Geneetiline transformatsioon taimerakkudes ultraheli abil

Sonikatsiooni abil agrobakteri vahendatud transformatsioon (SAAT) on tõhus meetod taimerakkude nakatamiseks võõraste geenidega, kasutades Agrobacteriumit transporterina. Ultraheli kavitatsioon põhjustab sonoporatsiooni, mida võib kirjeldada kui taime koe sihipärast mikrohaavamist. Nende ultraheli kaudu luuakse mikrohaavad, DNA ja DNA vektoreid saab tõhusalt transportida rakumaatriksisse.

sonoporatsioon – Ultraheli täiustatud rakkude transformatsioon

Kui rakususpensioonidele rakendatakse madala sagedusega ultraheli (umbes 20 kHz), põhjustavad akustilise kavitatsiooni mõjud rakukudedele mööduvat membraani läbilaskmist. Seda ultraheli efekti nimetatakse sonoporatsiooniks ja seda kasutatakse geenide ülekandmiseks rakkudesse või kudedesse.
Ultraheli eelised põhinevad selle mittetermilisel mehaanilisel tööpõhimõttel, mis muudab ultrahelitöötluse sageli mitmekülgsemaks ja vähem sõltuvaks rakutüüpidest. Sonoporatsiooni mitmekülgne rakendamine avab võimaluse transgeensete taimede kasutamiseks, millel on märkimisväärne potentsiaal komplekssete inimese terapeutiliste valkude biotootmisel. Selliseid taimseid bioreaktoreid on lihtne geneetiliselt manipuleerida, need hoiavad ära võimaliku saastumise inimese patogeenidega, ei kahjusta muundumist vahendavaid baktereid (nt Agrobacterium) ning on odav ja tõhus biosünteesi meetod.

Ultraheli abil rakkude transformatsioon

Sonikatsioon on tehnika, mis rakendab madala sagedusega ultraheli laineid, et segada osakesi lahuses, segada lahuseid, suurendades seeläbi massiülekande ja lahustumise kiirust. Samaaegselt võib ultrahelitöötlus eemaldada lahustunud gaasid vedelikest. Taimede transformatsioonis põhjustab ultrahelitöötlus mikrohaavade moodustumist taime koele ja suurendab alasti DNA kohaletoimetamist taime protoplasti.

Geneetilise transformatsiooni jaoks on eelistatud meetod ultrahelitöötlusega agrobakterite vahendatud transformatsioon (SAAT) ja sellel on oluliselt suurem efektiivsus kui ultrahelitöötlusel, mida kasutatakse alasti DNA ja DNA vektorite ülekandmiseks otse protoplasti. Paljud uuringud on näidanud, et ultrahelitöötluse abil Agrobacterium-vahendatud transformatsioon (SAAT) võib kasutada ultraheli lainete ja sellest tuleneva akustilise kavitatsiooni abil taimerakkude mehaaniliste häirete ja haavade moodustumise esilekutsumiseks. Lühike ultraheliravi tekitab eksplantaatide pinnale mikrohaavu. Kuna haavatud rakud võimaldavad Agrobacterium'i tungimist taimekudede sügavamasse ossa, suurendades seeläbi taimerakkude nakatumise tõenäosust. Lisaks suurendavad sekreteeritud fenoolsed ühendid transformatsiooni. Ultraheli genereeritud mikrohaavad muudavad bakterite eksplantaadi tungimise ka teostatavamaks. SAAT-i kasutati edukalt geneetiliseks muundamiseks taimeliikidel, mida peeti eriti Agrobacterium'i suhtes resistentseks.
Väga lihtne ja odav meetod, samuti Agrobacterium-vahendatud geeniülekande märkimisväärne suurendamine on SAAT-i peamised eelised. Lisaks SAAT-i edukale kasutamisele Chenopodium rubrum L. ja Beta vulgaris L. transformatsioonis on seda lähenemisviisi rakendatud ka rekombinantsete Escherichia coli metsikut tüüpi kuumalabiilsete holotoksiinide ja Escherichia coli mutantse LT vaktsiini abiainete tootmisel Nicotiana tabacum'is, kus lindudel tuvastati kõrgeimad süsteemsed LT-B-spetsiifilised IgG tiitrid.
(vrd Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Üldine meetod geeniülekandeks sonoporatsiooni kaudu taimerakkudes

1. Geneetilise materjali ettevalmistamine: Alustage geneetilise materjali ettevalmistamisega, mida soovite taimerakkudesse sisestada. See võib olla plasmiidne DNA, RNA või muud nukleiinhapped.
2. Taimerakkude isoleerimine: Eraldage taimerakud, mida soovite sihtida. Sõltuvalt teie katsest võidakse need rakud eraldada taime kudedest või kultuuridest.
3. Rakkude suspensioon: Taimerakud suspendeeritakse sobivas söötmes või puhvris. See on oluline tagamaks, et rakud on terved ja geenide omastamist soodustavas seisundis.
4. Seadistage oma Sonikator: Valmistage oma sondi tüüpi sonikaator ultrahelitöötluse eelseadistamise parameetritega, nagu amplituud, aeg, energia ja temperatuur. Sukeldage ultraheli sond rakususpensiooni.
5. Ultrahelitöötlus: Alustage ultrahelitöötlusprotseduuri. Sondi otsa kiire võnkumine tekitab vedelikus kavitatsioonimulle. Need mullid laienevad ja varisevad ultraheli lainete tõttu, tekitades suspensioonis mehaanilisi jõude ja mikrovool.
6. Sonoporatsioon: Kavitatsiooni tekitatud mehaanilised jõud ja mikrovool tekitavad taimerakkude membraanidesse ajutiselt poore ja auke. Suspensioonis sisalduv geneetiline materjal võib nende pooride kaudu siseneda taimerakkudesse.
7. Inkubeerimine: Pärast sonoporatsiooniravi inkubeerige taimerakke, et võimaldada neil taastuda ja stabiliseerida oma membraane. See on oluline samm rakkude ellujäämise ja eduka geeniülekande tagamiseks.

Geeniülekanne agrobakteri või liposoomide kaudu

Taimeraku transfekteerimiseks on kaks levinud vormi. Nad kasutavad geneetilise materjali kandjana kas agrobakterit, gramnegatiivsete bakterite perekonda või liposoome.

• Agrobakteri vahendatud sonoporatsioon: Agrobacterium tumefaciens on bakter, mida tavaliselt kasutatakse taimegeenitehnoloogias. Selle meetodi puhul viiakse soovitud geeni sisaldav plasmiidne DNA Agrobacteriumisse, mis seejärel segatakse taimerakkudega. Rakususpensioonile tehakse sonoporatsioon, kasutades sondi tüüpi sonikaatorit. Ultraheli energia suurendab geneetilise materjali ülekandmist Agrobacteriumist taimerakkudesse. Seda meetodit kasutatakse laialdaselt taimede geneetiliseks muundamiseks.
• Liposoomi vahendatud sonoporatsioon: Liposoomid on lipiidipõhised vesiikulid, mis võivad kanda geneetilist materjali. Selles meetodis segatakse plasmiidi DNA või teiste nukleiinhapetega koormatud liposoomid taimerakkudega. Sonoporatsiooni sondi tüüpi sonikaatori abil kasutatakse selleks, et hõlbustada liposoomide omastamist taimerakkude poolt. Ultraheli häirib liposoomide lipiidide kahekihilisi kihte, vabastades geneetilise materjali taimerakkudesse. See lähenemisviis on kasulik mööduvate geeniekspressiooni uuringuteks taimerakkudes.

Ultrahelitöötlusega agrobakterite vahendatud transformatsiooni (SAAT) teaduslikult tõestatud eelised

Ultrahelitöötluse abil agrobakteri vahendatud transformatsiooni (SAAT) on rakendatud paljudele taimeliikidele. Taimerakkude kultuuride lühike ja suhteliselt kerge ultraheli töötlemine põhjustab sonoporatsiooni, mis võimaldab seejärel Agrobacterium'i sügavat tungimist geeni transporterina. Allpool saate lugeda näidisuuringuid, mis näitavad SAAT-i kasulikke mõjusid.

Ashwagandha ultraheli abil muundamine

W. somnifera (tuntud kui ashwagandha või talvine kirss) transformatsioonitõhususe parandamiseks uurisid Dehdashti ja kolleegid (2016) atsetosüringooni (AS) ja ultrahelitöötluse kasutamist.
Atsetosüringoon (AS) lisati kolmes etapis: Agrobacterium vedelkultuur, Agrobacterium'i infektsioon ja eksplantaatide kooskultuur Agrobacterium'iga. Leiti, et 75 μM AS-i lisamine Agrobacterium'i vedelkultuurile on optimaalne vir-geenide indutseerimiseks.
Ultrahelitöötluse (SAAT) täiendav rakendamine tõi kaasa kõrgeima geeniekspressiooni. GusA geeniekspressioon karvastes juurtes leiti olevat parim, kui lehed ja võrseotsad olid ultraheliga töödeldud vastavalt 10 ja 20ndateks. Täiustatud protokolli transformatsiooniefektiivsus registreeriti vastavalt 66,5 ja 59,5% lehtede ja võrsete otsade eksplantaatide puhul. Võrreldes teiste protokollidega leiti, et selle täiustatud protokolli transformatsioonitõhusus oli lehtede puhul 2,5 korda suurem ja tulistamisotste puhul 3,7 korda suurem. Southern blot analüüsid kinnitasid 1–2 koopiat gusA transgeenist liinidel W1-W4, samas kui täiustatud protokolliga genereeritud reas W5 tuvastati 1–4 transgeenset koopiat.

Ultrahelitöötluse abil agrobakteri vahendatud transformatsiooni (SAAT) kestuse mõju W. somnifera lehe (a) ja tulistamisotsa (b) eksplantaatide transformatsioonisagedusele
(uuring ja graafik: © Dehdashti et al., 2016)

Puuvilla ultraheli abil muundamine

(2007) näitavad ultrahelitöötlusega puuvilla transformatsiooni kasulikku mõju. Madala sagedusega ultraheli põhjustatud akustiline kavitatsioon tekitab mikrohaavu taimekoe pinnale ja selle alla (sonoporatsioon) ning võimaldab Agrobacteriumil liikuda sügavamale ja täielikult kogu taime koes. See haavav mood suurendab tõenäosust, et nakatatakse sügavamal koes asuvaid taimerakke. SAAT-i transformatsiooniefektiivsuse hindamiseks mõõdeti GUS geeniekspressiooni. GUS reporterisüsteem on reporteri geenisüsteem, mis on eriti kasulik taimede molekulaarbioloogias ja mikrobioloogias. Erinevate SAAT-parameetrite kohandamisel paranes oluliselt GUS-i mööduv ekspressioon puuvillas, kasutades küpseid embrüoid eksplantaadina. GUS avastati esmakordselt 24h pärast eksplantaatide inkubeerimist ja 48h jooksul oli GUS-i ekspressioon väga intensiivne, mis oli kasulik näitaja puuvilla eksplantaadi eduka transformatsiooni kohta pärast ultrahelitöötlust abistatud Agrobacterium vahendatud transformatsioon (SAAT). Erinevate transformatsioonitehnikate (nimelt biolistiline, Agro, BAAT, SAAT), ultrahelitöötlusega toetatud Agrobacterium-vahendatud transformatsiooni (SAAT) võrdlus näitas kaugelt parimaid transformatsiooni tulemusi.

Transformatsiooniprotseduuri valik GUS-i mööduva ekspressiooni alusel. Sonikatsiooni abil Agrobacterium-vahendatud transformatsioon (SAAT) näitab oluliselt suuremat mööduvat ekspressiooni.
(uuring ja graafik: © Hussain et al., 2007)

Suure jõudlusega ultraheli lahendused sonoporatsiooni ja SAAT-i jaoks

Hielscher Ultrasonics on pikaajaline kogemus suure jõudlusega ultrasonikaatorite arendamisel ja tootmisel laboritele, uurimisrajatistele ja väga suure läbilaskevõimega tööstustoodangule. Mikrobioloogia ja eluteaduse jaoks pakub Hielscher erinevaid lahendusi, et rahuldada erinevaid nõudeid, mis on vajalikud konkreetsete kudede ja nende ravi jaoks. Paljude proovide samaaegseks ultraheliuuringuks pakub Hielscher UIP400MTP mitmekihiliste plaatide jaoks, VialTweeter kuni 10 viaali (nt Eppendorfi torude) ultrahelitöötluseks või ultraheli CupHorn. Sondi tüüpi ultrasonikaatorid on saadaval 50 kuni 400 vatti laboratoorsete homogenisaatoritena, samas kui tööstussüsteemid katavad võimsusvahemikku 500 vatti kuni 16 kW.
Palun võtke meiega ühendust ja andke meile teada oma taotlus- ja protsessinõuetest. Meie kogenud töötajad soovitavad hea meelega teie bioloogilise protsessi jaoks kõige sobivamat ultrasonikaatorit.
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: