Kõrgelt puhastatud skisofüllaani beeta-glükaanide ultraheli tootmine

Schizophyallan on immunomoduleerivate omadustega seente β-glükaan. Väga aktiivse ravitoime korral peab skisofülsaanil olema madal molekulmass, et näidata paremat biosaadavust. On tõestatud, et ultraheliuuring vähendab skisofüllaani molekulmassi. Usaldusväärse ja tõhusa meetodina saab ultrahelitöötlust kergesti rakendada madala molekulmassiga skisofüllaani tootmiseks.

Schizophyllum seened ja ultraheli beeta-glükaani ekstraheerimine

Schizophyllum seene liigid kasvavad looduses lagunevatel puudel pärast vihmaperioode. Viljakehad kogutakse järgmisel kuival aastaajal. Schizophyllumi liigid on rikkad biokeemiliste ühendite, näiteks glükaanide poolest ja seetõttu tarbitakse neid eriti troopilistes riikides toidu ja ravimina. Tänu oma immunomoduleerivatele, seenevastastele, kasvajavastastele ja viirusevastastele omadustele on Schizophyllumi kommuun, tuntud ka kui Splitgilli seen, meelitanud biotehnoloogia- ja farmaatsiaettevõtteid.
Polüsahhariidi skisofüllaan, tuntud ka kui sizofiran, sonifilan või sizofilan, on peamine Schizophyllumi seentes leiduv β-glükaan, mis pakub väga tõhusat bioaktiivset β-glükaani skisofüllaani.
Schizophyllum commune seened kasvavad looduses puudel, mütselliumi võib kasvatada ka käärimispuljongis. Farmatseutilistes ja kosmeetilistes rakendustes on madala molekulmassiga skisofüllaan palju tõhusam kui suure molekulmassiga skisofüllaan. See on tingitud asjaolust, et madala molekulmassiga skisofülsaanil on oluliselt parem biosaadavus ja imendumiskiirus. Aditionaalselt on suure molekulmassiga skisofüllaan rakendustes sageli problemaatiline, kuna selle tulemuseks on selle vesilahuste kõrge viskoossus.
Ultraheli suuruse vähendamine on väga tõhus ja usaldusväärne meetod skisofüllaani molekulmassi vähendamiseks, suurendades seeläbi β-glükaani molekuli kvaliteeti.

Madala molekulmassiga skisofüllaani tootmise protokoll

Kuna molekulmassiga skisofüllaan näitab drastiliselt paremaid biosaadavust ja rakendusomadusi, uuris Smirnou uurimisrühm ultraheliuuringut β-glükaani molekuli skisofüllaani lõhustamiseks ja suuruse vähendamiseks.

Schizophyllani ultraheli

β-1.3(1.6)-Glükaani skisofüllaan (SPG) toodeti S. commune seene veealusel kasvatamisel bioreaktoris, kasutades substraadina sahharoosi.
Pärast kasvatamise lõppu lahjendati kultuuripuljong demineraliseeritud veega skisofüllaani kontsentratsioonini 2 g / l ja ultraheliga ultraheli protsessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksamaa) ringlussevõtu režiimis järgmistel parameetritel ja tingimustel: keskmine vool 50 ml / s, sagedus 20 kHz, väljund 2000 W, sonotrode tüüp BS2d22, võimendi tüüp B2-1.4 ja amplituud 100%. Kultuuri puljongi temperatuur ultrahelitöötluse alguses oli 25 ° C. Ultraheliga kultuuripuljong (spetsiifiline energiasisend 100 Ws / ml) filtreeriti läbi Seitz HS800 sügavusfiltri 1,5-baarise rõhu all 40 ° C juures. Keemiliseks iseloomustamiseks mõeldud ultraheliga schizophyllan (uSPG) sadestati filtraadist kolmekordse koguse isopropüülalkoholiga laboritemperatuuril ja kuivatati 60 ° C juures 12h uSPG immunoloogiliste uuringute lahuste jaoks järgmiselt: (1) ultraheliga kultuuripuljongi filtraat diafilteeriti läbi 0,1 m2 Pall Centramate T-seeria PES-kasseti (100 kDa piirväärtus) 0,8 baari juures ja diafiltratsiooni jätkati, kuni retentaatjuhtivus oli 20 μS / cm; (2) lahus kontsentreeriti diafiltratsiooni teel uSPG kontsentratsioonini 1 g/l ja steriliseeriti autoklaavimisel temperatuuril 120 °C/20 min. Denatureeritud uSPG valmistati sarnasel viisil, välja arvatud see, et kultuuripuljongi filtraadile lisati NaOH kontsentratsioonis 0,2 M ja leelistatud lahust inkubeeriti enne diafiltratsiooni laboritemperatuuril 30 minutit.

Analüüsimeetodite

Mütseeli saagist hinnati gravimeetriliselt: kultuuripuljongit lahjendati veega 1:4, tsentrifuugiti 10000 × g 25 °C juures 20 minutit, sadet pesti kolmekordse koguse veega, kuivatati 60 °C juures ja kaaluti. Skisofüllaan sadestati supernatandist kolmekordse koguse isopropüülalkoholiga, kuivatati 60 °C juures 24 tundi ja saagis määrati gravimeetriliselt. pO2 kultuuripuljongis mõõdeti optilise sondiga Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Šveits).
Kultuuripuljongi dünaamilist viskoossust mõõdeti HAAKE Visco testeril 6L spindlitega 1L ja 2L 4 °C juures ja pöörlemiskiirusega 30 p / min. Filtreerimiskiirus arvutati 500 ml kultuuripuljongi filtreerimisajast läbi 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) sügavusfiltri 1,5-baarise rõhu ja 40 ° C juures.
uSPG molekulmassi mõõdeti SEC-MALLS-i abil HPLC-süsteemis Alliance (Waters) seeriaühendusega PL akvageeli OH60 ja PL akvageeli OH40 kolonnidega ning detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) kontsentreeriti diafiltratsiooni teel uSPG kontsentratsioonini 1 g/l ja steriliseeriti autoklaavimisel temperatuuril 120 ° C / 20 min. Denatureeritud uSPG valmistati sarnasel viisil, välja arvatud see, et kultuuripuljongi filtraadile lisati NaOH kontsentratsioonis 0,2 M ja leelistatud lahust inkubeeriti enne diafiltratsiooni laboritemperatuuril 30 minutit.

Tulemused:
Ultraheliravi rakendati otse S. kommuuni 144-h kultuuri puljongile mütseeliga, et hõlbustada SPG allavoolu töötlemist.
 
Ultraheliga töödeldud skisofüllaani omadused: Ultraheli skisofüllaan (uSPG) sadestati kultuuri puljongi filtraadist alkoholiga ja iseloomustati. SEC-MALLS hindas uSPG Mw umbes 1 MDa. Skisofüllaani keskmine molekulmass vedelal kääritamisel on ligikaudu 5 MDa, samas kui tahkis-kultiveerimisel võib see ulatuda kuni 10 MDa-ni. Võrreldes ultraheliga schizophyllani molekulmassi natiivse töötlemata skisofüllaani molekulmassidega, võib ultraheliuuringu tõttu täheldada 5- kuni 10-kordset vähendatud molekulmassi.
Ultraheliga töödeldud polüsahhariid uSPG sisaldas pärast süütamist 0,7% massi / w valku ja 1,0% w / w jääki. uSPG hüdrolüsaat koosnes glükoosist, mille sisaldus oli üle 99%. Analüütilised tulemused näitavad, et ultrahelitöötlus lõhustab β-glükaani selgroo juhuslikult ja külgharud jäävad puutumata, vähendades seeläbi skisofüllaani suurust ja molekulmassi. Immunoloogilised uuringud sisuliselt valgu- ja endotoksiinivaba uSPG kohta näitasid, et ultraheliga madala Mw skisofülsaanil on väljendunud immunomoduleeriv toime.

 
Vähendatud viskoossus: Ultraheli tulemuseks oli kultuuri puljongi viskoossuse märkimisväärne vähenemine. Ultraheliuuringu ajal muutus kultuuri puljongi viskoossus mittelineaarselt: viskoossuse vähenemine oli ultrahelitöötluse alguses kiire, kuid hiljem aeglustus. Spetsiifiline energiasisend 100 Ws/ml oli piisav, et vähendada kultuuripuljongi viskoossust peaaegu 7 korda.

Parem filtreerimine: Ultraheliga töödeldud kultuuripuljong voolas läbi filtri kiiremini kui töötlemata kultuuripuljong (spetsiifiline energiasisend 0 Ws / ml) kõrgmolekulaarse SPG-ga. Lisaks sellele ultraheliuuring vähendas oluliselt toote kadu filtreerimise ajal. Kõrgmolekulaarse SPG-ga (spetsiifiline energiasisend 0 Ws/ml) töötlemata kultuuripuljongi filtraat sisaldas 0,3 ± 0,07 g/l SPG-d, samas kui SPG kontsentratsioon enne sügavusfiltreerimist oli 2 g/l. Seevastu 100 Ws / ml ultraheli kultuuri filtraat sisaldas mõlemad SPG-d kontsentratsioonis 2,2 ± 0,2 g/l, mis vastab peaaegu nullile toote kadumisele.

Järeldus: Oma järelduses jätkab uurimisrühm, et ultraheli töötlemine on tõhus tehnoloogia madala molekulmassiga skisofüllaani tootmiseks, mida saab seejärel kasutada kosmeetikas ja meditsiinis. Ultraheli, kui seda kasutatakse mütseeliga täielikul kultuuripuljongil, toob skisofüllaani tootmisele teatud eeliseid. See vähendab toote kadusid järgneva töötlemise ajal ja võimaldab ultrafiltratsiooni tõhusa kasutamise tõttu väga puhastatud polüsahhariidi tootmist.
Lisaks leidsid teadlased, et skisofüllaani ultraheli töötlemine on kergesti skaleeritav. Üks katsetehase ultraheli desintegraatori UIP2000hdT üksus töödeldi 1 liitrit kultuuri puljongit 110 sekundis voolurežiimis. Süsteemi tootlikkust saab hõlpsasti suurendada täiendavate ultraheliüksuste järjestikuse ühendamisega.

 
Loe lähemalt seente ekstraheerimise lihtsast laiendamisest!
 

Suure jõudlusega ultraheli seadmed seente glükaani töötlemiseks

Polüsahhariidide, näiteks glükaanide ja teiste bioaktiivsete ühendite, nagu kitiin ja kitosaan, killustumine võib olla usaldusväärselt töödeldud Hielscheri suure jõudlusega ultraheli seadmetega. Meie ultrasonikaatorid suudavad pakkuda kõrgeid amplituudi, pakub täpset kontrollitavust protsessi parameetrite üle ja seda saab kasutada 24/7 suure koormuse all ja nõudlikes keskkondades. Hielscher Ultrasonics seadmete valik vastab nendele nõuetele usaldusväärselt. Lisaks silmapaistvale ultraheliuuringule on Hielscheri ultrasonikaatoritel kõrge energiatõhusus, mis on märkimisväärne majanduslik eelis – eriti kui seda kasutatakse kaubanduslikus suuremahulises tootmises.
Hielscheri ultrasonikaatorid on suure jõudlusega süsteemid, mida saab varustada selliste tarvikutega nagu sonotroodid, süütevõimendid, reaktorid või voolurakud, et sobitada teie protsessi vajadusi optimaalselt. Digitaalse värviekraaniga on tagatud ultrahelitöötluse eelseadistamise võimalus, automaatne andmete salvestamine integreeritud SD-kaardile, brauseri kaugjuhtimine ja palju muid funktsioone, kõrgeim protsessi juhtimine ja kasutajasõbralikkus. Koos vastupidavuse ja suure kandevõimega on Hielscheri ultraheli süsteemid teie usaldusväärne tööhobune tootmises. β-glükaanide, näiteks skisofüllaani molekulmassi vähendamine nõuab võimsat ultraheli, et saada sihitud lõhustamine ja lõplik kvaliteetne skisofüllaani toode, mida saab kasutada farmatseutilistes rakendustes.
 
Lisateavet ultraheli beeta-glükaani ekstraheerimise kohta seentest, sealhulgas samm-sammult juhiseid siin!
 
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: