Παρασκευή νιοσωμάτων με υπερήχους

Τα νιοσώματα είναι κυστίδια νανομετρικού μεγέθους, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς φαρμάκων (π.χ. αντικαρκινικών φαρμάκων) και άλλων βιοδραστικών ουσιών. Η γαλακτωματοποίηση με υπερήχους είναι μια απλή και ταχεία μέθοδος για την παρασκευή μικρών νιοσωμάτων με υψηλό φορτίο φαρμάκου.

Νιοσωμικά κυστίδια ως νανοφορείς δραστικών συστατικών

Ένα νιόσωμα είναι ένα κυστίδιο με βάση μη ιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες, το οποίο σχηματίζεται κυρίως από μια μη ιονική επιφανειοδραστική ουσία και την ενσωμάτωση χοληστερόλης ως εκδόχου. Τα νιοσώματα είναι πιο σταθερά έναντι της χημικής αποδόμησης ή της οξείδωσης και έχουν μεγάλο χρόνο αποθήκευσης σε σύγκριση με τα λιποσώματα. Χάρη στις επιφανειοδραστικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή τους, είναι βιοαποικοδομήσιμα, βιοσυμβατά και μη ανοσογόνα. Τα νιοσώματα είναι οσμωτικά ενεργά, χημικά σταθερά και προσφέρουν μεγαλύτερο χρόνο αποθήκευσης σε σύγκριση με τα λιποσώματα. Ανάλογα με το μέγεθος και τον αριθμό των πεταλίων, διατίθενται διάφορες μέθοδοι παρασκευής, όπως η κατεργασία με υπερήχους, η εξάτμιση αντίστροφης φάσης, η ενυδάτωση λεπτού υμενίου ή η διαδικασία πρόσληψης φαρμάκου μέσω διαμεμβρανικής βαθμίδωσης pH. Η παρασκευή νιοσωμάτων με υπερήχους είναι η προτιμώμενη τεχνική για την παραγωγή μονοπεταλιακών κυστιδίων, τα οποία είναι μικρά και ομοιόμορφα ως προς το μέγεθος.

Παρασκευή νιοσωμάτων με υπερήχους

Για την παρασκευή νιοσωμάτων, πρέπει να παρασκευαστεί ένα γαλάκτωμα ελαίου σε νερό (o/w) από ένα οργανικό διάλυμα επιφανειοδραστικής ουσίας και χοληστερόλης και ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει τη βιοδραστική ένωση, δηλαδή το φάρμακο. Η γαλακτωματοποίηση με υπερήχους είναι η ανώτερη τεχνική για την ανάμειξη μη αναμείξιμων υγρών, όπως το έλαιο και το νερό. Με την εφαρμογή διάτμησης στα σταγονίδια και των δύο φάσεων και τη διάσπασή τους σε νανομετρικό μέγεθος, λαμβάνεται ένα νανογαλάκτωμα. Στη συνέχεια, ο οργανικός διαλύτης εξατμίζεται, με αποτέλεσμα να σχηματίζονται νιοσώματα φορτωμένα με θεραπευτικούς παράγοντες, τα οποία είναι διεσπαρμένα στην υδατική φάση. Σε σύγκριση με τη μηχανική ανάδευση, η τεχνική παρασκευής νιοσωμάτων με υπερήχους υπερέχει, καθώς σχηματίζει νιοσώματα με μικρότερη μέση διάσταση και χαμηλότερο δείκτη πολυδιασποράς μέσω μιας ταχείας διαδικασίας. Η χρήση μικρότερων κυστιδίων είναι γενικά προτιμότερη, δεδομένου ότι τείνουν να αποφεύγουν τους μηχανισμούς κάθαρσης του οργανισμού καλύτερα από τα μεγαλύτερα σωματίδια και παραμένουν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στην κυκλοφορία του αίματος. (πρβλ. Bragagni et al. 2014)
Διαβάστε περισσότερα για την κατεργασία με υπερήχους για βελτιωμένα νιοσωμικά σκευάσματα!

Πρωτόκολλα παρασκευής νιοσωμάτων με υπερήχους

Η παρασκευή νιοσωμάτων με κατεργασία με υπερήχους έχει ερευνηθεί εκτενώς, με αποτέλεσμα να διατίθενται πολυάριθμα επιστημονικά επικυρωμένα πρωτόκολλα για την παραγωγή νιοσωμάτων με υπερήχους.
Παρακάτω, μπορείτε να βρείτε μια σύντομη επισκόπηση ορισμένων πρωτοκόλλων παρασκευής και φόρτωσης νιοσωμάτων με κατεργασία με υπερήχους.

Νιοσώματα φορτωμένα με εκχυλίσματα Withania somnifera
Οι Chinembiri et al. (2017) ενσωμάτωσαν ακατέργαστο εκχύλισμα Withania somnifera σε νιοσώματα που προορίζονταν για τοπική εφαρμογή. Οι βιοδραστικές ενώσεις ενθυλακώθηκαν με έγχυση διαλύτη. Για τον σκοπό αυτό, η οργανική και η υδατική φάση υποβάλλονταν σε συνεχή μαγνητική ανάδευση και η θερμοκρασία διατηρούνταν στους 60°C ± 2°C έως ότου απομακρυνθεί ο οργανικός διαλύτης. Το σκεύασμα που προέκυψε ψύχθηκε και υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους επί πάγου με τη συσκευή υπερήχων Hielscher UP200ST. Τα νιοσώματα είχαν μέσο μέγεθος περίπου 165,9 ± 9,4 και παρουσίασαν υψηλή απόδοση εγκλωβισμού (EE%) της βιθανολίδης A.

Νιοσώματα φορτωμένα με δοξορουβικίνη
Νιοσώματα N-παλμιτοϋλογλυκοζαμίνης (Glu) φορτωμένα με δοξορουβικίνη, ένα αντικαρκινικό φάρμακο, παρασκευάστηκαν με ανακίνηση ενός μείγματος NPG (16 mg), Span 60 (65 mg), χοληστερόλης (58 mg) και Solulan C24 (54 mg) σε διάλυμα δοξορουβικίνης (1,5 mg/ml, 2 ml, παρασκευασμένο σε PBS) στους 90°C για 1 h, και ακολούθησε κατεργασία με υπερήχους με ανιχνευτή για 10 min (75% του μέγιστου).
Κυστίδια παλμιτοϋλιωμένης γλυκολικής χιτοζάνης (GCP) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (11), με κατεργασία γλυκολικής χιτοζάνης (10 mg) και χοληστερόλης (4 mg) με υπερήχους με ανιχνευτή σε διάλυμα δοξορουβικίνης (1,5 mg/ml). (Dufes et al. 2004)

Εναλλακτικές μέθοδοι παρασκευής νιοσωμάτων

Οι εναλλακτικές μέθοδοι παρασκευής νιοσωμάτων, όπως η τεχνική εξάτμισης αντίστροφης φάσης ή η διαδικασία πρόσληψης φαρμάκου μέσω διαμεμβρανικής βαθμίδωσης pH, περιλαμβάνουν την εφαρμογή ενέργειας υπερήχων. Και οι δύο τεχνικές χρησιμοποιούνται κυρίως για την παρασκευή πολυστρωματικών κυστιδίων (MLVs). Παρακάτω θα βρείτε μια σύντομη περιγραφή και των δύο τεχνικών, καθώς και του σταδίου κατεργασίας με υπερήχους που περιλαμβάνουν.

Κατεργασία με υπερήχους κατά την παρασκευή νιοσωμάτων μέσω εξάτμισης αντίστροφης φάσης

Στη μέθοδο εξάτμισης αντίστροφης φάσης (REV), τα συστατικά του νιοσωματικού σκευάσματος διαλύονται σε μείγμα αιθέρα και χλωροφορμίου και προστίθενται στην υδατική φάση, η οποία περιέχει το φάρμακο. Η γαλακτωματοποίηση με υπερήχους χρησιμοποιείται για τη μετατροπή του μείγματος σε γαλάκτωμα με λεπτά σταγονίδια. Στη συνέχεια, η οργανική φάση εξατμίζεται. Τα νιοσώματα που λαμβάνονται κατά την εξάτμιση του οργανικού διαλύτη είναι μονοστρωματικά κυστίδια μεγάλου μεγέθους.

Διαδικασία πρόσληψης φαρμάκου μέσω διαμεμβρανικής βαθμίδωσης pH

Για τη διαδικασία πρόσληψης φαρμάκου μέσω διαμεμβρανικής βαθμίδωσης pH (με όξινο εσωτερικό) (με εξ αποστάσεως φόρτωση), η επιφανειοδραστική ουσία και η χοληστερόλη διαλύονται σε χλωροφόρμιο. Στη συνέχεια, ο διαλύτης εξατμίζεται υπό κενό ώστε να σχηματιστεί ένα λεπτό υμένιο στο τοίχωμα της σφαιρικής φιάλης. Το υμένιο ενυδατώνεται με κιτρικό οξύ 300 mM (pH 4,0) με στροβιλιστική ανάδευση του εναιωρήματος. Τα πολυστρωματικά κυστίδια καταψύχονται και αποψύχονται τρεις φορές και στη συνέχεια υποβάλλονται σε κατεργασία με υπερήχους με συσκευή υπερήχων τύπου καθετήρα. Σε αυτό το εναιώρημα νιοσωμάτων προστίθεται υδατικό διάλυμα που περιέχει 10 mg/ml φαρμάκου και ακολουθεί στροβιλιστική ανάδευση. Στη συνέχεια, το pH του δείγματος αυξάνεται σε pH 7,0–7,2 με φωσφορικό δινάτριο 1M. Έπειτα, το μείγμα θερμαίνεται στους 60°C για 10 λεπτά. Αυτή η τεχνική αποδίδει πολυστρωματικά κυστίδια. (πρβλ. Kazi et al. 2010)

Μείωση του μεγέθους των νιοσωμάτων με υπερήχους

Τα νιοσώματα έχουν συνήθως μέγεθος από 10nm έως 1000nm. Ανάλογα με την τεχνική παρασκευής, τα νιοσώματα είναι συχνά σχετικά μεγάλα και τείνουν να σχηματίζουν συσσωματώματα. Ωστόσο, τα συγκεκριμένα μεγέθη των νιοσωμάτων αποτελούν σημαντικό παράγοντα για τον επιδιωκόμενο τύπο συστήματος χορήγησης. Για παράδειγμα, το πολύ μικρό μέγεθος νιοσωμάτων, στην κλίμακα των νανομέτρων, είναι το πλέον κατάλληλο για τη συστηματική χορήγηση φαρμάκων, όπου το φάρμακο πρέπει να διαπεράσει τις κυτταρικές μεμβράνες για να φτάσει στην κυτταρική θέση-στόχο, ενώ τα μεγαλύτερα νιοσώματα συνιστώνται για ενδομυϊκή και ενδοκοιλοτική χορήγηση φαρμάκων ή για οφθαλμικές εφαρμογές. Η μείωση του μεγέθους των νιοσωμάτων με υπερήχους αποτελεί συνηθισμένο στάδιο κατά την παρασκευή νιοσωμάτων υψηλής δραστικότητας. Οι δυνάμεις διάτμησης που δημιουργούνται από τους υπερήχους αποσυσσωματώνουν και διασπείρουν τα νιοσώματα σε μονοδιασπαρμένα νανο-νιοσώματα.

Πρωτόκολλο – Μείωση του μεγέθους των LipoNiosomes με υπερήχους

Οι Naderinezhad et al. (2017) παρασκεύασαν βιοσυμβατά LipoNiosomes (συνδυασμό νιοσώματος και λιποσώματος) που περιείχαν Tween 60: χοληστερόλη: DPPC (σε αναλογία 55 : 30 : 15 : 3) με 3% DSPE-mPEG. Για να μειώσουν το μέγεθος των παρασκευασμένων LipoNiosomes, μετά την ενυδάτωση υπέβαλαν το εναιώρημα σε κατεργασία με υπερήχους για 45 min (15 δευτερόλεπτα λειτουργίας και 10 δευτερόλεπτα παύσης, πλάτος 70% στα 100 watts), ώστε να ελαχιστοποιήσουν τη συσσωμάτωση των σωματιδίων, χρησιμοποιώντας τον ομογενοποιητή υπερήχων UP200St (Hielscher Ultrasonics GmbH, Γερμανία). Για τη μέθοδο βαθμίδωσης pH, τα αποξηραμένα υμένια CUR, επιφανειοδραστικών ουσιών και λιπιδίων ενυδατώθηκαν με 1300 mL θειικού αμμωνίου (pH 1⁄4 4) στους 63 C για 47 min. Στη συνέχεια, τα νανοσωματίδια υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους πάνω από λουτρό πάγου για την παραγωγή μικρών κυστιδίων.

Συσκευές υπερήχων για την παρασκευή νιοσωμάτων

Η Hielscher Ultrasonic διαθέτει μακρόχρονη εμπειρία στον σχεδιασμό, την κατασκευή, τη διανομή και την τεχνική υποστήριξη ομογενοποιητών υπερήχων υψηλής απόδοσης για τη φαρμακευτική βιομηχανία, τη βιομηχανία τροφίμων και τη βιομηχανία καλλυντικών.
Η παρασκευή νιοσωμάτων υψηλής ποιότητας, λιποσωμάτων, στερεών λιπιδικών νανοσωματιδίων, πολυμερικών νανοσωματιδίων, συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης και άλλων νανοδομημένων φορέων φαρμάκων αποτελεί διεργασία στην οποία οι συσκευές υπερήχων της Hielscher διακρίνονται χάρη στην υψηλή αξιοπιστία τους, τη σταθερή ισχύ εξόδου και τη δυνατότητα ακριβούς ελέγχου. Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο όλων των παραμέτρων της διεργασίας, όπως το πλάτος ταλάντωσης, η θερμοκρασία, η πίεση και η ενέργεια κατεργασίας με υπερήχους. Το έξυπνο λογισμικό καταγράφει αυτόματα όλες τις παραμέτρους κατεργασίας με υπερήχους (χρόνος, ημερομηνία, πλάτος ταλάντωσης, καθαρή ενέργεια, συνολική ενέργεια, θερμοκρασία, πίεση) στην ενσωματωμένη κάρτα SD.
Η ανθεκτικότητα των συσκευών υπερήχων της Hielscher επιτρέπει τη λειτουργία 24/7 υπό υψηλό φόρτο και σε απαιτητικά περιβάλλοντα.
Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων μας: