Preparación de liposomas por ultrasonidos

Los liposomas producidos por ultrasonidos presentan una eficiencia de atrapamiento muy elevada, una alta capacidad de carga y una forma esférica de tamaño pequeño y uniforme. Por ello, los liposomas producidos por ultrasonidos ofrecen una excelente biodisponibilidad. Hielscher Ultrasonics ofrece ultrasonicadores para la producción fiable de liposomas de calidad farmacéutica por lotes y en modo continuo.

Ventajas de la producción de liposomas por ultrasonidos

La encapsulación liposomal por ultrasonidos es una técnica que utiliza energía ultrasónica para encapsular fármacos u otros agentes terapéuticos dentro de liposomas. En comparación con otros métodos de encapsulación liposomal, la encapsulación por ultrasonidos presenta varias ventajas que la convierten en una técnica de producción superior.

• Alta carga y elevada eficiencia de atrapamiento: La producción de liposomas por ultrasonidos es bien conocida por generar liposomas con una alta carga de principios activos, como vitamina C, moléculas de fármacos, etc. Al mismo tiempo, el método de sonicación presenta una elevada eficiencia de atrapamiento. Esto significa que un alto porcentaje de la sustancia activa queda encapsulado mediante ultrasonidos. En consecuencia, los ultrasonidos constituyen un método muy eficiente para la producción de liposomas.
• Liposomas de tamaño pequeño y uniforme: Una ventaja de la encapsulación liposomal por ultrasonidos es su capacidad para producir liposomas muy uniformes con una distribución estrecha de tamaños. La energía ultrasónica puede utilizarse para fragmentar liposomas grandes o agregados lipídicos y convertirlos en liposomas más pequeños y uniformes. Esto proporciona una mayor uniformidad en el tamaño y la forma de los liposomas, lo que puede ser importante en aplicaciones de administración de fármacos en las que el tamaño de las partículas puede influir en su farmacocinética y eficacia.
• Aplicable a cualquier molécula: Otra ventaja de la encapsulación liposomal por ultrasonidos es su capacidad para encapsular una amplia variedad de fármacos y otros agentes terapéuticos. La técnica puede utilizarse para encapsular tanto fármacos hidrófilos como hidrófobos, lo que puede resultar difícil con otros métodos. Además, la energía ultrasónica puede emplearse para encapsular macromoléculas y nanopartículas que pueden ser demasiado grandes para encapsularlas mediante otros métodos.
• Rapidez y fiabilidad: La encapsulación liposomal por ultrasonidos también es un proceso relativamente sencillo y rápido. No requiere el uso de sustancias químicas agresivas ni de altas temperaturas, que pueden perjudicar a los agentes terapéuticos que se encapsulan.
• Escalado: Además, la técnica puede escalarse fácilmente para la producción a gran escala, lo que la convierte en una opción rentable para aplicaciones de administración de fármacos.

En resumen, la encapsulación liposomal por ultrasonidos es una técnica superior de encapsulación liposomal por su capacidad para producir liposomas uniformes con una distribución estrecha de tamaños y encapsular una amplia variedad de agentes terapéuticos, así como por su sencillez y escalabilidad.

Tras la formación de una película lipídica y su posterior rehidratación, se utiliza la sonicación para favorecer el atrapamiento de principios activos en el liposoma. Además, la sonicación permite alcanzar el tamaño de liposoma deseado.

Preparación de liposomas por ultrasonidos para productos farmacéuticos y cosméticos

Los liposomas (vesículas de base lipídica), los transfersomas (liposomas ultradeformables), los etosomas (vesículas ultradeformables con un alto contenido de alcohol) y los niosomas (vesículas sintéticas) son vesículas microscópicas que pueden prepararse artificialmente como transportadores globulares en los que se pueden encapsular moléculas activas. Estas vesículas, con diámetros de entre 25 y 5000 nm, se utilizan con frecuencia como transportadores de fármacos en las industrias farmacéutica y cosmética, en aplicaciones como la administración oral o tópica de fármacos, la terapia génica y la inmunización. El tratamiento por ultrasonidos es un método científicamente demostrado para la producción de liposomas con una elevada eficiencia. Los ultrasonicadores Hielscher producen liposomas con altas cargas de principios activos y una biodisponibilidad superior.

Liposomas y formulación liposomal

Los liposomas son sistemas vesiculares unilamelares, oligolamelares o multilamelares y están compuestos por el mismo material que una membrana celular (bicapa lipídica). Según su composición y tamaño, se distinguen los siguientes tipos de liposomas:

• vesículas multilamelares (MLV, 0,1-10 μm)
• vesículas unilamelares pequeñas (SUV, <100 nm)
• vesículas unilamelares grandes (LUV, 100–500 nm)
• vesículas unilamelares gigantes (GUV, ≥1 μm)

La estructura principal de los liposomas está formada por fosfolípidos. Los fosfolípidos tienen un grupo de cabeza hidrófilo y un grupo de cola hidrófobo, formado por una larga cadena hidrocarbonada.
La membrana del liposoma tiene una composición muy similar a la de la barrera cutánea, por lo que los liposomas pueden integrarse fácilmente en la piel humana. Al fusionarse con la piel, pueden liberar los agentes atrapados directamente en su destino, donde los principios activos pueden cumplir sus funciones. De este modo, los liposomas mejoran la penetrabilidad y la permeabilidad de la piel para los agentes farmacéuticos y cosméticos atrapados. También los liposomas sin agentes encapsulados, es decir, las vesículas vacías, son potentes principios activos para la piel, ya que la «phosphatidylcholin» incorpora dos componentes esenciales que el organismo humano no puede producir por sí mismo: el ácido linoleico y la colina.
Los liposomas se utilizan como transportadores biocompatibles de fármacos, péptidos, proteínas, «plasmic DNA», oligonucleótidos antisentido o ribozimas con fines farmacéuticos, cosméticos y bioquímicos. La enorme versatilidad del tamaño de partícula y de los parámetros físicos de los lípidos ofrece un atractivo potencial para desarrollar vehículos a medida para una amplia variedad de aplicaciones. (Ulrich 2002)

Formación de liposomas por ultrasonidos

Los liposomas pueden formarse mediante ultrasonidos. El material básico para la preparación de liposomas son moléculas «amphilic» derivadas de los lípidos de las membranas biológicas o basadas en ellos. Para formar vesículas unilamelares pequeñas (SUV), la dispersión lipídica se somete a una sonicación suave –por ejemplo, con el dispositivo ultrasónico de mano UP50H (50 W, 30 kHz), el VialTweeter o el reactor ultrasónico CupHorn– en un baño de hielo. Este tratamiento ultrasónico dura aproximadamente 5 – 15 minutos. Otro método para producir vesículas unilamelares pequeñas consiste en sonicar liposomas de vesículas multilamelares.
Dinu-Pirvu et al. (2010) describen la obtención de transfersomas mediante la sonicación de MLV a temperatura ambiente.
Hielscher Ultrasonics ofrece diversos dispositivos ultrasónicos, sonotrodos y accesorios, por lo que puede proporcionar la configuración ultrasónica más adecuada para una encapsulación liposomal muy eficiente a cualquier escala.

Encapsulación de sustancias activas en liposomas mediante ultrasonidos

Los liposomas actúan como transportadores de principios activos, como vitaminas, moléculas terapéuticas, péptidos, etc. Los ultrasonidos son una herramienta eficaz para preparar y formar liposomas destinados al atrapamiento de agentes activos. Al mismo tiempo, la sonicación favorece el proceso de encapsulación y atrapamiento, de modo que se producen liposomas con una alta carga de principios activos. Antes de la encapsulación, los liposomas tienden a formar agrupaciones debido a la interacción entre las cargas superficiales de las cabezas polares de los fosfolípidos (véase Míckova et al. 2008); además, es necesario abrirlos. Por ejemplo, Zhu et al. (2003) describen la encapsulación de biotina en polvo en liposomas mediante ultrasonidos. Tras añadir la biotina en polvo a la solución de suspensión de vesículas, se sonicó la solución. Después de este tratamiento, la biotina quedó atrapada en los liposomas.
¡Más información sobre la encapsulación por ultrasonidos de «peptrides» GLP-1 (p. ej., semaglutida) en liposomas!

Emulsiones liposomales mediante ultrasonidos

Para potenciar el efecto nutritivo de las cremas hidratantes o antienvejecimiento, las lociones, los geles y otras formulaciones cosmecéuticas, se añaden emulsionantes a las dispersiones liposomales para estabilizar mayores cantidades de lípidos. Sin embargo, las investigaciones han demostrado que la capacidad de los liposomas suele ser limitada. Con la adición de emulsionantes, esta limitación se manifiesta antes, y los emulsionantes adicionales debilitan la afinidad de la fosfatidilcolina por la barrera cutánea. Las nanopartículas –compuestas por fosfatidilcolina y lípidos– son la respuesta a este problema. Estas nanopartículas están formadas por una gota de aceite recubierta por una monocapa de fosfatidilcolina. El uso de nanopartículas permite obtener formulaciones capaces de incorporar más lípidos y mantenerse estables, de modo que no se necesitan emulsionantes adicionales.
El tratamiento por ultrasonidos es un método probado para la producción de nanoemulsiones y nanodispersiones. Los ultrasonidos de alta intensidad proporcionan la potencia necesaria para dispersar una fase líquida (fase dispersa) en pequeñas gotas dentro de una segunda fase (fase continua). En la zona de dispersión, la implosión de las burbujas de cavitación genera intensas ondas de choque en el líquido circundante y da lugar a la formación de chorros de líquido a alta velocidad. Para estabilizar las gotas recién formadas de la fase dispersa frente a la coalescencia, se añaden emulsionantes (sustancias con actividad superficial, tensioactivos) y estabilizantes a la emulsión. Dado que la coalescencia de las gotas tras su ruptura influye en la distribución final de tamaños de gota, se utilizan emulsionantes con una capacidad estabilizante eficaz para mantener la distribución final de tamaños de gota al mismo nivel que la distribución inmediatamente posterior a la ruptura de las gotas en la zona de dispersión ultrasónica.

Dispersiones liposomales mediante ultrasonidos

Las dispersiones liposomales basadas en «phosphatidylchlorine» insaturada presentan una baja estabilidad frente a la oxidación. La dispersión puede estabilizarse mediante antioxidantes, como un complejo de vitaminas C y E.
 

Formación de liposomas mediante el método de evaporación en fase inversa con sonicación

 
Ortan et al. (2002) obtuvieron buenos resultados en su estudio sobre la preparación por ultrasonidos de aceite esencial de Anethum graveolens en liposomas. Después de la sonicación, el tamaño de los liposomas se situó entre 70-150 nm, y el de las MLV entre 230-475 nm; estos valores se mantuvieron aproximadamente constantes incluso después de 2 meses, pero aumentaron después de 12 meses, especialmente en la dispersión de SUV (véanse los histogramas a continuación). La medición de la estabilidad, en cuanto a la pérdida de aceite esencial y la distribución de tamaños, también mostró que las dispersiones liposomales mantuvieron el contenido de aceite volátil. Esto sugiere que el atrapamiento del aceite esencial en liposomas aumentó la estabilidad del aceite.

Ortan et al. (2009): Estabilidad de las dispersiones de MLV y SUV después de 1 año. Las formulaciones liposomales se almacenaron a 4±1 ºC.

Los procesadores ultrasónicos Hielscher son los dispositivos ideales para aplicaciones en las industrias cosmética y farmacéutica. Los sistemas compuestos por varios procesadores ultrasónicos de hasta 16.000 vatios (dieciséis mil vatios) cada uno proporcionan la capacidad necesaria para convertir esta aplicación de laboratorio en un método de producción eficiente que permita obtener emulsiones finamente dispersas en flujo continuo o por lotes –con resultados comparables a los de los mejores homogeneizadores de alta presión disponibles actualmente, como los de válvulas de orificio–. Además de esta elevada eficiencia en la emulsificación continua, los dispositivos ultrasónicos Hielscher requieren muy poco mantenimiento y son muy fáciles de manejar y limpiar. Los ultrasonidos también favorecen la limpieza y el enjuague. La potencia ultrasónica es ajustable y puede adaptarse a productos específicos y a los requisitos de emulsificación. También se dispone de reactores especiales de celda de flujo que cumplen los exigentes requisitos de CIP (limpieza in situ) y SIP (esterilización in situ).

Preguntas frecuentes sobre los liposomas

¿Qué tipos de liposomas se distinguen?

Los liposomas se clasifican en distintos tipos según su tamaño y el número de bicapas que contienen. Estas categorías incluyen:

• Vesículas unilamelares pequeñas (SUV): Son los liposomas más pequeños y tienen una única bicapa lipídica.
• Vesículas unilamelares grandes (LUV): Son más grandes que las SUV y también tienen una única bicapa.
• Vesículas multilamelares (MLV): Contienen múltiples bicapas concéntricas.
• Vesículas multivesiculares (MVV): Están compuestas por múltiples vesículas más pequeñas dentro de una vesícula de mayor tamaño.

 
Otros tipos especializados incluyen:

• Liposomas PEGilados: Liposomas modificados con polietilenglicol (PEG) para mejorar la estabilidad y el tiempo de circulación.
• Nanoliposomas: Liposomas muy pequeños, utilizados habitualmente para la administración dirigida de fármacos.

¿Qué estructuras vesiculares pueden presentar los liposomas?

Los liposomas también se clasifican según su estructura vesicular en siete tipos principales:

• Vesículas multilamelares grandes (MLV): Contienen múltiples bicapas.
• Vesículas oligolamelares (OLV): Tienen unas pocas bicapas.
• Vesículas unilamelares pequeñas (SUV): Son las más pequeñas y tienen una única bicapa.
• Vesículas unilamelares de tamaño mediano (MUV): Tienen un tamaño intermedio y una única bicapa.
• Vesículas unilamelares grandes (LUV): Son más grandes y tienen una única bicapa.
• Vesículas unilamelares gigantes (GUV): Son muy grandes y tienen una única bicapa.
• Vesículas multivesiculares (MVV): Contienen múltiples vesículas dentro de una única vesícula grande.

¿Cuáles son las diferencias entre los liposomas y los niosomas?

Los liposomas y los niosomas se diferencian principalmente en su composición:
Liposomas: Están formados por fosfolípidos de doble cadena, que pueden ser neutros o estar cargados.
Niosomas: Están formados por tensioactivos de cadena única sin carga y colesterol.
Ambas estructuras se forman mediante sonicación, que favorece el ensamblaje de las vesículas de bicapa.

¿Cuál es el tamaño ideal de un liposoma?

Para la administración de agentes terapéuticos, el tamaño ideal de un liposoma se sitúa teóricamente entre 50 y 200 nanómetros de diámetro. Este intervalo de tamaños optimiza la estabilidad y la biodisponibilidad. La sonicación se utiliza habitualmente para reducir la vesícula al tamaño deseado.

¿Pueden los liposomas transportar fármacos hidrófilos?

Sí, los liposomas pueden transportar fármacos hidrófilos. Son valorados en aplicaciones biomédicas por su capacidad para encapsular tanto agentes hidrófobos como hidrófilos. Además, ofrecen una elevada biocompatibilidad y biodegradabilidad, lo que los convierte en sistemas de administración eficaces.

¿Cómo se preparan los liposomas?

Las técnicas más habituales para preparar liposomas son el método de película delgada y el método de evaporación en fase inversa.
Método de hidratación de película delgada:

1. Disuelva los lípidos en un disolvente orgánico.
2. Evapore el disolvente para formar una película lipídica delgada.
3. Hidrate la película con una solución acuosa mediante sonicación para formar vesículas multilamelares.

Método de evaporación en fase inversa:

1. Disuelva los lípidos en agua y etanol.
2. Sonique la solución a 60 °C durante unos 10 minutos para crear una pasta lipídica.
3. Enfríe la suspensión lipídica y añada agua o una solución tampón gota a gota mientras agita.
4. Hidrate la suspensión durante 1 hora para formar vesículas multilamelares.
5. Reduzca el tamaño de los liposomas mediante una sonicación adicional.

¿Qué son los arqueosomas?

Los arqueosomas son liposomas elaborados a partir de lípidos de arqueas, conocidos por su estabilidad y resistencia a condiciones extremas. Estas propiedades hacen que los arqueosomas sean especialmente útiles para la administración de fármacos y el desarrollo de vacunas en entornos exigentes.

¿Cómo se preparan los arqueosomas?

Procedimiento de sonicación según Pise (2022): Los arqueosomas pueden elaborarse a partir de la fracción lipídica polar «PLF» de Sulfolobussolfataricus mediante sonicación a 60 °C, sin necesidad de un aporte externo de lípidos. A 0 °C, los lípidos polares de Sulfolobusacidocaldarius se sonicaron eficazmente para formar arqueosomas. Se prepararon arqueosomas cargados con BMD y liposomas convencionales, así como lípidos de arqueas aislados de Archaea H. salinarum y enriquecidos con fosfatidilcolina, mediante técnicas de sonicación. Se crearon vesículas sonicadas para la administración tópica mediante la sonicación de dispersiones de MLV al 80 por ciento de amplitud durante 4 minutos con un sonicador de sonda Hielscher UP50H (véase la imagen de la izquierda).

Bibliografía/Referencias

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.