Transformación genética de células vegetales mediante ultrasonidos

La transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) es un método eficaz para infectar células vegetales con genes exógenos utilizando Agrobacterium como transportador. La cavitación ultrasónica provoca sonoporación, que puede describirse como la generación selectiva de microlesiones en el tejido vegetal. A través de estas microlesiones generadas por ultrasonidos, el ADN y los vectores de ADN pueden transportarse eficazmente al interior de la matriz celular.

Sonoporación – Transformación celular mejorada mediante ultrasonidos

Cuando se aplican ultrasonidos de baja frecuencia (aprox. 20 kHz) a suspensiones celulares, los efectos de la cavitación acústica provocan una permeabilización transitoria de las membranas en los tejidos celulares. Este efecto ultrasónico se conoce como sonoporación y se utiliza para la transferencia de genes a células o tejidos.
Las ventajas del tratamiento con ultrasonidos se basan en su principio de funcionamiento mecánico no térmico, que suele hacer que la sonicación sea más versátil y dependa menos del tipo de célula. La versatilidad de la sonoporación abre la posibilidad de utilizar plantas transgénicas, que tienen un potencial considerable para la bioproducción de proteínas terapéuticas humanas complejas. Estos biorreactores basados en plantas pueden manipularse genéticamente con facilidad, evitan la posible contaminación con patógenos humanos, no dañan las bacterias que median la transformación (p. ej., Agrobacterium) y constituyen un método económico y eficaz de biosíntesis.

Transformación celular asistida por ultrasonidos

La sonicación es una técnica que aplica ondas ultrasónicas de baja frecuencia para agitar partículas en solución y mezclar soluciones, aumentando así la velocidad de transferencia de masa y de disolución. Al mismo tiempo, la sonicación puede eliminar los gases disueltos en los líquidos. En la transformación de plantas, la sonicación provoca la formación de microlesiones en el tejido vegetal y mejora la introducción de ADN desnudo en el protoplasto vegetal.

Para la transformación genética, la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) es el método preferido y tiene una eficiencia significativamente mayor que la sonicación utilizada para transferir ADN desnudo y vectores de ADN directamente al protoplasto. Numerosos estudios han demostrado que la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) puede utilizarse para inducir la ruptura mecánica y la formación de lesiones en las células vegetales mediante ondas ultrasónicas y la cavitación acústica resultante. Un tratamiento ultrasónico breve genera microlesiones en la superficie de los explantes. Las células lesionadas permiten la penetración de Agrobacterium en las zonas más profundas de los tejidos vegetales, lo que aumenta la probabilidad de infección de las células vegetales. Además, los compuestos fenólicos secretados favorecen la transformación. Las microlesiones generadas por ultrasonidos también facilitan la penetración de las bacterias en los explantes. La SAAT se ha utilizado con éxito para la transformación genética de especies vegetales consideradas especialmente resistentes a Agrobacterium.
Las principales ventajas de la SAAT son su sencillez, su bajo coste y la mejora significativa de la transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Además de su aplicación satisfactoria en la transformación de Chenopodium rubrum L. y Beta vulgaris L., este enfoque también se ha aplicado a la producción en Nicotiana tabacum de holotoxina termolábil recombinante de Escherichia coli de tipo silvestre y de adyuvantes vacunales LT de Escherichia coli mutante, con los que se detectaron los títulos sistémicos más altos de IgG específica frente a LT-B en aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka y R. Baranski, 2014).

Procedimiento general para la transferencia de genes mediante sonoporación en células vegetales

1. Preparación del material genético: Comience preparando el material genético que desea introducir en las células vegetales. Puede tratarse de ADN plasmídico, ARN u otros ácidos nucleicos.
2. Aislamiento de las células vegetales: Aísle las células vegetales sobre las que desea actuar. Según el experimento, estas células pueden aislarse de tejidos o cultivos vegetales.
3. Suspensión celular: Suspenda las células vegetales en un medio o una solución tampón adecuados. Esto es esencial para garantizar que las células estén sanas y en un estado favorable para la captación de genes.
4. Configuración del sonicador: Prepare el sonicador de sonda ajustando previamente parámetros de sonicación como la amplitud, el tiempo, la energía y la temperatura. Sumerja la sonda ultrasónica en la suspensión celular.
5. Sonicación: Inicie el procedimiento de sonicación. La rápida oscilación de la punta de la sonda genera burbujas de cavitación en el líquido. Estas burbujas se expanden y colapsan debido a las ondas ultrasónicas, creando fuerzas mecánicas y microcorrientes en la suspensión.
6. Sonoporación: Las fuerzas mecánicas y las microcorrientes generadas por la cavitación crean poros y orificios temporales en las membranas de las células vegetales. El material genético presente en la suspensión puede entrar en las células vegetales a través de estos poros.
7. Incubación: Tras el tratamiento de sonoporación, incube las células vegetales para permitir que se recuperen y estabilicen sus membranas. Este paso es crucial para garantizar la supervivencia celular y una transferencia de genes satisfactoria.

Transferencia de genes mediante Agrobacterium o liposomas

Existen dos formas habituales de transfectar células vegetales. Utilizan agrobacterium, un género de bacterias gramnegativas, o liposomas como transportadores del material genético.

• Sonoporación mediada por Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens es una bacteria utilizada habitualmente en la ingeniería genética vegetal. En este método, se introduce ADN plasmídico que contiene el gen deseado en Agrobacterium, que después se mezcla con las células vegetales. La suspensión celular se somete a sonoporación mediante un sonicador de sonda. La energía ultrasónica mejora la transferencia del material genético de Agrobacterium a las células vegetales. Este método se utiliza ampliamente para la modificación genética de plantas.
• Sonoporación mediada por liposomas: Los liposomas son vesículas lipídicas que pueden transportar material genético. En este método, los liposomas cargados con ADN plasmídico u otros ácidos nucleicos se mezclan con las células vegetales. Se emplea la sonoporación mediante un sonicador de sonda para facilitar la captación de los liposomas por las células vegetales. Los ultrasonidos alteran las bicapas lipídicas de los liposomas, liberando el material genético en las células vegetales. Este enfoque resulta útil para los estudios de expresión génica transitoria en células vegetales.

Beneficios científicamente demostrados de la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT)

La transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) se ha aplicado a numerosas especies vegetales. Un tratamiento ultrasónico breve y relativamente suave de los cultivos de células vegetales provoca sonoporación, que posteriormente permite una penetración profunda de Agrobacterium como transportador de genes. A continuación se presentan estudios que ilustran los efectos beneficiosos de la SAAT.

Transformación de ashwagandha asistida por ultrasonidos

Con el fin de mejorar la eficiencia de transformación en W. somnifera (conocida como ashwagandha o cereza de invierno), Dehdashti y sus colaboradores (2016) investigaron el uso de acetosiringona (AS) y sonicación.
Se añadió acetosiringona (AS) en tres etapas: cultivo líquido de Agrobacterium, infección por Agrobacterium y cocultivo de explantes con Agrobacterium. Se determinó que la adición de 75 μM de AS al cultivo líquido de Agrobacterium era óptima para la inducción de los genes vir.
La aplicación adicional de sonicación (SAAT) dio lugar a la máxima expresión génica. La expresión del gen gusA en las raíces pilosas fue óptima cuando las hojas y los ápices de los brotes se sonicaron durante 10 y 20s, respectivamente. La eficiencia de transformación registrada con el protocolo mejorado fue de 66,5 y 59,5% para los explantes de hojas y de ápices de brotes, respectivamente. En comparación con otros protocolos, la eficiencia de transformación de este protocolo mejorado fue 2,5 veces mayor para las hojas y 3,7 veces mayor para los ápices de los brotes. Los análisis de Southern blot confirmaron 1–2 copias del transgén gusA en las líneas W1-W4, mientras que se detectaron 1–4 copias del transgén en la línea W5 generada mediante el protocolo mejorado.

Efecto de la duración de la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) sobre la frecuencia de transformación de explantes de hojas (a) y de ápices de brotes (b) de W. somnifera
(estudio y gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformación del algodón asistida por ultrasonidos

Hussain et al. (2007) demuestran los efectos beneficiosos de la transformación del algodón asistida por sonicación. La cavitación acústica provocada por los ultrasonidos de baja frecuencia genera microlesiones en la superficie del tejido vegetal y por debajo de ella (sonoporación), y permite que Agrobacterium penetre más profundamente y se desplace por todo el tejido vegetal. Esta forma de generar lesiones aumenta la probabilidad de infectar células vegetales situadas en las zonas más profundas del tejido. Para evaluar la eficiencia de transformación de la SAAT, se midió la expresión del gen GUS. El sistema indicador GUS es un sistema de genes indicadores especialmente útil en biología molecular vegetal y microbiología. Al ajustar diversos parámetros de la SAAT, se mejoró significativamente la expresión transitoria de GUS en algodón utilizando embriones maduros como explantes. GUS se detectó por primera vez 24h después de la incubación de los explantes y, a las 48h, su expresión era muy intensa, lo que sirvió como indicador útil de la transformación satisfactoria del explante de algodón tras la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT). En la comparación de diversas técnicas de transformación (concretamente, biolística, Agro, BAAT y SAAT), la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) mostró, con diferencia, los mejores resultados de transformación.

Selección del procedimiento de transformación en función de la expresión transitoria de GUS. La transformación mediada por Agrobacterium y asistida por sonicación (SAAT) muestra una expresión transitoria significativamente mayor.
(estudio y gráfico: © Hussain et al., 2007)

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