Transformación genética en células vegetales mediante ultrasonidos

La transformación asistida por agrobacterias (SAAT) es un método eficaz para infectar células vegetales con genes extraños utilizando Agrobacterium como transportador. La cavitación ultrasónica provoca la sonoporación, que puede describirse como una microherida dirigida al tejido vegetal. A través de estas microheridas creadas por ultrasonidos, el ADN y los vectores de ADN pueden ser transportados eficazmente a la matriz celular.

sonoporación – Transformación celular mejorada por ultrasonidos

El ultrasonido UP100H es un homogeneizador de laboratorio que suele utilizarse para la preparación de muestras en placas de cultivo celular.Cuando se aplican ultrasonidos de baja frecuencia (aproximadamente 20kHz) a suspensiones celulares, los efectos de la cavitación acústica provocan una permeabilización transitoria de la membrana en los tejidos celulares. Este efecto ultrasónico se conoce como sonoporación y se utiliza para la transferencia de genes a células o tejidos.
Las ventajas de la ultrasonicación se basan en su principio de funcionamiento mecánico no térmico, que hace que la sonicación sea a menudo más versátil y menos dependiente de los tipos de células. La aplicación versátil de la sonoporación abre la posibilidad de utilizar plantas transgénicas, que tienen un importante potencial en la bioproducción de proteínas terapéuticas humanas complejas. Estos biorreactores basados en plantas pueden ser fácilmente manipulados genéticamente, evitan la posible contaminación con patógenos humanos, no dañan las bacterias mediadoras de la transformación (por ejemplo, Agrobacterium) y son un método barato y eficaz de biosíntesis.

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Ultrasonicator UP200St, un potente ultrasonido tipo sonda de 200 vatios para genética, microbiología y transformación celular

Ultrasonidos UP200St (200W, 26kHz) con caja de resonancia

El vídeo muestra el sistema de preparación de muestras por ultrasonidos UIP400MTP, que permite la preparación fiable de muestras en cualquier placa multipocillo estándar mediante ultrasonidos de alta intensidad. Las aplicaciones típicas del UIP400MTP incluyen la lisis celular, el cizallamiento de ADN, ARN y cromatina, así como la extracción de proteínas.

Ultrasonidos UIP400MTP para la sonicación de placas multipozo

Transformación celular asistida por ultrasonidos

Los ultrasonidos de tipo sonda, como el UP200St, son homogeneizadores de tejidos fiables y ampliamente utilizados para la preparación de muestras en genética, por ejemplo, para la transformación asistida por sonicación de Agrobacterium (SAAT).La sonicación es una técnica que aplica ondas de ultrasonido de baja frecuencia para agitar las partículas en la solución, para mezclar las soluciones, aumentando así la tasa de transferencia de masa y disolución. Al mismo tiempo, la sonicación puede eliminar los gases disueltos en los líquidos. En la transformación de plantas, la sonicación provocará la formación de microheridas en el tejido vegetal y mejorará la entrega de ADN desnudo en el protoplasto de la planta.

Para la transformación genética, la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) es el método preferido y tiene una eficacia significativamente mayor que la sonicación utilizada para transferir ADN desnudo y vectores de ADN directamente al protoplasto. Numerosos estudios han demostrado que la transformación mediada por Agrobacterium (SAAT) asistida por sonicación puede utilizarse para inducir la disrupción mecánica y la formación de heridas en las células vegetales mediante ondas ultrasónicas y la cavitación acústica resultante. Un breve tratamiento ultrasónico crea microheridas en la superficie de los explantes. Las células heridas permitirán la penetración de Agrobacterium en la parte más profunda de los tejidos de la planta, aumentando así la probabilidad de que las células de la planta sean infectadas. Además, los compuestos fenólicos secretados potencian la transformación. Las microheridas generadas por ultrasonidos hacen también más factible la penetración de las bacterias en los explantes. El SAAT se utilizó con éxito para la transformación genética en especies de plantas particularmente consideradas como resistentes a Agrobacterium.
Las principales ventajas de la SAAT son su sencillez y su bajo coste, así como la mejora significativa de la transferencia genética mediada por Agrobacterium. Aparte de la aplicación exitosa de SAAT en la transformación de Chenopodium rubrum L. y Beta vulgaris L., este enfoque también se ha aplicado en la producción de holotoxina termolábil recombinante de Escherichia coli de tipo salvaje y de adyuvantes de vacunas LT mutantes de Escherichia coli en Nicotiana tabacum, en los que se detectaron los títulos más altos de IgG sistémica LT-B específica en aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka y R. Baranski, 2014)

El VialTweeter puede utilizarse para la infección de ADN de células planas, por ejemplo, mediante la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT)

VialTweeter para la sonicación simultánea de varios tubos de muestras, por ejemplo, para la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT)

Beneficios científicamente probados de la transformación asistida por agrobacterias (SAAT)

La transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) se ha aplicado a numerosas especies vegetales. Un tratamiento ultrasónico breve y relativamente suave de los cultivos de células vegetales provoca la sonoporación, que posteriormente permite una penetración profunda de Agrobacterium como transportador de genes. A continuación puede leer estudios ejemplares que demuestran los efectos beneficiosos de la SAAT.

Transformación asistida por ultrasonidos de la Ashwagandha

Para mejorar la eficiencia de la transformación en W. somnifera (conocida como ashwagandha o cereza de invierno), Dehdashti y sus colegas (2016) investigaron el uso de acetosiringona (AS) y la sonicación.
Se añadió acetosiringona (AS) en tres etapas: Cultivo líquido de Agrobacterium, infección de Agrobacterium y co-cultivo de explantes con Agrobacterium. La adición de 75 μM de AS al cultivo líquido de Agrobacterium resultó ser óptima para la inducción de los genes vir.
La aplicación adicional de sonicación (SAAT) dio lugar a la mayor expresión génica. La expresión del gen gusA en las raíces peludas fue mejor cuando las hojas y las puntas de los brotes fueron sonicadas durante 10 y 20 segundos, respectivamente. La eficiencia de transformación del protocolo mejorado se registró en un 66,5 y un 59,5% en el caso de los explantes de hojas y puntas de brotes, respectivamente. En comparación con otros protocolos, la eficiencia de transformación de este protocolo mejorado fue 2,5 veces mayor en el caso de las hojas y 3,7 veces más en las puntas de los brotes. Los análisis de Southern blot confirmaron 1-2 copias del transgén gusA en las líneas W1-W4, mientras que se detectaron 1-4 copias del transgén en la línea W5 generada por el protocolo mejorado.

La duración de la sonicación (tiempo de exposición a los ultrasonidos) afecta a la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) en la transformación en W. somnifera

Efecto de la duración de la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) sobre la frecuencia de transformación de los explantes de hoja (a) y punta de brote (b) de W. somnifera
(estudio y gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

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Transformación del algodón asistida por ultrasonidos

Hussain et al. (2007) demuestran los efectos beneficiosos de la transformación del algodón asistida por sonicación. La cavitación acústica causada por los ultrasonidos de baja frecuencia crea microheridas en la superficie del tejido vegetal y por debajo de ella (sonoporación) y permite que Agrobacterium se desplace a mayor profundidad y por completo a través del tejido vegetal. Esta forma de herir aumenta la probabilidad de infectar las células vegetales que se encuentran a mayor profundidad en el tejido. Para evaluar la eficacia de la transformación de SAAT, se midió la expresión del gen GUS. El sistema reportero GUS es un sistema de genes reporteros, particularmente útil en la biología molecular de las plantas y en la microbiología. Ajustando varios parámetros del SAAT, la expresión transitoria de GUS en el algodón utilizando embriones maduros como explante aumentó significativamente. GUS se detectó por primera vez a las 24 horas de la incubación de los explantes y a las 48 horas, la expresión de GUS era muy intensa, lo que sirvió como indicador útil de la transformación exitosa del explante de algodón tras la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT). La comparación de varias técnicas de transformación (a saber, biolística, Agro, BAAT, SAAT), la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) mostró con mucho los mejores resultados de transformación.

La transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) muestra una expresión transitoria significativamente mayor en comparación con los métodos de infección alternativos.

Elección del procedimiento de transformación en función de la expresión transitoria de GUS. La transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) muestra una expresión transitoria significativamente mayor.
(estudio y gráfico: © Hussain et al., 2007)

Soluciones ultrasónicas de alto rendimiento para la sonoporación y el SAAT

Hielscher Ultrasonics cuenta con una larga experiencia en el desarrollo y la fabricación de ultrasonidos de alto rendimiento para laboratorios, instalaciones de investigación y producción industrial con rendimientos muy elevados. Para la microbiología y las ciencias de la vida, Hielscher ofrece varias soluciones que se adaptan a los diferentes requisitos necesarios para tejidos específicos y sus tratamientos. Para la ultrasonificación simultánea de numerosas muestras, Hielscher ofrece el UIP400MTP para placas multipocillo, el VialTweeter para la sonicación de hasta 10 viales (por ejemplo, tubos Eppendorf) o el CupHorn ultrasónico. Los ultrasonidos tipo sonda están disponibles desde 50 hasta 400 vatios como homogeneizadores de laboratorio, mientras que los sistemas industriales cubren el rango de potencia desde 500 vatios hasta 16kW.
Póngase en contacto con nosotros y háganos saber los requisitos de su aplicación y proceso. Nuestro experimentado personal estará encantado de recomendarle el ultrasonido más adecuado para su proceso biológico.
En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
placas multipocillos/microtitulación n.a. UIP400MTP
hasta 10 viales n.a. VialTweeter
hasta 5 viales/tubos o 1 recipiente más grande n.a. CupHorn
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Los homogeneizadores de alto cizallamiento por ultrasonidos se utilizan en el laboratorio, en la mesa de trabajo, en los procesos piloto y en la industria.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.



Literatura / Referencias


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.