Kõrgpuhta šizofüllaan-beetaglükaanide ultraheliga tootmine

Šizofüllaan on immunomoduleerivate omadustega seene β-glükaan. Tugevatoimeliste ravimiomaduste saavutamiseks peab šizofüllaani molekulmass olema väike, et selle biosaadavus paraneks. On tõestatud, et ultraheli töötlus (sonikeerimine) vähendab šizofüllaani molekulmassi. Töökindla ja tõhusa meetodina on sonikeerimist lihtne kasutada väikese molekulmassiga šizofüllaani tootmiseks.

Schizophyllum seened ja beetaglükaanide ultraheliekstraktsioon

Schizophyllum seeneliigid kasvavad looduses vihmaperioodide järel lagunevatel puudel. Viljakehad kogutakse järgnevel kuival perioodil. Schizophyllum liigid on rikkad biokeemiliste ühendite, näiteks glükaanide poolest ning neid tarbitakse seetõttu eriti troopilistes maades toidu ja ravimina. Oma immunomoduleerivate, seenevastaste, kasvajavastaste ja viirusvastaste omaduste tõttu on Schizophyllum commune, tuntud ka kui lõhistunud lehikseen (Splitgill mushroom), pälvinud biotehnoloogia- ja farmaatsiaettevõtete huvi.
Polüsahhariid šizofüllaan, tuntud ka kui sizofiraan, sonifilaan või sizofilaan, on Schizophyllum seentes leiduv peamine β-glükaan, mis pakub väga tõhusat bioaktiivset β-glükaani šizofüllaani.
Schizophyllum commune seened kasvavad looduses puudel, müütseeli on võimalik kasvatada ka kääritusvedelikus. Farmaatsia- ja kosmeetikarakendustes on väikese molekulmassiga šizofüllaan oluliselt tõhusam kui suure molekulmassiga šizofüllaan. See tuleneb sellest, et väikese molekulmassiga šizofüllaani biosaadavus ja imendumismäär on märkimisväärselt parem. Lisaks on suure molekulmassiga šizofüllaan rakendustes sageli problemaatiline, kuna selle vesilahuste viskoossus on kõrge.
Ultraheliga suuruse vähendamine on väga tõhus ja töökindel meetod šizofüllaani molekulmassi alandamiseks, parandades seeläbi β-glükaani molekuli kvaliteeti.

Väikese molekulmassiga šizofüllaani tootmise protokoll

Kuna molekulmassiga šizofüllaan näitab drastiliselt paremat biosaadavust ja rakendusomadusi, uuris Smirnou uurimisrühm ultraheli töötlust (sonikeerimist) β-glükaani molekuli šizofüllaani lõhustamiseks ja suuruse vähendamiseks.

Šizofüllaani sonikeerimine

β-1.3(1.6)-glükaan šizofüllaan (SPG) toodeti S. commune seene submerssel kultiveerimisel bioreaktoris, kasutades substraadina sahharoosi.
Pärast kultiveerimise lõppu lahjendati kultuurivedelik demineraliseeritud veega šizofüllaani kontsentratsioonini 2 g/L ning töödeldi ultraheliga seadmega Ultraheliprotsessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksamaa) retsirkulatsioonirežiimis järgmiste parameetrite ja tingimustega: söötme vooluhulk 50 mL/s, sagedus 20 kHz, võimsus 2000 W, sonotroodi tüüp BS2d22, boosteri tüüp B2-1.4 ja amplituud 100%. Kultuurivedeliku temperatuur sonikeerimise alguses oli 25°C. Ultraheliga töödeldud kultuurivedelik (erienergiasisend 100 Ws/mL) filtreeriti läbi Seitz HS800 sügavfiltri rõhul 1,5 bar temperatuuril 40°C. Keemiliseks iseloomustamiseks mõeldud ultraheliga töödeldud šizofüllaan (uSPG) sadestati filtraadist kolmekordse koguse isopropüülalkoholiga laboritemperatuuril ja kuivatati temperatuuril 60°C 12h. uSPG lahused immunoloogilisteks uuringuteks valmistati järgmiselt: (1) ultraheliga töödeldud kultuurivedeliku filtraat diafiltreeriti läbi 0,1m2 Pall Centramate T-seeria PES kasseti (100 kDa lõikepiir) rõhul 0,8 bar ning diafiltreerimist jätkati, kuni retentaadi erijuhtivus oli 20 μS/cm; (2) lahus kontsentreeriti diafiltreerimisega uSPG kontsentratsioonini 1 g/L ja steriliseeriti autoklaavimisega temperatuuril 120°C/20 min. Denatureeritud uSPG valmistati samal viisil, välja arvatud see, et kultuurivedeliku filtraadile lisati NaOH kontsentratsioonis 0,2 M ning aluseliseks muudetud lahust inkubeeriti enne diafiltreerimist 30 min laboritemperatuuril.

Analüütilised meetodid

Mütseeli saagist hinnati gravimeetriliselt: kultuurileent lahjendati veega vahekorras 1:4, tsentrifuugiti 10 000 × g juures 25°C juures 20 min, sade pesti kolmekordse koguse veega, kuivatati 60°C juures ja kaaluti. Schizophyllan sadestati supernatandist kolmekordse koguse isopropüülalkoholiga, kuivatati 60°C juures 24h ning selle saagist määrati gravimeetriliselt. pO2 kultuurileenes mõõdeti optilise sondiga Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Šveits).
Kultuurileene dünaamilist viskoossust mõõdeti HAAKE Visco Tester 6L abil spindlitega 1L ja 2L temperatuuril 4°C ning pöörlemiskiirusel 30 rpm. Filtreerimiskiirus arvutati 500 mL kultuurileene filtreerimisajast läbi 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) sügavfiltri rõhul 1,5 bar ja temperatuuril 40°C.
uSPG molekulmassi mõõdeti SEC-MALLS meetodil HPLC süsteemil Alliance (Waters) järjestikku ühendatud PL aquagel OH60 ja PL aquagel OH40 kolonnidega ning detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) kontsentreeriti diafiltratsiooni teel uSPG kontsentratsioonini 1 g/L ja steriliseeriti autoklaavimisega 120°C/20 min. Denatureeritud uSPG valmistati sarnasel viisil, välja arvatud see, et kultuurileene filtraadile lisati NaOH kontsentratsioonis 0,2 M ning aluseliseks muudetud lahust inkubeeriti enne diafiltratsiooni 30 min laboritemperatuuril.

Tulemused:
Ultraheli töötlust rakendati otse S. commune 144-tunnisele mütseeli sisaldavale kultuurileenele, et hõlbustada SPG järeltöötlust.

Sonikeeritud schizophyllani omadused: Ultraheliga töödeldud schizophyllan (uSPG) sadestati kultuurileene filtraadist alkoholiga ja iseloomustati. SEC-MALLS hinnangul oli uSPG Mw umbes 1 MDa. Schizophyllani keskmine molekulmass vedelkääritamisel on ligikaudu 5 MDa, tahkefaasilise kasvatuse korral võib see ulatuda kuni 10 MDa-ni. Võrreldes ultraheliga töödeldud schizophyllani molekulmassi natiivse töötlemata schizophyllani molekulmassidega, on ultraheli töötluse tulemusena täheldatav 5- kuni 10-kordne molekulmassi vähenemine.
Sonikeeritud polüsahhariid uSPG sisaldas 0,7%w/w valku ja 1,0%w/w jääki pärast söestamist. uSPG hüdrolüsaat koosnes glükoosist enam kui 99% ulatuses. Analüütilised tulemused näitavad, et sonikeerimine lõhustab β-glükaani peaahelat juhuslikult ja kõrvalharud jäävad puutumata, vähendades seeläbi schizophyllani suurust ja molekulmassi. Immunoloogilised uuringud põhimõtteliselt valgu- ja endotoksiinivabal uSPG-l näitasid, et ultraheliga töödeldud väikese Mw-ga schizophyllanil on selgelt väljendunud immunomoduleeriv toime.

 
Vähenenud viskoossus: Ultraheli töötlus põhjustas kultuurileene viskoossuse märkimisväärse languse. Ultraheli töötluse ajal muutus kultuurileene viskoossus mittelineaarselt: viskoossuse langus oli ultraheli töötluse alguses kiire, kuid hiljem aeglustus. Erienergia sisend 100 Ws/mL oli piisav, et vähendada kultuurileene viskoossust ligi 7 korda.

Parem filtreeritavus: Ultrahelitöödeldud kultuurisupp voolas läbi filtri kiiremini kui töötlemata kultuurisupp (erienergia sisend 0 Ws/mL), mis sisaldas kõrgmolekulaarset SPG-d. Lisaks vähendas ultraheli töötlus oluliselt toote kadu filtreerimisel. Töötlemata, kõrgmolekulaarset SPG-d sisaldava kultuurisupi filtraat (erienergia sisend 0 Ws/mL) sisaldas 0,3 ± 0,07 g/L SPG-d, samas kui SPG kontsentratsioon enne sügavfiltreerimist oli 2 g/L. Seevastu 100 Ws/mL ultraheliga töödeldud kultuurisupi filtraat sisaldas SPG-d kontsentratsioonis 2,2 ± 0,2 g/L, mis vastab peaaegu nullilisele toote kaole.

Järeldus: Oma järelduses võtab uurimisrühm kokku, et ultraheli töötlus on efektiivne tehnoloogia madalmolekulaarse schizophyllani tootmiseks, mida saab seejärel kasutada kosmeetikas ja meditsiinis. Ultraheli töötlus, kui seda rakendada kogu kultuurisupile koos mütseeliga, annab schizophyllani tootmisele teatud eeliseid. See vähendab toote kadusid allavoolu töötlemisel ning võimaldab tänu ultrafiltratsiooni tõhusale kasutamisele toota kõrgpuhast polüsahhariidi.
Lisaks leidsid teadlased, et schizophyllani ultraheli töötlus on hõlpsasti skaleeritav. Üks pilootseadme ultraheli desintegraatori UIP2000hdT üksus töötles 1 liitrit kultuurisuppi 110 s jooksul läbivoolurežiimis. Süsteemi tootlikkust saab lihtsalt suurendada täiendavate ultraheliseadmete järjestikuse ühendamisega.

Lugege lähemalt seeneekstraktsiooni lihtsa skaleerimise kohta!
 

Suure jõudlusega ultraheliseadmed seente glükaanide töötlemiseks

Polüsahhariidide, näiteks glükaanide, samuti teiste bioaktiivsete ühendite, näiteks kitiini ja kitosaani fragmenteerimist saab usaldusväärselt teostada Hielscheri suure jõudlusega ultraheliseadmetega. Meie sonikaatorid suudavad tagada suuri amplituude, võimaldavad protsessiparameetrite täpset reguleeritavust ning neid saab käitada 24/7 suure koormuse all ja nõudlikes keskkondades. Hielscher Ultrasonicsi seadmete valik täidab neid nõudeid usaldusväärselt. Lisaks silmapaistvale ultraheli jõudlusele on Hielscheri sonikaatorid väga energiatõhusad, mis on oluline majanduslik eelis – eriti kommertslikus suuremahulises tootmises.
Hielscheri sonikaatorid on suure jõudlusega süsteemid, mida saab varustada lisatarvikutega, nagu sonotroodid, võimendid, reaktorid või läbivoolukambrid, et need sobiksid optimaalselt teie protsessi vajadustega. Digitaalse värvilise ekraani, sonikeerimiskäikude eelseadistamise võimaluse, integreeritud SD-kaardile toimuva automaatse andmesalvestuse, brauseri kaudu toimuva kaugjuhtimise ja paljude muude funktsioonidega on tagatud kõrgeim protsessikontroll ja kasutajasõbralikkus. Koos töökindluse ja suure koormustaluvusega on Hielscheri ultraheli süsteemid teie usaldusväärne tööhobune tootmises. β-glükaanide, näiteks schizophyllani, molekulmassi vähendamine nõuab võimsat ultraheli, et saavutada soovitud lõhustumine ning kvaliteetne lõplik schizophyllani toode, mida saab kasutada farmaatsiarakendustes.

Leidke siit lisateavet ultraheli abil toimuva beeta-glükaanide ekstraktsiooni kohta seentest, sh samm-sammulised juhised!

Alljärgnev tabel annab ülevaate meie ultraheli homogenisaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: