Geneetiline transformatsioon taimerakkudes ultraheli abil

Ultraheli abil soodustatud Agrobacterium’i vahendatud transformatsioon (SAAT, Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation) on tõhus meetod taimerakkude nakatamiseks võõrgeenidega, kasutades transportijana Agrobacterium’i. Ultraheli kavitatsioon põhjustab sonoporatsiooni, mida võib kirjeldada kui taimekoe sihipärast mikrovigastamist. Nende ultraheli abil tekitatud mikrovigastuste kaudu saab DNA-d ja DNA vektoreid tõhusalt rakumaatriksisse transportida.

Sonoporatsioon – ultraheli abil tõhustatud rakkude transformatsioon

Kui rakususpensioonidele rakendatakse madalsageduslikku ultraheli (ca 20kHz), põhjustavad akustilise kavitatsiooni mõjud rakukudedes membraani mööduva permeabiliseerumise. Seda ultraheli mõju tuntakse sonoporatsioonina ning seda kasutatakse geeniülekandeks rakkudesse või kudedesse.
Ultraheli töötluse eelised põhinevad selle mittetermilisel mehaanilisel tööpõhimõttel, mis muudab sonikeerimise sageli mitmekülgsemaks ja rakutüüpidest vähem sõltuvaks. Sonoporatsiooni mitmekülgne rakendus avab võimaluse kasutada transgeenseid taimi, millel on märkimisväärne potentsiaal keerukate inimravivalkude biotootmisel. Selliseid taimepõhiseid bioreaktoreid on lihtne geneetiliselt muuta, need hoiavad ära võimaliku saastumise inimpatogeenidega, ei kahjusta transformatsiooni vahendavaid baktereid (nt Agrobacterium) ning on odav ja tõhus biosünteesi meetod.

Ultraheli abil toimuv rakkude transformatsioon

Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on meetod, mis rakendab madalsageduslikke ultraheli laineid osakeste segamiseks lahuses ja lahuste segamiseks, suurendades seeläbi massiülekande ja lahustumise kiirust. Samaaegselt võib sonikeerimine eemaldada vedelikest lahustunud gaase. Taimede transformatsioonis põhjustab sonikeerimine taimekoes mikrovigastuste teket ning soodustab paljaste DNA molekulide sisenemist taimeprotoplasti.

Geneetilise transformatsiooni puhul on ultraheli abil soodustatud Agrobacterium’i vahendatud transformatsioon (SAAT) eelistatud meetod ning selle efektiivsus on oluliselt kõrgem kui sonikeerimisel, mida kasutatakse paljaste DNA molekulide ja DNA vektorite otseseks viimiseks protoplasti. Arvukad uuringud on näidanud, et ultraheli abil soodustatud Agrobacterium’i vahendatud transformatsiooni (SAAT) saab kasutada mehaanilise kahjustuse ja vigastuste tekitamiseks taimerakkudes ultraheli lainete ning sellest tuleneva akustilise kavitatsiooni abil. Lühike ultraheli töötlus tekitab eksplantaatide pinnale mikrovigastusi. Vigastatud rakud lubavad Agrobacterium’il tungida taimekoe sügavamatesse osadesse, mistõttu suureneb tõenäosus, et taimerakud nakatuvad. Lisaks soodustavad transformatsiooni eritatud fenoolsed ühendid. Ultraheli abil tekitatud mikrovigastused muudavad ka bakterite tungimise eksplantaati lihtsamini võimalikuks. SAAT-i kasutati edukalt geneetiliseks transformatsiooniks taimeliikidel, mida peetakse Agrobacterium’i suhtes eriti resistentseks.
SAAT-i peamised eelised on see, et tegemist on väga lihtsa ja odava meetodiga ning Agrobacterium’i vahendatud geeniülekande märkimisväärne tõhustamine. Lisaks SAAT-i edukale kasutamisele liikide Chenopodium rubrum L. ja Beta vulgaris L. transformatsioonis on seda lähenemist rakendatud ka rekombinantse Escherichia coli metsiktüüpi termolabiilse holotoksiini ning Escherichia coli mutantsete LT-vaktsiini adjuvantide tootmisel liigis Nicotiana tabacum, kus kõrgeimad süsteemsed LT-B-spetsiifilised IgG tiitrid tuvastati lindudel.
(vrd Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Üldine protseduur geeniülekandeks taimerakkudesse sonoporatsiooni teel

1. Geneetilise materjali ettevalmistamine: Alustage selle geneetilise materjali ettevalmistamisega, mida soovite taimerakkudesse viia. See võib olla plasmiidne DNA, RNA või muud nukleiinhapped.
2. Taimerakkude isoleerimine: Eraldage taimerakud, mida soovite sihtmärgiks seada. Sõltuvalt katsest võib need rakud isoleerida taimekudedest või kultuuridest.
3. Rakususpensioon: Suspendeerige taimerakud sobivas söötmes või puhvris. See on oluline tagamaks, et rakud on terved ja geenide omastamiseks soodsas seisundis.
4. Sonikaatori seadistamine: Valmistage oma sondtüüpi sonikaator ette, eelseadistades ultraheli töötluse parameetrid, nagu amplituud, aeg, energia ja temperatuur. Kastke ultraheli sond rakususpensiooni.
5. Ultraheli töötlus: Alustage ultraheli töötluse (sonikeerimise) protseduuri. Sondi otsa kiire võnkumine tekitab vedelikus kavitatsioonimulle. Need mullid paisuvad ja kollabeeruvad ultrahelilainete toimel, tekitades suspensioonis mehaanilisi jõude ja mikrovoolusid.
6. Sonoporatsioon: Kavitatsiooni tekitatud mehaanilised jõud ja mikrovoolud tekitavad taimerakkude membraanidesse ajutisi poore ja auke. Suspensioonis olev geneetiline materjal võib nende pooride kaudu taimerakkudesse siseneda.
7. Inkubeerimine: Pärast sonoporatsioonitöötlust inkubeerige taimerakke, et nad saaksid taastuda ja oma membraane stabiliseerida. See on otsustava tähtsusega samm rakkude ellujäämise ja eduka geeniülekande tagamiseks.

Geeniülekanne Agrobacteriumi või liposoomide abil

Taimerakkude transfekteerimiseks on kaks levinud viisi. Geneetilise materjali kandjana kasutatakse kas agrobakterit, gramnegatiivsete bakterite perekonda, või liposoome.

• Agrobacteriumi vahendatud sonoporatsioon: Agrobacterium tumefaciens on bakter, mida kasutatakse taimede geenitehnoloogias sageli. Selle meetodi puhul viiakse soovitud geeni sisaldav plasmiid-DNA Agrobacteriumi, mis seejärel segatakse taimerakkudega. Rakususpensiooni töödeldakse sonoporatsiooniga, kasutades sondtüüpi sonikaatorit. Ultraheli energia soodustab geneetilise materjali ülekannet Agrobacteriumist taimerakkudesse. Seda meetodit kasutatakse laialdaselt taimede geneetiliseks muundamiseks.
• Liposoomide vahendatud sonoporatsioon: Liposoomid on lipiidipõhised vesiikulid, mis võivad kanda geneetilist materjali. Selle meetodi puhul segatakse plasmiid-DNA või muude nukleiinhapetega laaditud liposoomid taimerakkudega. Sondtüüpi sonikaatoriga sonoporatsiooni kasutatakse selleks, et hõlbustada liposoomide omastamist taimerakkude poolt. Ultraheli lõhub liposoomide lipiidide kaksikkihid ja vabastab geneetilise materjali taimerakkudesse. See lähenemisviis on kasulik taimerakkudes toimuva mööduva geeniekspressiooni uuringutes.

Ultraheli töötlusega toetatud Agrobacteriumi vahendatud transformatsiooni (SAAT) teaduslikult tõestatud eelised

Ultraheli töötlusega toetatud Agrobacteriumi vahendatud transformatsiooni (SAAT) on rakendatud paljudel taimeliikidel. Taimerakukultuuride lühike ja suhteliselt õrn ultraheli töötlus põhjustab sonoporatsiooni, mis võimaldab seejärel Agrobacteriumil geenikandjana sügavale tungida. Allpool saate lugeda näidisuuringuid, mis demonstreerivad SAAT-i kasulikke toimeid.

Ashwagandha ultraheli abil toetatud transformatsioon

W. somnifera (tuntud ka kui ašvagandha või talvekirss) transformatsiooniefektiivsuse parandamiseks uurisid Dehdashti ja kolleegid (2016) atsetosüringooni (AS) ja ultraheli töötluse (sonikeerimise) kasutamist.
Atsetosüringooni (AS) lisati kolmes etapis: Agrobacteriumi vedelkultuurile, Agrobacteriumi infektsiooni ajal ning eksplantaatide ja Agrobacteriumi kaaskultiveerimisel. 75 μM AS lisamine Agrobacteriumi vedelkultuurile osutus vir-geenide indutseerimiseks optimaalseks.
Sonikeerimise (SAAT) täiendav rakendamine andis kõrgeima geeniekspressiooni. gusA geeni ekspressioon karvasjuurtes oli parim siis, kui lehti ja võrseotsi sonikeeriti vastavalt 10 ja 20s. Täiendatud protokolli transformatsiooniefektiivsuseks registreeriti lehe- ja võrseotsa eksplantaatide puhul vastavalt 66,5 ja 59,5%. Teiste protokollidega võrreldes oli selle täiendatud protokolli transformatsiooniefektiivsus lehtede puhul 2,5 korda suurem ja võrseotste puhul 3,7 korda suurem. Southern blot analüüsid kinnitasid gusA transgeeni 1–2 koopiat liinides W1-W4, samas kui täiendatud protokolliga loodud liinis W5 tuvastati 1–4 transgeeni koopiat.

Sonikeerimisel põhineva Agrobacteriumi vahendatud transformatsiooni (SAAT) kestuse mõju W. somnifera lehe- (a) ja võrseotsa- (b) eksplantaatide transformatsioonisagedusele
(uuring ja graafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraheli abil toimuv puuvilla transformatsioon

Hussain et al. (2007) näitavad ultraheli abil toimuva puuvilla transformatsiooni soodsat mõju. Madalsageduslikust ultrahelist tekkiv akustiline kavitatsioon tekitab taimekoe pinnale ja selle alla mikrohaavu (sonoporatsioon) ning võimaldab Agrobacteriumil liikuda sügavamale ja läbi kogu taimekoe. See haavamisviis suurendab tõenäosust nakatada koes sügavamal asuvaid taimerakke. SAAT transformatsiooniefektiivsuse hindamiseks mõõdeti GUS-geeni ekspressiooni. GUS-reportersüsteem on reportergeeni süsteem, mis on eriti kasulik taimede molekulaarbioloogias ja mikrobioloogias. Erinevaid SAAT parameetreid kohandades suurenes GUS-i transientne ekspressioon puuvillas, kasutades eksplantaadina küpseid embrüoid, oluliselt. GUS tuvastati esmakordselt 24h pärast eksplantaatide inkubeerimist ja 48h möödudes oli GUS-i ekspressioon väga intensiivne, mis oli kasulik näitaja puuvilla eksplantaadi eduka transformatsiooni kohta pärast sonikeerimisel põhinevat Agrobacteriumi vahendatud transformatsiooni (SAAT). Erinevate transformatsioonitehnikate (nimelt biolistika, Agro, BAAT, SAAT) võrdluses andis sonikeerimisel põhinev Agrobacteriumi vahendatud transformatsioon (SAAT) transformatsiooni osas ülekaalukalt parimad tulemused.

Transformatsioonimeetodi valik GUS-i transientse ekspressiooni alusel. Sonikeerimisel põhinev Agrobacteriumi vahendatud transformatsioon (SAAT) näitab oluliselt kõrgemat transientset ekspressiooni.
(uuring ja graafika: © Hussain et al., 2007)

Suure jõudlusega ultraheli lahendused sonoporatsiooniks ja SAAT-iks

Hielscher Ultrasonics omab pikaajalist kogemust suure jõudlusega ultraheli seadmete (sonikaatorite) arendamisel ja tootmisel laboritele, teadusasutustele ning väga suure läbilaskevõimega tööstuslikuks tootmiseks. Mikrobioloogia ja bioteaduste jaoks pakub Hielscher mitmesuguseid lahendusi, mis vastavad konkreetsete kudede ja nende töötlemise erinevatele nõuetele. Paljude proovide samaaegseks ultraheli töötluseks pakub Hielscher mitmekaevulistele plaatidele mõeldud seadet UIP400MTP, seadet VialTweeter kuni 10 viaali (nt Eppendorf-tuubid) sonikeerimiseks või ultraheli seadet CupHorn. Sondtüüpi sonikaatorite võimsus ulatub laborihomogenisaatorite puhul 50 kuni 400 vatini ja tööstussüsteemide puhul 500 vatist kuni 16kW-ni.
Palun võtke meiega ühendust ja andke meile teada oma rakendusest ja protsessi nõuetest. Meie kogenud töötajad soovitavad hea meelega teie bioloogilise protsessi jaoks kõige sobivama sonikaatori.
Alljärgnev tabel annab ülevaate meie sonikaatorite ligikaudsest töötlusvõimsusest: