Sonikatsiooni abil agrobakteri vahendatud transformatsioon (SAAT) on tõhus meetod taimerakkude nakatamiseks võõraste geenidega, kasutades transportijana Agrobacteriumi. Ultraheli kavitatsioon põhjustab sonoporatsiooni, mida võib kirjeldada kui taimekoe sihipärast mikrohaavamist. Nende ultraheli abil luuakse mikrohaavad, DNA ja DNA vektoreid saab tõhusalt transportida raku maatriksisse.

sonoporatsioon – Ultraheli täiustatud rakkude transformatsioon

Kui rakususpensioonidele rakendatakse madalsageduslikku ultraheli (umbes 20 kHz), põhjustavad akustilise kavitatsiooni mõjud rakukudedele mööduvat membraani läbilaskvust. Seda ultraheli efekti tuntakse sonoporatsioonina ja seda kasutatakse geeniülekandeks rakkudesse või kudedesse.
Ultraheli eelised põhinevad selle mittetermilisel mehaanilisel tööpõhimõttel, mis muudab ultrahelitöötluse sageli mitmekülgsemaks ja vähem sõltuvaks rakutüüpidest. Sonoporatsiooni mitmekülgne rakendamine avab võimaluse kasutada transgeenseid taimi, millel on märkimisväärne potentsiaal keeruliste inimese terapeutiliste valkude bioproduktsioonis. Selliseid taimseid bioreaktoreid on lihtne geneetiliselt manipuleerida, need hoiavad ära võimaliku saastumise inimese patogeenidega, ei kahjusta transformatsiooni vahendavaid baktereid (nt Agrobacterium) ning on odav ja tõhus biosünteesi meetod.

Ultraheli-abistatud rakkude transformatsioon

Sonikatsioon on tehnika, mis rakendab madala sagedusega ultraheli laineid, et segada lahuses olevaid osakesi, segada lahuseid, suurendades seeläbi massiülekande ja lahustumise kiirust. Samal ajal võib ultrahelitöötlus eemaldada vedelikest lahustunud gaase. Taimede muundamisel põhjustab ultrahelitöötlus taime koes mikrokihtide moodustumist ja suurendab alasti DNA kohaletoimetamist taime protoplasti.

Geneetilise transformatsiooni jaoks on eelistatud meetod ultrahelitöötlusega abistatud agrobakteri vahendatud transformatsioon (SAAT) ja sellel on oluliselt suurem efektiivsus kui ultrahelitöötlusel, mida kasutatakse alasti DNA ja DNA vektorite ülekandmiseks otse protoplasti. Arvukad uuringud on näidanud, et ultrahelitöötluse abil Agrobacterium-vahendatud transformatsiooni (SAAT) saab kasutada ultrahelilainete ja sellest tuleneva akustilise kavitatsiooni abil taimerakkude mehaaniliste häirete ja haavade moodustumise esilekutsumiseks. Lühike ultraheliravi tekitab eksplantaatide pinnale mikrohaavad. Kuna haavatud rakud võimaldavad Agrobacterium'i tungimist taimekudede sügavamasse ossa, suurendades seeläbi taimerakkude nakatumise tõenäosust. Lisaks suurendavad sekreteeritud fenoolsed ühendid transformatsiooni. Ultraheli genereeritud mikrohaavad muudavad ka bakterite eksplantaalse tungimise teostatavamaks. SAAT-i kasutati edukalt geneetiliseks muundamiseks taimeliikides, mida peeti eriti Agrobacterium'i suhtes resistentseks.
Saati peamisteks eelisteks on väga lihtne ja odav meetod ning Agrobacterium'i vahendatud geeniülekande oluline täiustamine. Lisaks SAAT edukale kasutamisele Chenopodium rubrum L. ja Beta vulgaris L. muundamisel on seda lähenemisviisi rakendatud ka rekombinantse Escherichia coli wild-tüüpi kuuma labiilse holotoksiini ja Escherichia coli mutantse LT vaktsiini abiainete tootmisel Nicotiana tabacumis, kus lindudel tuvastati kõrgeimad süsteemsed LT-B-spetsiifilised IgG tiitrid.
(vrd Laere jt, 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Ultrahelitöötlusega toetatud agrobakterite vahendatud transformatsiooni (SAAT) teaduslikult tõestatud eelised

Sonikatsiooni abil agrobakterite vahendatud transformatsiooni (SAAT) on rakendatud paljude taimeliikide puhul. Taimerakukultuuride lühike ja suhteliselt kerge ultraheli töötlemine põhjustab sonoporatsiooni, mis võimaldab hiljem Agrobacterium'i sügavat tungimist geeni transportijana. Allpool saate lugeda eeskujulikke uuringuid, mis näitavad SAATi kasulikku mõju.

Ashwagandha ultraheli abil ümberkujundamine

W. somnifera (tuntud kui ashwagandha või talvine kirss) transformatsioonitõhususe parandamiseks uurisid Dehdashti ja kolleegid (2016) atsetosüringooni (AS) kasutamist ja ultrahelitöötlust.
Atsetosüringooni (AS) lisati kolmes etapis: Agrobacterium vedel kultuur, Agrobacterium infektsioon ja eksplantaatide kaaskultuur Agrobacteriumiga. Leiti, et 75 μM AS lisamine Agrobacterium vedelkultuurile on optimaalne vir geenide indutseerimiseks.
Ultrahelitöötluse (SAAT) täiendav rakendamine tõi kaasa kõrgeima geeniekspressiooni. GusA geeniekspressioon karvastes juurtes leiti olevat parim siis, kui lehed ja võrseotsad olid ultraheliga töödeldud vastavalt 10 ja 20s. Täiustatud protokolli transformatsiooniefektiivsus registreeriti vastavalt 66,5 ja 59,5% lehe- ja võrsetippude eksplantaatide puhul. Võrreldes teiste protokollidega leiti, et selle täiustatud protokolli transformatsioonitõhusus oli lehtede puhul 2,5 korda suurem ja võrseotste puhul 3,7 korda suurem. Lõunapoolsed blot-analüüsid kinnitasid 1–2 koopiat gusA transgeenist liinidel W1-W4, samas kui täiustatud protokolliga genereeritud real W5 tuvastati 1–4 transgeenset koopiat.

Ultrahelitöötluse abil Agrobacterium-vahendatud transformatsiooni (SAAT) kestuse mõju W. somnifera lehtede (a) ja võrsetippude (b) eksplantaatide transformatsioonisagedusele
(uuring ja graafik: © Dehdashti et al., 2016)

Puuvilla ultraheli abil ümberkujundamine

(2007) näitavad ultrahelitöötlusega puuvilla transformatsiooni kasulikke mõjusid. Madala sagedusega ultraheli põhjustatud akustiline kavitatsioon tekitab taimekoe pinnal ja selle all mikrohaavad (sonoporaatsioon) ning võimaldab Agrobacteriumil liikuda sügavamale ja täielikult kogu taime koesse. See haavav mood suurendab tõenäosust nakatada sügavamal koes asuvaid taimerakke. SAATi transformatsiooniefektiivsuse hindamiseks mõõdeti GUS geeniekspressiooni. GUS reporterisüsteem on reporteri geenisüsteem, mis on eriti kasulik taimede molekulaarbioloogias ja mikrobioloogias. Erinevate SAAT parameetrite reguleerimisel paranes oluliselt GUS mööduv ekspressioon puuvillas, kasutades küpseid embrüoid eksplantaadina. GUS avastati esmakordselt 24h pärast eksplantaatide inkubeerimist ja 48h jooksul oli GUS ekspressioon väga intensiivne, mis oli kasulik näitaja puuvillase eksplantitu eduka transformatsiooni kohta pärast ultrahelitöötlusega abistatud Agrobacteriumi vahendatud transformatsiooni (SAAT). Erinevate transformatsioonitehnikate (nimelt biolistlik, Agro, BAAT, SAAT), ultrahelitöötlusega agrobakterite vahendatud transformatsiooni (SAAT) võrdlus näitas ülekaalukalt parimaid transformatsiooni tulemusi.

Transformatsiooniprotseduuri valik GUS-i mööduva ekspressiooni alusel. Sonikatsiooni abil Agrobacterium-vahendatud transformatsioon (SAAT) näitab oluliselt kõrgemat mööduvat ekspressiooni.
(uurimus ja graafik: © Hussain et al., 2007)

Suure jõudlusega ultraheli lahendused sonoporatsiooni ja SAAT jaoks

Hielscher Ultrasonics on pikka aega kogenud laborite, uurimisrajatiste ja väga suure läbilaskevõimega tööstustoodangu suure jõudlusega ultrasonikaatorite väljatöötamisel ja tootmisel. Mikrobioloogia ja eluteaduse jaoks pakub Hielscher erinevaid lahendusi, et rahuldada erinevaid nõudeid, mis on vajalikud konkreetsete kudede ja nende ravi jaoks. Paljude proovide samaaegseks ultraheliuuringuks pakub Hielscher UIP400MTP-d multiwell plaatidele, VialTweeter ultrahelitöötluseks kuni 10 viaali (nt Eppendorfi torud) või ultraheli CupHorn. Sondi tüüpi ultrasonikaatorid on labori homogenisaatoritena saadaval 50 kuni 400 vatti, samas kui tööstussüsteemid katavad võimsusvahemiku 500 vatti kuni 16 kW.
Palun võtke meiega ühendust ja andke meile teada oma taotluse ja protsessi nõuetest. Meie kogenud töötajad soovitavad hea meelega teie bioloogilise protsessi jaoks kõige sobivamat ultrasonikaatorit.
Alljärgnev tabel annab teile ülevaate meie ultrahelihitiste ligikaudse töötlemisvõimsusest: