاهی، بافت زیستی، خاک یا آب – حاوی مخلوط‌های پیچیده‌ای از ترکیبات است که می‌توانند در جداسازی کروماتوگرافی تداخل ایجاد کنند. بنابراین، پیش از تزریق به سامانهٔ HPLC، آماده‌سازی کارآمد نمونه برای جداسازی آنالیت‌ها، حذف مواد مزاحم و تغلیظ ترکیبات هدف ضروری است.
روش‌های سنتی استخراج اغلب شامل فرایندهای طولانی، حجم زیادی از حلال‌های آلی و چندین مرحلهٔ پاک‌سازی هستند. این روش‌ها می‌توانند تغییرپذیری ایجاد کنند، هزینه‌های عملیاتی را افزایش دهند و زمان کل آنالیز را طولانی‌تر کنند.
آماده‌سازی فراصوتی نمونه جایگزینی مؤثر ارائه می‌دهد. فراصوت‌دهی انرژی آکوستیکی با فرکانس بالا را وارد محیط مایع می‌کند و حباب‌های میکروسکوپی کاویتاسیون ایجاد می‌کند. این حباب‌ها هنگام فروپاشی، نیروهای برشی موضعی و اثرات ریزاختلاط ایجاد می‌کنند که ماتریس‌های جامد را تخریب کرده و انتقال جرم را تسریع می‌کنند. این فرایند کارایی استخراج را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد.
سونیکاتور UIP400MTP با ظرفیت پردازش بالا همراه با رک لوله برای ویال‌های اتوسمپلر
شواهد علمی: فراصوت‌دهی عملکرد تجزیه‌ای را بهبود می‌بخشد
چندین مطالعهٔ داوری‌شده مزایای استخراج فراصوتی را در گردش‌کارهای HPLC نشان داده‌اند.
برای مثال، در روشی که برای پایش باقی‌ماندهٔ آفت‌کش‌ها در نمونه‌های آب توسعه یافت، از فراصوت‌دهی همراه با آنالیز LC–MS/MS برای تعیین غلظت آفت‌کش کارباریل استفاده شد. در این رویکرد، نمونه‌های آب پیش از آنالیز کروماتوگرافی، تحت تیمار فراصوتی با استونیتریل استخراج شدند. این روش به عملکرد تجزیه‌ای مطلوبی، از جمله بازیابی بین 89٫53% و 101٫72%، دست یافت که صحت و قابلیت اعتماد فرایند آماده‌سازی فراصوتی نمونه را تأیید می‌کند.
مرحلهٔ استخراج فراصوتی، انتقال کارآمد آنالیت‌ها از ماتریس آبی به حلال آلی را امکان‌پذیر کرد، مصرف حلال را کاهش داد و نیاز به فرایندهای گستردهٔ پاک‌سازی را برطرف ساخت. روش تجزیه‌ای اعتبارسنجی‌شده، خطی‌بودن، دقت و حدود تعیین مقدار بسیار مطلوبی نشان داد که بیانگر اثربخشی فراصوت‌دهی در گردش‌کارهای مدرن کروماتوگرافی است. (رجوع کنید به Roudani et al., 2018)
مطالعه‌ای دیگر، پخش ماتریس در فاز جامد به کمک فراصوت (UA-MSPD) را برای تعیین مقدار اولئوروپئین در برگ‌های زیتون با استفاده از آنالیز HPLC معرفی کرد. در این روش، پودر گیاهی و مادهٔ جاذب مخلوط شدند و سپس در مرحلهٔ شویش در معرض امواج فراصوت قرار گرفتند. فراصوت واجذب آنالیت از سطح جاذب را افزایش داد و هم‌زمان استخراج از ماتریس نمونه را بهبود بخشید. (رجوع کنید به Rashidipour and Heydari, 2018)
فرایند فراصوتی بهینه‌شده به بهبودهای چشمگیر تجزیه‌ای منجر شد، از جمله:
- منحنی‌های کالیبراسیون خطی با R² = 0٫9979
- حدود تشخیص به کوچکی 0٫03 µg mL⁻¹
- درصدهای بازیابی بین 90٫2% و 96٫7%
این نتایج تأیید می‌کنند که استخراج به کمک فراصوت نه‌تنها آماده‌سازی نمونه را تسریع می‌کند، بلکه بازده استخراج را نیز در مقایسه با روش‌های کلاسیک پخش ماتریس در فاز جامد افزایش می‌دهد.
سونیکاتور پروبی UP200St برای آماده‌سازی نمونهٔ HPLC
مزایای کلیدی آماده‌سازی فراصوتی نمونه برای HPLC
گسترش استفاده از استخراج فراصوتی در آزمایشگاه‌های تجزیه‌ای، ناشی از چندین مزیت قابل‌اندازه‌گیری است.
- کارایی بالاتر استخراج
کاویتاسیون آکوستیکی ماتریس‌های جامد را متلاشی می‌کند و نفوذ حلال را بهبود می‌بخشد. این امر آزادسازی آنالیت را تقویت کرده و درصد بازیابی را افزایش می‌دهد، به‌ویژه برای ترکیبات موجود در مقادیر ناچیز در نمونه‌های پیچیده. - کاهش زمان آماده‌سازی نمونه
استخراج فراصوتی اغلب می‌تواند آماده‌سازی نمونه را در عرض چند ثانیه یا چند دقیقه کامل کند. برای نمونه، پارامترهای بهینه‌شدهٔ استخراج فراصوتی در UA-MSPD، بازیابی کارآمد آنالیت را با حدود 30 ثانیه فراصوت‌دهی محقق کردند که نشان می‌دهد گردش‌کارهای آنالیز تا چه اندازه می‌توانند تسریع شوند. - مصرف کمتر حلال
ازآنجاکه فراصوت انتقال جرم را تقویت می‌کند، معمولاً حجم کمتری از حلال لازم است. کاهش مصرف حلال، پایداری زیست‌محیطی آزمایشگاه را بهبود می‌بخشد و هزینه‌های عملیاتی را کاهش می‌دهد. - بهبود تکرارپذیری
توزیع یکنواخت انرژی فراصوتی، تخریب و استخراج یکسان نمونه را در تکرارها تضمین می‌کند و به دقت بهتر در اندازه‌گیری‌های تجزیه‌ای می‌انجامد. - سازگاری با روش‌های مدرن کروماتوگرافی
استخراج فراصوتی به‌راحتی با سامانه‌های HPLC، UHPLC و LC-MS ادغام می‌شود و ازاین‌رو برای محیط‌های تجزیه‌ای با ظرفیت پردازش بالا مناسب است.
کروماتوگرام HPLC ترکیبات فنولیِ عصارهٔ جداشده از برگ‌های Annona muricata به روش فراصوتی با استفاده از سونیکاتور UP400S.
(مطالعه و نمودار: ©Nolasco-González et al., 2022)
راهکارهای عملی فراصوت‌دهی برای آماده‌سازی نمونهٔ HPLC
برای آزمایشگاه‌هایی که از استخراج فراصوتی استفاده می‌کنند، سونیکاتورهای Hielscher کنترل دقیق پارامترهایی مانند دامنه، زمان و حالت پالسی را فراهم می‌کنند. بنابراین، سونیکاتورهای آزمایشگاهی Hielscher به‌ویژه برای آزمایشگاه‌های تجزیه‌ای مناسب هستند.
مناسب‌ترین سونیکاتور آزمایشگاهی را برای نمونه‌های HPLC خود انتخاب کنید
| مدل سونیکاتور | مزایا برای HPLC | مناسب‌ترین کاربرد در آماده‌سازی نمونهٔ HPLC |
| سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter |
• فراصوت‌دهی هم‌زمان حداکثر 10 ویال دربسته با انرژی فراصوتی یکسان • استریل: بدون آلودگی متقاطع، زیرا ظروف نمونه دربسته باقی می‌مانند • شرایط استخراج با تکرارپذیری بسیار بالا در سری‌های مختلف • کاویتاسیون کارآمد برای نمونه‌های تجزیه‌ای کم‌حجم |
• آماده‌سازی نمونه‌های محیط‌زیستی، غذایی یا دارویی با ظرفیت پردازش بالا • استخراج آنالیت‌های موجود در مقادیر ناچیز پیش از آنالیز HPLC، UHPLC یا LC-MS • گردش‌کارهای استانداردشده‌ای که به تیمار یکسان چندین نمونه نیاز دارند |
| سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP |
• فراصوت‌دهی بدون تماسِ کل میکروپلیت‌ها (قالب‌های 96 چاهکی و 384 چاهکی) • توزیع یکنواخت انرژی فراصوتی در تمامی چاهک‌ها • امکان خودکارسازی و ادغام با سامانه‌های رباتیک در گردش‌کارهای تجزیه‌ای • ظرفیت پردازش بالا با کنترل دقیق دامنه و زمان فراصوت‌دهی |
• گردش‌کارهای غربالگری UHPLC با ظرفیت پردازش بالا • کتابخانه‌های ترکیبات دارویی و آماده‌سازی نمونه‌های متابولومیکس • استخراج مبتنی بر پلیت برای زنجیره‌های فرایندی آنالیز LC-MS یا UHPLC |
| سونیکاتورهای آزمایشگاهی با میکروتیپ (فراصوت‌دهی مستقیم) |
• حداکثر شدت فراصوتی برای تخریب کارآمد ماتریس • استخراج بسیار سریع آنالیت‌ها از نمونه‌های جامد، گران‌رو یا ناهمگن • دامنه و پارامترهای پالسِ قابل‌تنظیم برای بهینه‌سازی شرایط استخراج • انرژی بالای کاویتاسیون، بازیابی آنالیت و بازده استخراج را بهبود می‌بخشد |
• استخراج از ماتریس‌های دشوار مانند بافت گیاهی، نمونه‌های غذایی یا پلیمرها • همگن‌سازی پیش از SPE، فیلتراسیون یا استخراج مایع–مایع • توسعهٔ روش برای آماده‌سازی فراصوتی نمونهٔ HPLC |
| CupHorn («حمام با شدت بالا» برای بشرها و لوله‌ها) |
• فراصوت‌دهی غیرمستقیم از آلودگی پروب جلوگیری می‌کند • میدان فراصوتی یکنواخت برای چندین لوله به‌طور هم‌زمان • ایدئال برای نمونه‌های استریل، خطرناک یا فرّار که باید در ظروف دربسته باقی بمانند • ساده‌سازی کار با نمونه‌ها همراه با حفظ انرژی بالای کاویتاسیون |
• استخراج موازی چندین نمونهٔ HPLC در لوله‌های سانتریفیوژ دربسته • آماده‌سازی نمونه‌های زیستی، دارویی یا محیط‌زیستی • گردش‌کارهایی که به فراصوت‌دهی غیرمستقیم و عاری از آلودگی نیاز دارند |
اهمیت علمی برای شیمی تجزیه
با حرکت شیمی تجزیه به‌سوی رویه‌های آزمایشگاهی سریع‌تر و پایدارتر از نظر زیست‌محیطی، آماده‌سازی فراصوتی نمونه به فناوری توانمندساز قدرتمندی تبدیل شده است. فراصوت‌دهی از توسعهٔ روش‌های سریع تجزیه‌ای با مصرف کمتر حلال، کارایی بهتر استخراج و شاخص‌های اعتبارسنجی مستحکم پشتیبانی می‌کند.
مجموعهٔ رو‌به‌رشد متون علمی دربارهٔ استخراج فراصوتی نشان می‌دهد که آماده‌سازی نمونهٔ HPLC به کمک فراصوت‌دهی صرفاً راهی برای آسان‌تر کردن کار نیست – بلکه رویکردی است که از نظر علمی اعتبارسنجی شده و عملکرد تجزیه‌ای را ارتقا می‌دهد. آزمایشگاه‌ها با ترکیب استخراج فراصوتی و روش‌های مدرن کروماتوگرافی می‌توانند آنالیت‌های موجود در مقادیر ناچیز را در ماتریس‌های نمونه با پیچیدگی فزاینده، به‌طور قابل‌اعتماد تشخیص دهند.
گردش‌کارهای HPLC بهبودیافته با فراصوت‌دهی
با پیشرفت مستمر دستگاه‌های تجزیه‌ای و فناوری‌های آماده‌سازی نمونه، استخراج فراصوتی احتمالاً نقش باز هم پررنگ‌تری در آزمایشگاه‌های کروماتوگرافی خواهد داشت. توانایی آن در ساده‌سازی گردش‌کارها، بهبود کیفیت داده‌ها و کاهش اثرات زیست‌محیطی، به‌خوبی با نیازهای در حال تحول علوم تجزیه‌ای مدرن هم‌راستا است.
برای شیمی‌دانان تجزیه و آزمایشگاه‌های صنعتی که در پی بهینه‌سازی آماده‌سازی نمونهٔ HPLC هستند، استخراج فراصوتی راهکاری اثبات‌شده، مقیاس‌پذیر و از نظر علمی مستحکم ارائه می‌دهد. آزمایشگاه‌ها با گنجاندن فراصوت‌دهی در پروتکل‌های معمول آماده‌سازی نمونه می‌توانند هم کارایی و هم قابلیت اعتماد آنالیز کروماتوگرافی را به‌طور چشمگیری بهبود بخشند.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
سونیکاتورهای Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و سهولت کاربری، ادغام بی‌دردسر سونیکاتورهای ما را در تأسیسات صنعتی امکان‌پذیر می‌سازند. سونیکاتورهای Hielscher به‌راحتی از عهدهٔ شرایط سخت و محیط‌های پرچالش برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهی ISO است و تأکید ویژه‌ای بر سونیکاتورهای با کارایی بالا، مجهز به فناوری روز و برخوردار از کاربری آسان دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
منابع علمی / مراجع
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
پرسش‌های متداول
HPLC چیست؟
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک روش جداسازی تجزیه‌ای است که برای شناسایی، تعیین مقدار و خالص‌سازی اجزای یک مخلوط به کار می‌رود. در HPLC، یک فاز متحرک مایع، آنالیت‌های حل‌شده را تحت فشار بالا از ستونی پرشده با فاز ساکن عبور می‌دهد. تفاوت در برهم‌کنش‌های میان آنالیت‌ها، فاز ساکن و فاز متحرک باعث می‌شود ترکیبات هنگام عبور از ستون از یکدیگر جدا شوند. آشکارسازهایی مانند UV-Vis، فلورسانس یا طیف‌سنجی جرمی، ترکیبات جداشده را اندازه‌گیری می‌کنند و امکان آنالیز کیفی و کمی دقیق را فراهم می‌سازند.
انواع کروماتوگرافی مایع کدام‌اند؟
کروماتوگرافی مایع را می‌توان بر اساس سازوکار جداسازی میان آنالیت، فاز ساکن و فاز متحرک طبقه‌بندی کرد. رایج‌ترین انواع آن عبارت‌اند از کروماتوگرافی فاز معکوس که در آن یک فاز ساکن غیرقطبی، ترکیبات را بر اساس برهم‌کنش‌های آب‌گریز جدا می‌کند؛ کروماتوگرافی فاز نرمال که از فاز ساکن قطبی استفاده کرده و ترکیبات را بر اساس قطبیت جدا می‌کند؛ کروماتوگرافی تبادل یونی که در آن فازهای ساکن باردار، آنالیت‌ها را بر اساس برهم‌کنش‌های یونی جدا می‌کنند؛ و کروماتوگرافی طرد اندازه‌ای که مولکول‌ها را بر اساس اندازهٔ هیدرودینامیکی و وزن مولکولی آن‌ها جدا می‌کند. روش‌های تخصصی دیگر شامل کروماتوگرافی تمایلی و کروماتوگرافی برهم‌کنش آب‌دوست (HILIC) هستند که برهم‌کنش‌های مولکولی خاص یا ترکیبات قطبی را هدف قرار می‌دهند.
چه ویال‌هایی برای HPLC استفاده می‌شوند؟
در آنالیزهای HPLC معمولاً از ویال‌های کوچک شیشه‌ای یا پلیمری استفاده می‌شود که برای نگهداری نمونه‌های آماده‌شده پیش از تزریق به سامانهٔ کروماتوگرافی طراحی شده‌اند. رایج‌ترین قالب، ویال اتوسمپلر 2-mL است که با بیشتر اتوسمپلرهای HPLC سازگار است. این ویال‌ها معمولاً از شیشهٔ بوروسیلیکات ساخته می‌شوند تا مقاومت شیمیایی و حداقل برهم‌کنش با حلال‌ها و آنالیت‌ها تضمین شود. بسته به نوع نمونه، ویال‌ها ممکن است دارای اینسرت برای نمونه‌های کم‌حجم، درپوش‌های پیچی یا پرسی و سپتوم‌هایی از موادی مانند PTFE/سیلیکون باشند تا یکپارچگی نمونه حفظ شود.
ویال‌های اتوسمپلر چیستند؟
ویال‌های اتوسمپلر ظروف تخصصی نمونه هستند که برای سامانه‌های تزریق خودکار در دستگاه‌های HPLC و UHPLC طراحی شده‌اند. آن‌ها محلول نمونهٔ آماده‌شده را نگه می‌دارند و در سینی اتوسمپلر دستگاه قرار می‌گیرند؛ جایی که سامانه به‌طور خودکار حجم مشخصی از نمونه را برای تزریق به ستون کروماتوگرافی برمی‌دارد. ویال‌های اتوسمپلر با ابعاد دقیق ساخته می‌شوند تا سازگاری با سوزن‌های نمونه‌برداری رباتیک تضمین شود و تبخیر، آلودگی یا جذب سطحی نمونه به حداقل برسد. طراحی آن‌ها امکان آنالیز تکرارپذیر با ظرفیت پردازش بالا را در آزمایشگاه‌های مدرن کروماتوگرافی فراهم می‌کند.
مراحل HPLC کدام‌اند؟
گردش‌کار معمول کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) شامل چندین مرحلهٔ متوالی است که جداسازی و تشخیص قابل‌اعتماد آنالیت‌ها را تضمین می‌کنند.
- ابتدا آماده‌سازی نمونه برای حل کردن آنالیت، حذف ذرات و اغلب استخراج یا تغلیظ ترکیبات هدف از ماتریس نمونه انجام می‌شود. این مرحله ممکن است شامل فیلتراسیون، رقیق‌سازی یا روش‌های استخراج مانند استخراج فراصوتی، استخراج فاز جامد یا استخراج مایع–مایع باشد.
- سپس نمونهٔ آماده‌شده در یک ویال HPLC ریخته می‌شود و در اتوسمپلر قرار می‌گیرد. اتوسمپلر حجم دقیقی از نمونه را به فاز متحرکِ در حال جریان تزریق می‌کند.
- در مرحلهٔ بعد، سامانهٔ تحویل فاز متحرک با استفاده از یک پمپ فشارقوی، نمونهٔ تزریق‌شده را در سامانه جابه‌جا می‌کند. فاز متحرک، آنالیت‌ها را با دبی کنترل‌شده از ستون کروماتوگرافی عبور می‌دهد.
- جداسازی در داخل ستون کروماتوگرافی رخ می‌دهد. ستون حاوی فاز ساکن است که معمولاً از ذرات پرشده با خواص شیمیایی مشخص تشکیل می‌شود. آنالیت‌ها هنگام عبور از ستون، به شکل‌های متفاوتی با فاز ساکن و فاز متحرک برهم‌کنش می‌کنند و در نتیجه در زمان‌های متفاوتی شویش می‌یابند.
- پس از جداسازی، ترکیبات از یک آشکارساز، مانند آشکارساز UV-Vis، فلورسانس یا طیف‌سنجی جرمی عبور می‌کنند. آشکارساز حضور و غلظت ترکیبات در حال شویش را اندازه‌گیری کرده و سیگنال را به داده‌های الکترونیکی تبدیل می‌کند.
- در پایان، گردآوری و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار کروماتوگرافی انجام می‌شود. سامانه کروماتوگرامی تولید می‌کند که در آن پیک‌ها متناظر با ترکیبات منفرد هستند. زمان بازداری پیک‌ها به شناسایی آنالیت‌ها کمک می‌کند، درحالی‌که مساحت یا ارتفاع پیک‌ها امکان تعیین کمی غلظت آن‌ها را فراهم می‌سازد.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با کارایی بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.