Transformación genética de células vegetales mediante ultrasonidos

La transformación asistida por Agrobacterium mediante sonicación (SAAT) es un método eficaz para infectar células vegetales con genes extraños utilizando Agrobacterium como transportador. La cavitación ultrasónica provoca la sonoporación, que puede describirse como microheridas selectivas en el tejido vegetal. A través de estas microheridas creadas por ultrasonidos, el ADN y los vectores de ADN pueden transportarse eficazmente a la matriz celular.

sonoporación – Transformación celular potenciada por ultrasonidos

Cuando se aplican ultrasonidos de baja frecuencia (unos 20 kHz) a suspensiones celulares, los efectos de la cavitación acústica provocan una permeabilización transitoria de la membrana en los tejidos celulares. Este efecto ultrasónico se conoce como sonoporación y se utiliza para la transferencia de genes a células o tejidos.
Las ventajas de la ultrasonicación se basan en su principio de funcionamiento mecánico no térmico, que hace que la sonicación sea a menudo más versátil y menos dependiente de los tipos de células. La aplicación versátil de la sonoporación abre la posibilidad a la utilización de plantas transgénicas, que tienen un potencial significativo en la bioproducción de proteínas terapéuticas humanas complejas. Estos biorreactores basados en plantas pueden manipularse genéticamente con facilidad, evitan la posible contaminación con patógenos humanos, no dañan las bacterias mediadoras de la transformación (por ejemplo, Agrobacterium) y constituyen un método barato y eficaz de biosíntesis.

Transformación celular asistida por ultrasonidos

La sonicación es una técnica que aplica ondas ultrasónicas de baja frecuencia para agitar partículas en solución, mezclar soluciones y aumentar así la velocidad de transferencia de masa y disolución. Al mismo tiempo, la sonicación puede eliminar los gases disueltos en los líquidos. En la transformación de plantas, la sonicación provocará la formación de microheridas en el tejido vegetal y mejorará el suministro de ADN desnudo al protoplasto de la planta.

Para la transformación genética, la transformación asistida por sonicación mediada por Agrobacterium (SAAT) es el método preferido y tiene una eficacia significativamente mayor que la sonicación utilizada para transferir ADN desnudo y vectores de ADN directamente al protoplasto. Numerosos estudios han demostrado que la transformación mediada por Agrobacterium (SAAT) asistida por sonicación puede utilizarse para inducir la disrupción mecánica y la formación de heridas en las células vegetales mediante ondas ultrasónicas y la cavitación acústica resultante. Un breve tratamiento ultrasónico crea microheridas en la superficie de los explantes. Las células heridas permitirán la penetración de Agrobacterium en la parte más profunda de los tejidos vegetales, aumentando así la probabilidad de que las células vegetales sean infectadas. Además, los compuestos fenólicos secretados potencian la transformación. Las microheridas generadas por ultrasonidos hacen también más factible la penetración de las bacterias en los explantes. SAAT se utilizó con éxito para la transformación genética en especies de plantas particularmente consideradas como resistentes a Agrobacterium.
Las principales ventajas del SAAT son su sencillez y bajo coste, así como la mejora significativa de la transferencia génica mediada por Agrobacterium. Aparte de la aplicación con éxito de SAAT en la transformación de Chenopodium rubrum L. y Beta vulgaris L., este enfoque también se ha aplicado en la producción de holotoxina termolábil recombinante de Escherichia coli de tipo salvaje y adyuvantes de vacunas LT mutantes de Escherichia coli en Nicotiana tabacum, en las que se detectaron los títulos más altos de IgG sistémica LT-B específica en aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka y R. Baranski, 2014).

Procedimiento general para la transferencia de genes mediante sonoporación en células vegetales

1. Preparación del material genético: Comience preparando el material genético que desea introducir en las células vegetales. Puede ser ADN plasmídico, ARN u otros ácidos nucleicos.
2. Aislamiento de células vegetales: Aísle las células vegetales que desea tratar. Dependiendo de su experimento, estas células pueden aislarse de tejidos o cultivos vegetales.
3. Suspensión celular: Suspender las células vegetales en un medio o tampón adecuado. Esto es esencial para garantizar que las células estén sanas y en un estado propicio para la absorción del gen.
4. Configure su Sonicator: Prepare su sonicador tipo sonda preajustando los parámetros de sonicación, como la amplitud, el tiempo, la energía y la temperatura. Sumerja la sonda ultrasónica en la suspensión celular.
5. Sonicación: Inicie el procedimiento de sonicación. La rápida oscilación de la punta de la sonda genera burbujas de cavitación en el líquido. Estas burbujas se expanden y colapsan debido a las ondas ultrasónicas, creando fuerzas mecánicas y microcorrientes en la suspensión.
6. Sonoporación: Las fuerzas mecánicas y el microflujo generados por la cavitación crean temporalmente poros y agujeros en las membranas de las células vegetales. El material genético presente en la suspensión puede entrar en las células vegetales a través de estos poros.
7. Incubación: Tras el tratamiento de sonoporación, incube las células vegetales para permitir que se recuperen y estabilicen sus membranas. Este es un paso crucial para garantizar la supervivencia de las células y el éxito de la transferencia genética.

Transferencia de genes mediante Agrobacterium o liposomas

Existen dos formas habituales de transfectar células vegetales. Utilizan agrobacterias, un género de bacterias Gram negativas, o liposomas como portadores del material genético.

• Sonoporación mediada por Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens es una bacteria utilizada habitualmente en la ingeniería genética de plantas. En este método, el ADN plasmídico que contiene el gen deseado se introduce en Agrobacterium, que a continuación se mezcla con células vegetales. La suspensión celular se somete a sonoporación utilizando un sonicador tipo sonda. La energía ultrasónica favorece la transferencia del material genético de Agrobacterium a las células vegetales. Este método se utiliza ampliamente para la modificación genética de las plantas.
• Sonoporación mediada por liposomas: Los liposomas son vesículas a base de lípidos que pueden transportar material genético. En este método, los liposomas cargados con ADN plasmídico u otros ácidos nucleicos se mezclan con células vegetales. Para facilitar la absorción de los liposomas por las células vegetales se emplea la sonoporación con un sonicador tipo sonda. Los ultrasonidos rompen las bicapas lipídicas de los liposomas y liberan el material genético en las células vegetales. Este método es útil para estudios de expresión génica transitoria en células vegetales.

Ventajas científicamente probadas de la transformación asistida por agrobacterias mediante sonicación (SAAT)

La transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) se ha aplicado a numerosas especies vegetales. Un tratamiento ultrasónico breve y relativamente suave de los cultivos de células vegetales provoca la sonoporación, que posteriormente permite una penetración profunda de Agrobacterium como transportador de genes. A continuación puede leer estudios ejemplares que demuestran los efectos beneficiosos de la SAAT.

Transformación de Ashwagandha asistida por ultrasonidos

Para mejorar la eficiencia de transformación en W. somnifera (conocida como ashwagandha o cereza de invierno), Dehdashti y sus colegas (2016) investigaron el uso de acetosiringona (AS) y sonicación.
Se añadió acetosiringona (AS) en tres etapas: Cultivo líquido de Agrobacterium, infección de Agrobacterium y co-cultivo de explantes con Agrobacterium. La adición de 75 μM de AS al cultivo líquido de Agrobacterium resultó óptima para la inducción de genes vir.
La aplicación adicional de sonicación (SAAT) dio lugar a la mayor expresión génica. Se observó que la expresión del gen gusA en raíces pilosas era mejor cuando las hojas y las puntas de los brotes se sonicaban durante 10 y 20 segundos, respectivamente. La eficiencia de transformación del protocolo mejorado se registró en 66,5 y 59,5% en el caso de los explantes de hojas y puntas de brotes, respectivamente. En comparación con otros protocolos, la eficacia de transformación de este protocolo mejorado fue 2,5 veces superior en el caso de las hojas y 3,7 veces superior en el caso de las puntas de los brotes. Los análisis de Southern blot confirmaron 1-2 copias del transgén gusA en las líneas W1-W4, mientras que se detectaron 1-4 copias del transgén en la línea W5 generada por el protocolo mejorado.

Efecto de la duración de la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) sobre la frecuencia de transformación de explantes de hojas (a) y puntas de brotes (b) de W. somnifera.
(estudio y gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformación del algodón asistida por ultrasonidos

Hussain et al. (2007) demuestran los efectos beneficiosos de la transformación del algodón asistida por sonicación. La cavitación acústica causada por ultrasonidos de baja frecuencia crea microheridas en y bajo la superficie del tejido vegetal (sonoporación) y permite que Agrobacterium se desplace más profunda y completamente por el tejido vegetal. Esta forma de herir aumenta la probabilidad de infectar las células vegetales que se encuentran a mayor profundidad en el tejido. Para evaluar la eficacia de transformación de SAAT, se midió la expresión del gen GUS. El sistema reportero GUS es un sistema de genes reporteros, particularmente útil en biología molecular de plantas y microbiología. Ajustando varios parámetros de SAAT, la expresión transitoria de GUS en algodón utilizando embriones maduros como explante aumentó significativamente. GUS se detectó por primera vez 24 horas después de la incubación de los explantes y, a las 48 horas, la expresión de GUS era muy intensa, lo que sirvió como indicador útil del éxito de la transformación del explante de algodón tras la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT). La comparación de varias técnicas de transformación (a saber, biolística, Agro, BAAT, SAAT), la transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) mostró con mucho los mejores resultados de transformación.

Elección del procedimiento de transformación en función de la expresión transitoria de GUS. La transformación mediada por Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT) muestra una expresión transitoria significativamente mayor.
(estudio y gráfico: © Hussain et al., 2007)

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